馮軍花， 何 京， 唐 杰， 李蓉蓉， 鄧艷麗， 張金艷

近年來(lái)，隨著臨床微生物檢驗(yàn)的發(fā)展，厭氧菌的檢出率逐步提高，由厭氧菌引起的機(jī)會(huì)性感染進(jìn)入臨床診療的視野，其感染部位多發(fā)，在血液、腦脊液、腹腔、盆腔等均有報(bào)道[1-3]。相比一般細(xì)菌，厭氧菌體外分離困難，其培養(yǎng)分離率受標(biāo)本采集和運(yùn)輸、孵育氣體環(huán)境、培養(yǎng)基成分等多種因素影響，且常因與其他細(xì)菌混合感染，臨床檢驗(yàn)中漏檢率高。厭氧菌感染臨床治療多以經(jīng)驗(yàn)治療為主，易造成抗菌藥物的不規(guī)范使用[4-5]。通過(guò)分離厭氧菌體外行藥物敏感試驗(yàn)，以調(diào)整用藥方案，抗感染治療效果可大幅提高[6]。本研究通過(guò)對(duì)河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院厭氧菌感染的菌種、感染類(lèi)型進(jìn)行流行病學(xué)分析，并開(kāi)展厭氧菌藥物敏感試驗(yàn)，以期為臨床抗厭氧菌治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2017年1月—2019年12月，本院檢驗(yàn)科分離的厭氧菌137株，其中脆弱擬桿菌82株，所有菌株均來(lái)自患者非重復(fù)感染部位標(biāo)本。

1.2 方法

1.2.1 菌株復(fù)蘇 將EP管中凍存的菌株，轉(zhuǎn)種于布氏厭氧血瓊脂培養(yǎng)基（美國(guó)BBL公司），置于培養(yǎng)罐中使用MPI多功能微生物培養(yǎng)系統(tǒng)抽出空氣，充入?yún)捬鯕怏w，35℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳代2次后使用。每次傳代同時(shí)進(jìn)行耐氧試驗(yàn)，即將菌株接種于血瓊脂平板，35℃空氣環(huán)境培養(yǎng)48 h,無(wú)菌生長(zhǎng)即為耐氧試驗(yàn)合格。

1.2.2 菌株鑒定 受試菌株分別采用16S rRNA測(cè)序、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI TOF MS）技術(shù)、傳統(tǒng)生化反應(yīng)卡進(jìn)行鑒定。測(cè)序引 物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；質(zhì)譜儀每批次檢測(cè)以大腸埃希菌ATCC 8739作為質(zhì)控菌株；生化反應(yīng)卡每批次檢測(cè)以卵形擬桿菌ATCC BAA-1296作為質(zhì)控菌株。

1.2.3 瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）M11-A8文件中的規(guī)定制備不同濃度梯度抗菌藥物的布氏厭氧血瓊脂。將待測(cè)脆弱擬桿菌分別制備成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝坏木鷳乙海? μL接種于瓊脂平板表面，每點(diǎn)接種菌量約為105CFU，形成直徑為5～8 mm的菌斑，按照低濃度到高濃度依次接種。在每個(gè)系列平板之間，接種一個(gè)不含抗菌藥物的對(duì)照平板，用于生長(zhǎng)質(zhì)控和檢測(cè)平板接種過(guò)程中可能發(fā)生的污染。接種10 min后將平板翻轉(zhuǎn)，置于厭氧培養(yǎng)罐中，35 ℃孵育48 h。每批次檢測(cè)以脆弱擬桿菌ATCC 25285作為質(zhì)控菌株。將平板置于暗色、無(wú)反光物體表面上判斷試驗(yàn)終點(diǎn)，獲取藥物最低抑菌濃度（MIC）。藥敏結(jié)果的解釋和質(zhì)控范圍依據(jù)CLSI M100-S29標(biāo)準(zhǔn)判斷。

1.2.4 E試驗(yàn)法藥敏試驗(yàn) 配置0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮嗳鯏M桿菌菌懸液，均勻涂布于布氏厭氧血瓊脂上，干燥3～10 min后，將各抗菌藥物E試驗(yàn)條依次置于布氏厭氧血瓊脂上，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐中，35 ℃孵育48 h。每批次檢測(cè)以脆弱擬桿菌ATCC 25285作為質(zhì)控菌株。觀察脆弱擬桿菌生長(zhǎng)情況，讀取抑菌圈與E試驗(yàn)條交界處的MIC值。藥敏結(jié)果的解釋和質(zhì)控范圍依據(jù)CLSI M100-S29標(biāo)準(zhǔn)判斷。

1.2.5 耐藥基因檢測(cè) 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取脆弱擬桿菌DNA作為模板。PCR擴(kuò)增耐藥基因：甲硝唑耐藥基因nim、碳青霉烯類(lèi)耐藥基因cfiA、四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetQ、大環(huán)內(nèi)酯及林可霉素類(lèi)耐藥基因ermF。引物序列由上海生工公司合成。PCR 擴(kuò)增體系30 μL：2 × Taq PCR Master Mix 25 μL，模板DNA 2 μL，10 mmol/L上、下游引物各1.5 μL。反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。所得產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的片段純化后由上海生工公司雙向測(cè)序，用BLAST軟件與GenBank上已公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)。

