李榮勝 張玉杰 林超穎 潘一峰

摘 要 目的：建立松花粉中柚皮素HPLC法測(cè)定方法，提高松花粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定柚皮素含量，以甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm測(cè)定柚皮素的含量。結(jié)果：柚皮素質(zhì)量濃度在10.0～216.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=1.000 0），平均回收率99.26% ，RSD為1.04%（n=9）。運(yùn)用該方法測(cè)得12批次不同產(chǎn)地的松花粉中柚皮素含量在0.13%～0.27%之間。結(jié)論：建立的HPLC分析方法操作簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為該松花粉的質(zhì)量控制方法。

關(guān)鍵詞 松花粉 柚皮素 高效液相色譜

中圖分類號(hào)：R282.71； O657.72 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2021）09-0064-03

*基金項(xiàng)目：國(guó)家科技重大專項(xiàng)（民口）課題重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)“扶正化瘀片抗肝纖維化的CMC及美國(guó)Ⅲ期臨床試驗(yàn)”（2018ZX09737010）

Study on an HPLC method for the determination of naringenin content in pini pollen*

LI Rongsheng**， ZHANG Yujie， LIN Chaoying， PAN Yifeng***

（Shanghai Huanghai Pharmaceutical Co.， LTD.， Shanghai 200942， China）

ABSTRACT Objective： To establish an HPLC method for the determination of pini pollen naringenin to improve its quality standard. Methods： The content of naringenin was determined by high performance liquid chromatography （HPLC） at 288 nm using methanol-0.05% phosphoric acid solution （45：55） as mobile phase. Results： The standard curve of naringenin showed good linearity in the range of 10.0-216.0 μg/ml （r=1.000 0）. The average recovery was 99.26% with RSD 1.04% （n=9）. The contents of naringenin in 12 batches of pini pollen from different origins were in the range of 0.13%-0.27%. Conclusion： The established HPLC method is simple， rapid， specific and reproducible， and can be used for quality control of pini pollen.

KEy WORDS pini pollen； naringenin； HPLC

松花粉為松科植物馬尾松（Pinus massoniana Lamb.）、油松（Pinus tabulieformis Carr.）或同屬數(shù)種植物的干燥花粉，別名松黃、松花，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用藥材之一，具有收斂止血，燥濕斂瘡的功效，可用于外傷出血、皮膚糜爛、濕疹、黃水瘡等癥[1-2]。松花粉是扶正化瘀片/膠囊（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20020047/Z20050573）六味原藥材之一，同時(shí)也是松花粉靈芝片、松花粉蒲公英顆粒等保健品的原材料之一。松花粉通常于春季花剛開時(shí)進(jìn)行采摘，花穗曬干，收集花粉，除去雜質(zhì)即得。干燥的松花粉呈光滑橢圓狀，淡黃色，體質(zhì)輕，易飛揚(yáng)，手感滑潤(rùn)，不沉于水，氣微香，味有油膩感，其營(yíng)養(yǎng)豐富，含多種維生素類、多糖類、黃酮類、核酸類、脂肪酸類、氨基酸類，膳食纖維類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有“花粉之王”之美稱[3]。

松花粉于1985年就已被《中華人民共和國(guó)藥典》收載，而《中華人民共和國(guó)藥典》2015版和2020版中只有性狀、顯微鑒別、水分、總灰分作為質(zhì)量控制?！渡虾Ｊ兄兴庯嬈谥埔?guī)范》現(xiàn)行版等各省、地方標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)松花粉進(jìn)行薄層鑒別和HPLC含量控制[4]。因此有必要建立松花粉含量測(cè)定方法，用以控制松花粉質(zhì)量。研究表明，黃酮類屬于松花粉的主要活性成分，總黃酮含量高達(dá)1.60%～2.95%[5-8]。松花粉中二氫黃酮類化合物柚皮素（C15H12O5）具有降血脂、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗纖維化等多種藥理活性[9-11]，具有良好的藥用價(jià)值。因此，本文建立了松花粉中柚皮素成分的含量測(cè)定方法[12]，并對(duì)多個(gè)產(chǎn)地松花粉柚皮素進(jìn)行了含量測(cè)定，探究松花粉不同產(chǎn)地柚皮素含量規(guī)律，為扶正化瘀片/膠囊、其它含松花粉保健品提供研究數(shù)據(jù)，同時(shí)填補(bǔ)《中華人民共和國(guó)藥典》中松花粉含量測(cè)定的空缺。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

松花粉樣品由上海黃海制藥有限責(zé)任公司提供。柚皮素對(duì)照品，批號(hào)：3597，純度：98%，購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；HPLC級(jí)甲醇和96%磷酸，均購(gòu)自上海安譜科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent公司）；HWS24型電熱恒溫水浴鍋（上海-恒科技有限公司）；XP-105電子天平（梅特勒-托利多公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm，上海迪科馬分析技術(shù)有限公司）。

1.3 柚皮素含量測(cè)定方法

1.3.1 色譜條件

流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為288 nm；流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 ml；理論塔板數(shù)按柚皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

