沈彬，王松雪，張瑜，尚逢實，張馨月，王可心，劉素穩(wěn)，范志光，王浩*

（1.中科蘭?。ㄌ旖颍┳匀会t(yī)學(xué)研究院，天津 300308；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.河北科技師范學(xué)院食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，河北 秦皇島 066600）

世界肥胖人數(shù)持續(xù)上升，且發(fā)病人群開始低齡化，這已經(jīng)成為一個全球范圍內(nèi)的健康問題[1]。多種疾病例如心臟病、糖尿病、動脈粥樣硬化以及癌癥，都與肥胖緊密相關(guān)[2]。尋找有效的代謝酶抑制劑是治療由飲食引起的肥胖的有效方法之一，因為它能夠阻止脂肪的吸收和消化。胰脂肪酶是消化膳食脂肪的關(guān)鍵酶，抑制胰脂肪酶活性以減少膳食甘油三酯的消化和吸收已成為近期藥理學(xué)干預(yù)策略的重點[3]。一些降脂藥物，如奧利司他可以通過抑制胃腸道的胰脂肪酶來阻止甘油三酯水解為游離脂肪酸和單?；视王ィ瑥亩鴾p少膳食中甘油三酯的吸收，促使其排出體外[4]。但是持續(xù)服用會帶來諸多不良反應(yīng)，如油性糞便、腹部不適、腹瀉、直腸不適、頭痛及疲乏等，甚至造成泌尿道感染[5]。因此，從天然產(chǎn)物中篩選得到更安全有效的胰脂肪酶抑制劑，成為預(yù)防和治療肥胖的研究熱點。

柚皮素（naringenin，NAR）是一種廣泛存在于蕓香科柑橘屬植物中的天然二氫黃酮類化合物，多分布于葫蘆巴、桑黃、荸薺、胡柚皮、華中冬青等植物和柚子等柑橘類水果中[6]。柚皮素因具獨特的藥理活性受到人們的廣泛關(guān)注，它對多種疾病的治療展現(xiàn)出可觀的潛力，如降血壓、抗糖尿病和降脂等[7]。據(jù)研究報道，柚皮素可以明顯降低肥胖大鼠中的甘油三酯、膽固醇和游離脂肪酸的含量[8]。然而，柚皮素對胰脂肪酶活性的影響以及具體抑制機制還尚未報道。因此，本試驗主要從酶學(xué)動力學(xué)、熒光猝滅以及分子對接3個方面研究柚皮素對胰脂肪酶的抑制機理，為開發(fā)天然降脂產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰腺脂肪酶（400 U/mg）、月桂酸4-硝基苯酯：美國Sigma Aldrich公司；Trition X-100：北京博奧拓達(dá)科技有限公司；柚皮素（純度＞98%）、二甲基亞砜、三羥甲基氨基甲烷（Tris）：上海阿拉丁生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見光分光光度計：日本島津公司；TP-144分析天平、UB-7 pH計：美國丹佛儀器有限公司；F-7100型熒光分光光度計：日本日立公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；Legend Micro 17R離心機：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚皮素對胰脂肪酶活性的影響

柚皮素抑制胰脂肪酶活性的測定根據(jù)Qiu等[9]的方法稍加改動。胰脂肪酶溶解于0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.2）中。柚皮素溶解于含有10%二甲基亞砜的超純水中。200 μL 不同濃度的柚皮素（0、0.3、0.5、0.8、1.0、2.0、4.0 mmol/L）、200 μL 胰脂肪酶溶液和 500 μL Tris-HCl緩沖溶液混合后于37℃孵育10 min。加入600 μL月桂酸4-硝基苯酯底物（0.8 mg/mL）在37℃反應(yīng)20 min后，在沸水浴中終止反應(yīng)10 min?？瞻兹芤汉?700 μL Tris-HCl緩沖液、200 μL 胰脂肪酶溶液和600 μL月桂酸4-硝基苯酯底物。然后樣品組和空白組均12 000 r/min離心6 min，取上清液，于405 nm波長下測定吸光度。奧利司他作為陽性對照。抑制率計算公式如下。