表1 脆弱擬桿菌耐藥基因擴(kuò)增引物及擴(kuò)增條件Table 1 Primers and conditions for amplification of resistance genes in Bacteroides fragilis

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用 SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。對(duì)瓊脂稀釋法與E試驗(yàn)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 厭氧菌鑒定及分布特征

研究共收集厭氧菌137株，所有菌株均經(jīng)16S rRNA測(cè)序鑒定菌種，共鑒定6個(gè)屬、10個(gè)種。MALDI TOF MS技術(shù)、傳統(tǒng)生化反應(yīng)卡在種水平鑒定正確率分別為94.2%、85.4%。不同感染部位菌種分布見(jiàn)表2。

2.2 瓊脂稀釋法藥敏分析

共收集脆弱擬桿菌82株，對(duì)7種抗菌藥物進(jìn)行瓊脂稀釋法體外藥敏試驗(yàn)，采用CLSI M100-S29標(biāo)準(zhǔn)判斷，結(jié)果見(jiàn)表3。脆弱擬桿菌對(duì)甲硝唑和氯霉素的敏感率較高，均大于90%，其中甲硝唑的敏感率最高（98.8%）；對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的敏感率僅次于甲硝唑和氯霉素，均為78.0%；對(duì)克林霉素的敏感率最低，為2.4%。

2.3 E試驗(yàn)法藥敏分析

82株脆弱擬桿菌，對(duì)7種抗菌藥物進(jìn)行E試驗(yàn)法體外藥敏試驗(yàn)，采用CLSI M100-S29判斷結(jié)果，見(jiàn)表4。結(jié)果顯示，對(duì)甲硝唑的敏感率與瓊脂稀釋法一致，仍為98.8%；氯霉素的敏感率降低（86.6%），出現(xiàn)中介結(jié)果；對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的敏感率均較瓊脂稀釋法有所降低，兩藥分別為74.4%和69.5%；對(duì)克林霉素敏感率仍最低，為1.3%。

表2 不同感染部位菌種分布Table 2 Distribution of anaerobic species in terms of infection site

表3 82株脆弱擬桿菌瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by agar dilution assay

2.4 瓊脂稀釋法與E試驗(yàn)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

針對(duì)以上藥敏試驗(yàn)結(jié)果的差異，對(duì)兩種方法中甲硝唑、氯霉素、亞胺培南、美羅培南的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，判斷總體分布是否有差別。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，瓊脂稀釋法與E試驗(yàn)法在4種抗菌藥物的MIC分布上均無(wú)差異，P均＞0.05。見(jiàn)表5。

表4 82株脆弱擬桿菌E試驗(yàn)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Susceptibility of 82 strains of Bacteroides fragilis tested by Etest method

表5 瓊脂稀釋法與E試驗(yàn)法藥敏試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 5 Susceptibility results tested by agar dilution versus Etest method

2.5 脆弱擬桿菌耐藥基因分布

82株脆弱擬桿菌中：甲硝唑耐藥基因nim擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；碳青霉烯類(lèi)耐藥基因cfiA檢出率為22.0%、碳青霉烯類(lèi)耐藥菌株均攜帶cfiA基因，檢出率為100%；四環(huán)素類(lèi)耐藥基因tetQ檢出率為75.6%、四環(huán)素耐藥菌株tetQ基因的檢出率為95.4%；大環(huán)內(nèi)酯及林可霉素類(lèi)耐藥基因ermF檢出率為72.0%；克林霉素耐藥菌株的ermF基因檢出率為74.7%。

