唐曉飛，鐘夢菊，沈海娟

本研究觀察了柚皮素脂質體對非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)大鼠脂質代謝和肝組織病理學變化的影響，以期為NAFLD的治療提供幫助，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器、藥品與試劑 SPF級雄性SD大鼠50只，購自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司【動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0019】，晝夜交替周期為12 h，給予充足水和普通飼料，適應性飼養(yǎng)1 w。全自動生化分析儀(日本日立公司)、紫外分光光度計(上海光學儀器五廠有限公司)、酶標儀(上海閃譜生物科技有限公司)、電泳儀(武漢純度生物科技有限公司)。柚皮素及相應的柚皮素脂質體由上海機純實業(yè)有限公司提供。檢測試劑盒均購自上海閃譜生物科技有限公司。Nrf2 mRNA和β-actin均購自瑞士Roche公司，Nrf2 mRNA：正向TGAAGCTCAGCTCGCATTGA，反向TGCTCCAGCTCGACAATGTT；β-acton：正向TGAGCTGCGTTTTACACCCT，反向GCCTTCACCGTTCCAGTTTT。

1.2 模型構建 隨機將大鼠分為5組，即對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組。除對照組大鼠不予特殊處理外，其余4組大鼠均采用高糖高脂飼料飼養(yǎng)12 w。在柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組，分別給予柚皮素30 mg·kg-1.d-1、柚皮素脂質體20 mg·kg-1.d-1和柚皮素脂質體30 mg·kg-1.d-1腹腔注射；給予模型組大鼠等量生理鹽水腹腔注射。在12 w末，處死大鼠，取肝組織稱質量及行病理學檢查。

1.3 指標檢測 使用全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法檢測血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平；采用Western blot法檢測肝組織Nrf2蛋白表達，并采用RT-PCR法檢測肝組織Nrf2 mRNA水平。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量和肝質量比較 在12 w末，柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量和肝質量均顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量和肝質量均顯著低于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，表1)。

表1 各組大鼠體質量和肝質量比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.2 各組肝組織學變化 對照組大鼠肝細胞排列緊密，細胞內未見脂肪顆粒；模型組大鼠肝細胞大小不一，有大量脂肪顆粒沉積，且伴有炎性細胞浸潤；柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組大鼠肝細胞脂肪顆粒較小，存在較輕的炎性細胞浸潤；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝細胞排列緊密，細胞大小均一，與對照組大鼠肝組織學表現(xiàn)相近(圖1)。

2.3 各組血生化指標比較 柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清TC、TG、ALT和AST水平均顯著低于柚皮素組(P<0.05，表2)。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現(xiàn) (HE，400×)

例數(shù)TC(mmol/L)TG(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)對照組100.8±0.11.8±0.240.0±6.3133.4±8.4模型組101.2±0.2①2.6±0.2①69.8±5.3①229.6±18.2①柚皮素組101.0±0.1①②2.2±0.1①②52.6±5.2①②156.8±11.2①②柚皮素脂質體Ⅰ組100.9±0.1①②2.1±0.2①②③51.5±4.8①②149.4±9.9①②柚皮素脂質體Ⅱ組100.8±0.1②③1.9±0.1②③④45.4±4.3①②③④143.6±6.5②③

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.4 各組血清SOD、CAT和MDA水平比較 柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)；柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平顯著高于，而MDA水平顯著低于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，表3)。

表3 各組大鼠血清SOD、CAT和MDA水平比較

與對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05；與柚皮素組比，③P<0.05；與柚皮素脂質體Ⅰ組比，④P<0.05

2.5 各組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達情況比較 對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達水平分別為(1.4±0.3)、(0.4±0.1)、(0.8±0.1)、(0.8±0.2)和(1.3±0.2)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白水平均顯著高于模型組(P<0.05)，柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2蛋白水平顯著高于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達情況

2.6 各組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平變化比較 對照組、模型組、柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平分別為(1.0±0.1)、(0.4±0.1)、(0.7±0.1)、(0.7±0.1)和(0.9±0.1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平均顯著高于模型組(P<0.05)，柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平顯著高于柚皮素組和柚皮素脂質體Ⅰ組(P<0.05)。

3 討論

隨著人們生活水平的改善、不良飲食習慣的盛行及生活節(jié)奏的加快，我國NAFLD的發(fā)病率逐年攀升，且有向年輕化趨勢發(fā)展，嚴重影響著人們的健康[1-4]。目前，關于NAFLD的預防、治療和發(fā)病機制的研究已成為近年來研究的熱點[5-7]。但至今，有關NAFLD的發(fā)病機制仍未完全闡明[8-10]。多數(shù)學者認同“二次打擊”學說，認為肝細胞內脂肪顆粒堆積，超出肝臟清除脂肪的能力時，肝臟細胞會發(fā)生氧化應激反應，進而出現(xiàn)胰島素抵抗、脂質過氧化及糖脂代謝紊亂等[11-13]。本文通過探討柚皮素脂質體對NAFLD大鼠的保護作用，以期為NAFLD的治療做出新的研究。

本研究用高糖高脂飼料飼養(yǎng)大鼠，經(jīng)過12周飼養(yǎng)，檢測各組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平，結果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平均顯著高于對照組，且經(jīng)病理學檢查觀察肝組織結構，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝細胞內有大小不等的脂肪顆粒堆積，炎性細胞浸潤，以上結果均表明NAFLD大鼠模型構建成功。通過腹腔注射柚皮素和柚皮素脂質體，發(fā)現(xiàn)柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠體質量、肝質量和血清TC、TG、ALT、AST水平均較模型組大鼠大幅降低，表明柚皮素可有效調節(jié)大鼠脂質代謝，保護肝臟，且柚皮素脂質體劑型效果更好，隨著給藥劑量的增加，其效果越明顯。近年來，有研究[14-16]發(fā)現(xiàn)Nrf2與NAFLD發(fā)病密切相關，其在NAFLD發(fā)病及疾病進展過程中發(fā)揮著重要的作用。

Nrf2是亮氨酸拉鏈轉錄因子家族成員之一，在機體內普遍存在，主要負責調控組織或細胞防御氧化應激，促進SOD和CAT等抗氧化因子的生成[17-20]。本研究結果表明模型組大鼠肝組織Nrf2蛋白表達較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義。經(jīng)腹腔注射柚皮素和柚皮素脂質體后，大鼠肝組織Nrf2蛋白表達有不同程度的升高，以柚皮素脂質體Ⅱ組升高更為明顯。進一步采用RT-PCR法檢測大鼠肝臟Nrf2 mRNA水平，結果顯示模型組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平最低，而柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠肝組織Nrf2 mRNA水平均有不同程度的升高，且以柚皮素脂質體Ⅱ組升高更為明顯。通過檢測5組大鼠血清SOD、CAT和MDA水平，我們發(fā)現(xiàn)柚皮素組、柚皮素脂質體Ⅰ組和柚皮素脂質體Ⅱ組大鼠血清SOD和CAT水平均顯著高于模型組，而血清MDA水平顯著低于模型組。以上結果提示，柚皮素可能通過激活Nrf2表達，促進SOD和CAT的生成，進而抑制肝細胞氧化應激損傷，發(fā)揮了保護肝臟的作用。