式中：A空白為空白組吸光度；A空白對照為空白對照組吸光度；A樣品為樣品組吸光度；A樣品對照為樣品對照組吸光度。

1.3.2 柚皮素對胰脂肪酶抑制的動力學(xué)分析

根據(jù)上述抑制胰脂肪酶活性的測定方法，進(jìn)行動力學(xué)試驗?？赡嬖囼灒汗潭ǖ孜餄舛葹?.8 mg/mL，不同濃度的柚皮素（0、1.0、2.5 mmol/L 和 4.0 mmol/L）分別與 0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/mL 和 8.0 mg/mL 濃度的胰脂肪酶混合?；旌衔锖偷孜锓謩e反應(yīng)6、9、12、15、18、20、22、24 min 后 12 000 r/min離心 6 min，于 405 nm波長下測定吸光度。動力學(xué)試驗：固定胰脂肪酶濃度為5 mg/mL，胰脂肪酶和不同濃度的柚皮素（0、1.0、2.5 mmol/L和4.0 mmol/L）混合。上述混合物與0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 和 1.2 mg/mL 濃度的底物分別反應(yīng) 6、9、12、15、18、20、22、24 min 后 12 000 r/min離心6 min，于405 nm波長下測定吸光度。通過雙倒數(shù)作圖，判斷柚皮素抑制胰脂肪酶的抑制類型并求出酶抑制動力學(xué)常數(shù)。競爭性抑制分析方程式如下。

式中：V為酶反應(yīng)速率，△吸光度/min；Vmax為最大酶反應(yīng)速率，△ 吸光度/min；[S]為底物濃度，mg/mL；[I]為柚皮素濃度，mmol/L；Km為米氏常數(shù)；Ki為與游離酶的抑制常數(shù)。

1.3.3 熒光光譜分析

為判斷柚皮素是否對胰脂肪酶的三級結(jié)構(gòu)有影響，使用F-7100型熒光分光光度計掃描不同濃度柚皮素下胰脂肪酶熒光光譜，試驗參考Du等[10]的方法并稍加修改。將0.2 mL不同濃度的柚皮素溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mol/L 和 0.8 mol/L）與 2.8 mL、10 mg/mL胰脂肪酶溶液混合。孵育5min后測定熒光強度。設(shè)置發(fā)射波長為300 nm～500 nm，激發(fā)波長280 nm，發(fā)射和激發(fā)的狹縫寬度固定在5 nm。

為進(jìn)一步判斷熒光猝滅的猝滅類型是靜態(tài)猝滅還是動態(tài)猝滅，使用Stern-Volmer方程計算出Kq值[11]，公式如下所示。

式中：F0和F分別為不存在和存在柚皮素時胰脂肪酶的熒光強度；Kq為猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；[Q]為柚皮素濃度，mol/L；τ0為無猝滅劑的熒光團熒光壽命，約為10-8s。

由于柚皮素和胰脂肪酶是靜態(tài)猝滅，通過雙對數(shù)回歸圖計算出柚皮素和胰脂肪酶復(fù)合物之間的結(jié)合位點數(shù)[12]。計算公式如下。

式中：n為結(jié)合位點；Ka為結(jié)合常數(shù)；F0和F分別為不存在和存在柚皮素時胰脂肪酶的熒光強度；[Q]為柚皮素濃度，mol/L。

通過同步熒光法檢測柚皮素對胰脂肪酶的酪氨酸和色氨酸的影響。使用F-7100型熒光分光光度計在△λ=15 nm（酪氨酸）和△λ=60 nm（色氨酸）的波長間隔進(jìn)行掃描。掃描△λ=15 nm時，設(shè)置發(fā)射波長為280nm，激發(fā)波長為265 nm～465 nm；△λ=60 nm時，設(shè)置發(fā)射波長為280 nm，激發(fā)波長為220 nm～440 nm。記錄添加柚皮素（0～0.000 8 mol/L）后在胰脂肪酶氨基酸殘基（酪氨酸和色氨酸）的同步熒光光譜。同步熒光柚皮素濃度（0～0.8 mol/L）。

1.3.4 分子對接模擬

利用分子對接軟件Discover Studio 3.5預(yù)測柚皮素與胰脂肪酶的相互作用方式。從Chemical Book網(wǎng)站（https：//www.chemicalbook.com）搜索小分子柚皮素構(gòu)象。在“Small Molecules”模塊下的“prepare ligands”進(jìn)行小分子準(zhǔn)備。胰脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)來源于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）（PDB ID：1LPB）。在進(jìn)行對接前，去除蛋白質(zhì)上的水分和配體，在“Macromolecules”模塊下選擇“prepare protein”進(jìn)行蛋白準(zhǔn)備。使用“From Current Selection”模塊定義對接位點。蛋白與配體制備完成后選擇“Dock Ligands”（CDOCKER）進(jìn)行正式對接，并使用DS3.5獲得二維構(gòu)象圖像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用線性回歸計算抑制動力學(xué)常數(shù)。熒光光譜使用Origin 9.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 柚皮素對胰脂肪酶的抑制作用

