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        大鼠表皮干細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法研究

        2015-01-27 08:58:13馮穎
        吉林農(nóng)業(yè)·下半月 2014年9期
        關(guān)鍵詞:細(xì)胞培養(yǎng)

        摘要:目的是探討大鼠表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的方法。方法主要以0 ~7日齡SD大鼠為材料,采用中性蛋白酶和胰蛋白酶分離表皮細(xì)胞,IV型膠原黏附法對(duì)分離的表皮干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),觀察其形態(tài)、生長(zhǎng)情況。結(jié)果是培養(yǎng)后的表皮干細(xì)胞胞質(zhì)近中央處有圓形核并開(kāi)始形成小克隆,細(xì)胞即連接成片,緊密相靠,相互銜接,呈鋪路石狀。結(jié)論為該方法分離培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞純合,呈現(xiàn)典型的上皮型細(xì)胞形態(tài),可用于皮膚的再生修復(fù)。

        關(guān)鍵詞:表皮干細(xì)胞;細(xì)胞分離;細(xì)胞培養(yǎng)

        中圖分類(lèi)號(hào): Q593. 2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A 文章編號(hào): 1674-0432(2014)-18-17-1

        表皮干細(xì)胞也可稱(chēng)角質(zhì)干細(xì)胞,不同部位的表皮干細(xì)胞分布存在差異,其主要分布于表皮基底層和毛囊外根鞘隆凸部及皮脂腺邊緣[1]。表皮干細(xì)胞在維持皮膚的自我更新、創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚腫瘤的發(fā)生等方面扮演著重要的角色,因此成功地分離、培養(yǎng)表皮干細(xì)胞對(duì)臨床上創(chuàng)傷修復(fù)、皮膚癌的研究起著至關(guān)重要的作用[2]。

        1 材料與方法

        1.1 材料、試劑及用具

        1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 0~7日齡SD大鼠。

        1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 中性蛋白酶,胰蛋白酶-EDTA消化液,IV型膠原,DMEM培養(yǎng)液,D-Hanks,KSFM培養(yǎng)液,凍存液,75%酒精。

        1.1.3實(shí)驗(yàn)用具 剪刀、鑷子、尼龍紗網(wǎng)、手術(shù)刀、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、凍存管、水浴鍋、CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái),電子顯微鏡,離心機(jī)等。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1表皮細(xì)胞的分離 取0 ~7日齡SD大鼠,脫頸錐處死, 75%酒精清洗,剪取背部皮膚,D-Hanks清洗,將其切割為0.5×1.0厘米的皮膚組織,0.25%中性蛋白酶在4℃處理12~16小時(shí),吸棄上清液,D-Hanks清洗后分離表皮和真皮。表皮剪碎呈糜狀,以2.5克/升胰酶+0.2克/升 EDTA消化液在37℃條件下消化5~10分鐘,用含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化,吹打至懸液,100目尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,棄上清液,以培養(yǎng)液重懸制成單細(xì)胞懸液。

        1.2.2 膠原黏附法選擇表皮干細(xì)胞 將單細(xì)胞懸液以2×105 個(gè)/毫升的密度接種在鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育10~15分鐘。吸出細(xì)胞懸液,粘附在膠原被膜上的細(xì)胞則為表皮干細(xì)胞。

        1.2.3 表皮干細(xì)胞培養(yǎng) 在去除細(xì)胞懸液鋪被IV型膠原的培養(yǎng)瓶中加入無(wú)血清角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(KSFM)進(jìn)行培養(yǎng),12小時(shí)后換液以除去未貼壁的細(xì)胞,以后每2天換液一次,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 原代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞

        剛剛接種的表皮干細(xì)胞,細(xì)胞均勻分散呈圓形,核大,胞體小,培養(yǎng)一周(圖1)進(jìn)入增殖期,第12天達(dá)到高峰表皮干細(xì)胞漸漸伸展形成扁平的多角狀,胞質(zhì)近中央處有圓形核并開(kāi)始形成小克隆,細(xì)胞即連接成片,緊密相靠,相互銜接,呈鋪路石狀,匯合成片。

        2.2 傳代培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞

        原代細(xì)胞接種24小時(shí)后即伸展,相互聚集,粘附在膠原上,呈克隆樣生長(zhǎng),細(xì)胞聚集在集落中心周?chē)瘦椛錉钌L(zhǎng),5~6天表皮干細(xì)胞增殖能力加強(qiáng),達(dá)到融合鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶的瓶底。

        3 結(jié)語(yǔ)

        不同的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞的黏附作用不同,表皮干細(xì)胞主要通過(guò)表達(dá)整合素實(shí)現(xiàn)其對(duì)基底膜的粘附,同時(shí)也是干細(xì)胞維持其特性的基本條件。IV型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分對(duì)細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)、移行等方面起重要作用,表皮干細(xì)胞不僅對(duì)IV型膠原有較強(qiáng)的粘附性,而且在IV型膠原上能很好的生長(zhǎng),由此進(jìn)行篩選、培養(yǎng)、純化表皮干細(xì)胞,結(jié)果表明,獲得的表皮干細(xì)胞較純凈,其仍具有較強(qiáng)的分裂增殖能力,于培養(yǎng)后第二天,大量克隆細(xì)胞形成,5~6天匯合成片,可以長(zhǎng)期傳代。該方法操作簡(jiǎn)便,表皮干細(xì)胞生長(zhǎng)良好,具有較高的克隆形成率。

        無(wú)血清培養(yǎng)基及其附加的營(yíng)養(yǎng)成分在細(xì)胞生長(zhǎng)與培養(yǎng)液之間提供了較好的平衡體系,有利于表皮干細(xì)胞的增殖及其表型的維持,由于培養(yǎng)基中不含血清,沒(méi)有血清中的各種復(fù)雜和不明的成分,排除血清中許多未知因素對(duì)干細(xì)胞分化的影響,是目前培養(yǎng)表皮干細(xì)胞被認(rèn)可的方法[3]。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 孫曉燕,付小兵,孫同柱.表皮干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定,中華實(shí)驗(yàn)外科雜志[J],2007,24(2):163-164.

        [2] 王海燕.肺出血·腎炎綜合征抗基底膜抗體型.北京人民衛(wèi)生出版社[M],1998:912-922.

        [3] 劉德伍,陳國(guó)安,曹勇,等.人表皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J],1997,13(6):419-420.

        作者簡(jiǎn)介:馮穎,碩士學(xué)歷,通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,講師,研究方向:生物技術(shù)。

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