1.3.2 溶液制備

1）對(duì)照品溶液的制備 取柚皮素對(duì)照品適量，精密稱取，置容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含有80 μg的溶液。

2）供試品溶液的制備 取本品約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 ml，密塞，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用。

3）空白溶液制備 以70%乙醇按“供試品溶液”制備方法制備。

1.4 系統(tǒng)適用性考察

1.4.1 專屬性

測(cè)定空白溶液，結(jié)果應(yīng)柚皮素對(duì)照品溶液與空白溶液相同保留時(shí)間處無對(duì)應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)。

1.4.2 線性關(guān)系

將柚皮素對(duì)照品逐級(jí)稀釋成9.3、15.6、25.9、43.2、72.0、120.0、216.0 μg/ml 7個(gè)不同等級(jí)的質(zhì)量濃度，分別測(cè)定峰面積，以柚皮素為橫坐標(biāo)，柚皮素峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.4.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取柚皮素對(duì)照品10 ml，連續(xù)進(jìn)樣5針，計(jì)算柚皮素峰面積RSD，考察儀器精密度。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：DYC200311），在室溫放置0、2、4、8、12、24、48 h時(shí)取樣測(cè)定，計(jì)算柚皮素含量，其RSD≤2%。

1.4.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)供試品（批號(hào)：DYC200311）平行制備6份，進(jìn)行柚皮素含量測(cè)定，計(jì)算RSD≤2%。

1.4.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密取同一批樣品（批號(hào)：DYC200311）9份，分別精密加入低、中、高3個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，測(cè)定原液與加標(biāo)供試液，計(jì)算回收率和RSD值。

1.4.7 檢測(cè)限和定量限

將對(duì)照品逐級(jí)稀釋，分別按信噪比（S/N）等于10（定量限）和3（檢測(cè)限）計(jì)算確定，檢測(cè)相應(yīng)的檢測(cè)限和定量限。

2 結(jié)果

2.1 專屬性

供試品和柚皮素對(duì)照品的HPLC保留時(shí)間相同，柚皮素與其他成分的色譜峰分離度良好，柚皮素對(duì)照品溶液與空白溶液相同保留時(shí)間處無對(duì)應(yīng)的色譜峰出現(xiàn)（圖1）。

2.2 精密度試驗(yàn)

柚皮素對(duì)照品溶液峰面積分別為：39.81、39.88、40.34、40.01、39.77，平均峰面積為：39.96，RSD為0.58%（≤2%），說明儀器精密度良好。

2.3 線性關(guān)系的考察

計(jì)算得回歸方程為Y=0.590 1x+0.847 3，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0，表明柚皮素質(zhì)量濃度在10.0～216.0 mg/ml范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好，RSD為0.52%（≤2%）（表1）。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在室溫放置不同時(shí)間時(shí)測(cè)定的柚皮素含量分別為：0.22%、0.21%、0.22%、0.21%、0.21%、0.21%、0.22%，RSD為0.31%（≤2%）。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

柚皮素回收率在90%～108%范圍內(nèi)，平均回收率99.26%，RSD為1.04%。符合《中國(guó)藥典》2015年版四部指導(dǎo)原則9101的要求（表2）。

2.7 定量限和檢測(cè)限

對(duì)照品質(zhì)量溶度為0.77 mg/ml（S/N=52）及1.29 mg/ml（S/N=84）時(shí)，檢測(cè)均無干擾，因此確定檢測(cè)限質(zhì)量濃度為0.77 mg/ml、定量限質(zhì)量濃度為1.29 mg/ml。

2.8 不同產(chǎn)地松花粉中柚皮素的含量測(cè)定

分別取不同產(chǎn)地藥材12批次進(jìn)行含量測(cè)定，柚皮素色譜峰的峰形對(duì)稱尖銳、分離度良好（表3）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)前期進(jìn)行了松花粉破壁（室溫、冷凍）處理、去脂（乙醚、石油醚）、提取溶劑（不同濃度的乙醇、甲醇）、提取方法（回流、超聲）、提取時(shí)間、提取溫度以及料液比等因素的考察。結(jié)果顯示，藥材粉碎方式對(duì)結(jié)果影響不大；未去脂條件下柚皮素含量較高；70%乙醇回流2 h提取為最佳提取方式。參考徐鵬程[13]對(duì)沙田柚幼果中柚皮素的含量測(cè)定研究，選擇甲醇-水和甲醇-磷酸水溶液等體系考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入0.05%磷酸時(shí)，效果較佳、基線平穩(wěn)、峰形尖銳、分析采集時(shí)間適宜，故選擇甲醇-0.05%磷酸溶液（45∶55）體系作為流動(dòng)相。

從含量測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)分析，柚皮素普遍存在于不同產(chǎn)地、不同松樹品種的松花粉中，且含量穩(wěn)定，可作為松花粉質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

綜上所述，本研究建立的松花粉柚皮素HPLC含量測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)。柚皮素在松花粉中含量穩(wěn)定且高，故可作為松花粉藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分，對(duì)松花粉的研究具有重要意義，有助于藥材后續(xù)研究和扶正化瘀片/膠囊及其他保健品的質(zhì)量控制。

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