3 討論

厭氧菌作為寄居于人體口腔、腸道的正常菌群，在機(jī)體免疫力低下時(shí)易導(dǎo)致內(nèi)源性感染，隨著臨床對(duì)厭氧菌認(rèn)識(shí)的加深，其在醫(yī)院感染中的檢出率逐步提高[9-11]。本研究結(jié)果顯示，臨床送檢標(biāo)本中共分離出厭氧菌137株，共6個(gè)屬、10個(gè)種，其中革蘭陰性菌比陽(yáng)性菌占比高；革蘭陰性菌以脆弱擬桿菌為主，占總株數(shù)的59.9%， 革蘭陽(yáng)性菌以厭氧消化鏈球菌為主，占8.0%。由此可知，脆弱擬桿菌在厭氧菌感染中最為常見(jiàn)[12]，可能與其自身特性有關(guān)，即對(duì)氧的耐受性較高，在空氣中暴露12 h仍可存活[13-14]。厭氧菌主要在血培養(yǎng)中檢出，占總株數(shù)的67.2%，其中又以脆弱擬桿菌檢出率最高，在血流感染菌株中占79.3%。Dumont等[15]報(bào)道144株厭氧菌引起的菌血癥中，脆弱擬桿菌占47.2%?？梢?jiàn)其引起的菌血癥應(yīng)當(dāng)在抗感染治療中受到關(guān)注，而血培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)瓶采集標(biāo)本大大提高了厭氧菌的檢出率，相比其他標(biāo)本，厭氧培養(yǎng)瓶采集血液操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)基質(zhì)液及厭氧環(huán)境均可延長(zhǎng)細(xì)菌存活時(shí)間，在一定程度上避免了假陰性結(jié)果[16]。普雷沃菌屬在血液、口咽部膿腫分泌物、肺膿腫穿刺液中均有檢出。Panda等[17]研究發(fā)現(xiàn)口咽部鱗狀細(xì)胞癌患者口腔中普雷沃菌屬占比有所提高。本研究中口腔分泌物均取自口腔鱗癌患者，其出現(xiàn)由普雷沃菌屬引起的牙周感染可能與此有關(guān)。此外，放線菌屬、韋榮球菌屬作為口腔中的常居菌群，易引起免疫功能低下患者口腔黏膜破潰后感染[18]。厭氧消化鏈球菌是本研究中檢出最多的革蘭陽(yáng)性菌，其在腹腔、口腔、胸腔標(biāo)本均有分離。Carmel等[19]同樣在綜述中提出厭氧消化鏈球菌可引起胸膜腔、腹壁、牙周的急慢性傷口感染。艱難梭菌作為抗生素相關(guān)腹瀉的主要病因，近來(lái)隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)的完善其檢出率有所提高。本研究中5株從腸道分離的厭氧菌均為艱難梭菌，長(zhǎng)期住院、質(zhì)子泵抑制劑、廣譜頭孢菌素等抗菌藥物是引起艱難梭菌腹瀉的危險(xiǎn)因素[20-21]，需要在臨床抗感染治療中引起重視。

近年，因厭氧菌耐藥導(dǎo)致的抗感染治療失敗時(shí)有發(fā)生。本研究選取分離最多的脆弱擬桿菌行藥敏試驗(yàn)，使用CLSI推薦的瓊脂稀釋法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲硝唑的耐藥率為1.2%，與Ghotaslou等[22]報(bào)道對(duì)甲硝唑耐藥率在0.5%～7.3%相一致。臨床使用甲硝唑抗厭氧菌治療可取得穩(wěn)定效果；其次對(duì)氯霉素的耐藥率6.1%，仍處于較低水平；對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥率已達(dá)22.0%，需要在臨床治療中予以重視；對(duì)克林霉素、四環(huán)素、阿莫西林-克拉維酸的耐藥率均超過(guò)40%，其中克林霉素耐藥率最高，達(dá)96.3%。由此可見(jiàn)，厭氧菌的耐藥情況不容樂(lè)觀，經(jīng)驗(yàn)治療厭氧菌受到限制。但CLSI推薦的瓊脂稀釋法操作煩瑣，一般實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展困難[23]，故本研究對(duì)比分析了E試驗(yàn)法與瓊脂稀釋法的差異，以評(píng)估E試驗(yàn)法的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)比較兩種方法抗菌藥物的MIC分布，可見(jiàn)E試驗(yàn)法檢測(cè)MIC出現(xiàn)較多中介結(jié)果，抗菌藥物的敏感率稍有下降，但耐藥率基本不變，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于甲硝唑、氯霉素、亞胺培南和美羅培南，兩種方法無(wú)差異，這與Hughes等[24]報(bào)道一致，且E試驗(yàn)法不用消耗太多的人力、物力，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，可作為對(duì)有需要的患者初篩試驗(yàn)，以避免在抗感染治療中使用耐藥的抗菌藥物，而瓊脂稀釋法可作為確證試驗(yàn)用于流行病學(xué)調(diào)查，以明確醫(yī)院內(nèi)厭氧菌的耐藥性變化趨勢(shì)，為臨床治療提供依據(jù)。

研究中針對(duì)脆弱擬桿菌的藥敏試驗(yàn)情況，對(duì)4種耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)。甲硝唑作為抗菌活性最高的抗厭氧菌藥物，細(xì)菌耐藥多由nim基因介導(dǎo)，但本研究中所有受試菌株P(guān)CR擴(kuò)增均呈陰性，其耐藥可能與產(chǎn)生其他nim基因亞型或細(xì)菌的主動(dòng)外排作用有關(guān)[22]；碳青霉烯類(lèi)耐藥的脆弱擬桿菌均攜帶cfiA基因[25]，其表達(dá)與否與碳青霉烯類(lèi)藥物的MIC密切相關(guān)；介導(dǎo)四環(huán)素耐藥的tetQ基因可編碼細(xì)菌核糖體保護(hù)性蛋白，脆弱擬桿菌四環(huán)素耐藥多由tetQ基因所致；有研究表明[26]，脆弱擬桿菌對(duì)克林霉素的耐藥性已廣泛流行，且對(duì)克林霉素的高水平耐藥性是通過(guò)ermF基因介導(dǎo)，本研究中脆弱擬桿菌ermF基因攜帶率已達(dá)72.0%。

綜上所述，臨床分離厭氧菌以脆弱擬桿菌為主，以血流感染最為常見(jiàn)，E試驗(yàn)法對(duì)于檢測(cè)脆弱擬桿菌的藥物敏感性具有一定價(jià)值，可對(duì)臨床抗厭氧菌治療提供幫助。