不同濃度的柚皮素對胰脂肪酶活性的抑制作用見圖1。

圖1 柚皮素對于胰脂肪酶活性的抑制Fig.1 Inhibition of naringenin on pancreatic lipase activity

由圖1可知，抑制率隨著柚皮素或奧利司他濃度的增加而升高。柚皮素和奧利司他對胰脂肪酶抑制作用的半數(shù)抑制濃度分別為（2.413±0.160）mmol/L和（0.012±0.020）mmol/L?？梢妸W利司他在極低的濃度下抑制了酶的活性，推測奧利司他因為嚴(yán)重干擾正常的脂肪代謝，產(chǎn)生了一系列的副作用。雖然柚皮素對胰脂肪酶的抑制作用沒有奧利司他強，但是它是一個無副作用天然產(chǎn)物，在開發(fā)抗肥胖產(chǎn)品方面能夠起到重要的作用。

2.2 柚皮素對胰脂肪酶的抑制類型

酶活性的抑制通常有不可逆和可逆的抑制。不可逆抑制劑通過共價鍵與酶結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物并使酶失去活性，而可逆抑制劑通過非共價鍵和酶結(jié)合抑制了酶的活性[13]。柚皮素對胰脂肪酶的抑制作用類型結(jié)果見圖2。

圖2 柚皮素對胰脂肪酶的抑制類型Fig.2 Inhibitory types of naringenin on pancreatic lipase

由圖2可知，所有線均通過原點，斜率隨柚皮素濃度的增加而減小。柚皮素對胰脂肪酶的抑制作用呈濃度依賴性，柚皮素濃度越高，抑制活性越強。這表明柚皮素抑制胰脂肪酶的活性是通過降低其催化效率實現(xiàn)，而不是通過減少有效酶的數(shù)量。因此，柚皮素可逆地抑制胰脂肪酶的活性。

可逆性抑制可分為競爭性抑制、非競爭性抑制和混合競爭性抑制[13]。抑制類型由雙倒數(shù)圖上的交點確定[14]。柚皮素對胰脂肪酶雙倒數(shù)圖見圖3。

由圖3可知，所有直線在Y軸的正方向相交。Km和Vmax由公式計算得出，結(jié)果見表1。

圖3 柚皮素對胰脂肪酶雙倒數(shù)圖Fig.3 Lineweaver-Burk plot of naringenin on pancreatic lipase

表1 柚皮素對胰脂肪酶的Vmax和KmTable 1 Vmaxand Kmof naringenin on pancreatic lipase

由表1可知，隨著柚皮素濃度的增加，Vmax保持不變，但Km增加。推測柚皮素對胰脂肪酶的抑制類型為競爭性抑制。表明柚皮素能與胰脂肪酶活性中心結(jié)合，改變胰脂肪酶與底物的親和力。

2.3 熒光光譜試驗

2.3.1 柚皮素對胰脂肪酶熒光猝滅效應(yīng)

為進(jìn)一步研究柚皮素與胰脂肪酶之間的相互作用，測定不同濃度柚皮素對胰脂肪酶的熒光光譜。一般來說，胰脂肪酶的氨基酸殘基固有熒光的變化可以反映酶本身和周圍環(huán)境的變化[15]。酶和抑制劑相互作用引起的發(fā)色團微環(huán)境變化可通過蛋白質(zhì)的最大發(fā)射熒光強度進(jìn)行評估[16]。不同濃度的柚皮素對胰脂肪酶的熒光猝滅見圖4。

圖4 不同濃度柚皮素對胰脂肪酶的熒光猝滅Fig.4 Fluorescence quenching of pancreatic lipase by naringenin at different concentrations

由圖4可知，柚皮素濃度越高，對胰脂肪酶猝滅效果越強，胰脂肪酶的最大熒光發(fā)射波長由6 910 nm變?yōu)? 857 nm。可以預(yù)測，柚皮素與胰脂肪酶的相互作用會改變內(nèi)源熒光的微環(huán)境。隨著柚皮素濃度的增加，胰脂肪酶的最大發(fā)射峰從340 nm移動至358 nm，紅移出現(xiàn)的原因可能是胰脂肪酶與柚皮素結(jié)合后，周圍的氨基酸微環(huán)境（主要由色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸組成）發(fā)生變化，從而導(dǎo)致胰脂肪酶的極性增加，疏水性降低[17]。

2.3.2 熒光猝滅相關(guān)參數(shù)

由公式計算結(jié)果可知，柚皮素對胰脂肪酶的Kq值[2.21×1011L/（mol·s）]遠(yuǎn)大于2×1010L/（mol·s），表明柚皮素對胰脂肪酶的活性猝滅是由于柚皮素和胰脂肪酶形成了絡(luò)合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅。結(jié)合位點的數(shù)量（0.660 8）接近1，推測柚皮素和胰脂肪酶之間熒光存在一個結(jié)合位點[18]。

2.3.3 同步熒光作用

通過同步熒光法進(jìn)一步研究了柚皮素對胰脂肪酶周圍氨基酸殘基微環(huán)境的影響，尤其是對酪氨酸和色氨酸的影響，分別在△λ=15 nm和△λ=60 nm處測量了酪氨酸和色氨酸的特征變化[19]。柚皮素對酪氨酸、色氨酸的同步熒光分別見圖5和圖6。

圖5 不同濃度柚皮素對酪氨酸的同步熒光Fig.5 Synchronous fluorescence of naringenin on tyrosine at different concentrations

圖6 不同濃度柚皮素對色氨酸的同步熒光Fig.6 Synchronous fluorescence of naringenin on tryptophan at different concentrations

由圖5和圖6可知，柚皮素降低了酪氨酸和色氨酸的熒光強度，表明柚皮素抑制胰脂肪酶的過程中，胰脂肪酶的酪氨酸和色氨酸參與了相互作用。另外，柚皮素存在時，在Δλ=15 nm處熒光強度從1 400下降到400，在Δλ=60 nm處熒光強度從6 500下降到500，Δλ=60 nm處熒光強度下降更明顯，可以看出柚皮素對色氨酸的猝滅效果要強于對酪氨酸，表明結(jié)合過程對胰脂肪酶的色氨酸影響更大，柚皮素的結(jié)合位點更接近色氨酸[20]。色氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生紅移，表明柚皮素的加入改變了色氨酸的微環(huán)境并降低了疏水性，酪氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移，疏水性增加，導(dǎo)致氨基酸殘基較少暴露于溶劑中[21]。這些結(jié)果表明柚皮素改變了胰脂肪酶周圍氨基酸殘基的微環(huán)境，這可能也是胰脂肪酶活性降低的原因之一。

2.4 分子對接的結(jié)果分析

分子對接通常用于預(yù)測小分子配體與蛋白質(zhì)結(jié)合在適當(dāng)位置的構(gòu)象。酶活試驗顯示，柚皮素競爭性地抑制了胰脂肪酶的活性，可以推測柚皮素和脂肪酶可能只有一個結(jié)合位點。為了深入了解柚皮素和胰脂肪酶的結(jié)合位點，進(jìn)行了分子對接。柚皮素（藍(lán)色）和奧利司他（黃色）與胰脂肪酶的分子對接見圖7。

圖7 柚皮素（藍(lán)色）和奧利司他（黃色）與胰脂肪酶的分子對接Fig.7 Molecular docking of naringenin（blue）and orlistat（yellow）with pancreatic lipase

由圖7可知，奧利司他進(jìn)入胰脂肪酶的活性位點，柚皮素也對接在胰脂肪酶的活性位點，這證明柚皮素和奧利司他均能阻止底物和胰脂肪酶的結(jié)合，這與酶活性抑制試驗結(jié)果（圖1）一致。另外，對接結(jié)果的結(jié)合能量越低，表明配體與蛋白的結(jié)合作用更緊密，穩(wěn)定性更強。因此，比較柚皮素和奧利司他與胰脂肪酶相互作用的結(jié)合能，進(jìn)一步驗證柚皮素抑制胰脂肪酶的能力，結(jié)果見圖8和圖9。

圖8 柚皮素與胰脂肪酶對接局部細(xì)節(jié)圖Fig.8 Partial diagram of naringenin docking with pancreatic lipase

圖9 奧利司他與胰脂肪酶對接局部圖Fig.9 Partial diagram of orlistat docking with pancreatic lipase

通過DS分子對接軟件計算得知，奧利司他作用胰脂肪酶的結(jié)合能為-44.77 kcal/mol（圖9），而柚皮素與胰脂肪酶相互作用的結(jié)合能為-33.24 kcal/mol（圖8）。奧利司他對胰脂肪酶的結(jié)合能低于柚皮素對胰脂肪酶作用的結(jié)合能，表明胰脂肪酶和奧利司他結(jié)合得更緊密和穩(wěn)定，這個結(jié)果與2.1得到的抑制胰脂肪酶的活性試驗結(jié)果一致。

通過對接顯示二維分子對接模擬結(jié)果，進(jìn)一步分析柚皮素和奧利司他與胰脂肪酶的相互作用關(guān)系，結(jié)果見圖10和圖11。

圖10 柚皮素與胰脂肪酶相互作用的氨基酸殘基Fig.10 Amino acid residues of pancreatic lipase interacting with naringenin

圖11 奧利司他與胰脂肪酶相互作用的氨基酸殘基Fig.11 Amino acid residues of pancreatic lipase interacting with orlistat

由圖10可知，柚皮素被11個氨基酸殘基（Gly330、Asp331、Gly236、Asp389、Arg337、Lys367、Pro235、Glu13、Asp12、Tyr369、Leu41）包圍。由圖11可知，奧利司他與胰脂肪酶上的25個氨基酸殘基（Gly254、Asp257、Glu253、Asp247、Ser333、Phe335、Gln244、Asp249、Lys268、Gly14、Ile248、Ala332、Lys239、Arg265、Glu15、Cys39、Gly236、Asp331、Glu13、Pro235、Asp12、Asp389、Ala40、Lys367、Leu41）結(jié)合。其中 Lys367、Asp12、Asp331、Asp389、Pro235、Leu41、Gly236 和 Glu13 是柚皮素和奧利司他與胰脂肪酶結(jié)合時共用的氨基酸殘基。這些殘基通過二次鍵（氫鍵、范德華力、電荷或極性）與柚皮素和奧利司他相互作用。奧利司他通過與胰脂肪酶上的Ser333和Lys239形成2個氫鍵相互作用，并且通過范德華力與胰脂肪酶的Gly254、Asp257、Glu253、Phe335、Gln244、Lys268、Ile248、Ala332、Glu15、Gly236、Asp331、Glu13、Pro235、Asp12、Asp389、Ala40、Lys367 和Leu41氨基酸殘基形成相互作用，達(dá)到穩(wěn)定結(jié)合。柚皮素通過與胰脂肪酶的Lys367、Gly236和Arg337這3個氨基酸殘基形成3個氫鍵，并且通過范德華力與胰脂肪酶的 Tyr369、Asp389、Leu41、Pro235 和 Gly330 氨基酸殘基相互作用。柚皮素和胰脂肪酶的相互作用與奧利司他和胰脂肪酶的結(jié)合構(gòu)象相似，表明柚皮素和奧利司他均可以在胰脂肪酶的活性位點上穩(wěn)定結(jié)合。另外，柚皮素與胰脂肪酶的組合中形成了3個穩(wěn)定相互作用的氫鍵，表明氫鍵可以增加胰脂肪酶的疏水性，使復(fù)合物的構(gòu)象更加穩(wěn)定[22]，由此也證明了柚皮素抑制了胰脂肪酶的活性。

3 結(jié)論

體外酶試驗結(jié)果表明，柚皮素對胰脂肪酶的抑制作用對應(yīng)的IC50值為（2.413±0.160）mmol/L。酶動力學(xué)研究表明，柚皮素對胰脂肪酶作用的抑制類型為可逆競爭性抑制。熒光分析外光譜分析表明，隨著柚皮素的加入，胰脂肪酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而降低酶的活性。同步熒光顯示柚皮素對色氨酸的熒光猝滅更強，表明柚皮素的結(jié)合位點更接近色氨酸。分子對接發(fā)現(xiàn)柚皮素在胰脂肪酶的活性位點與其結(jié)合，阻止了底物和酶的結(jié)合，導(dǎo)致酶活性降低。胰脂肪酶在生物體消化吸收脂肪的過程中起著非常重要的作用，而柚皮素可以通過抑制胰脂肪酶的活性來影響人體的脂肪代謝，從而在抗肥胖方面起到一定作用，可為開發(fā)降脂功能食品提供參考。