宋愛(ài)偉，畢 紅，陳亞軍，吳林生，徐德聰，王 偉

(合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230601)

1 研究背景

蘋(píng)果作為人們最經(jīng)常食用的水果之一，從其個(gè)頭的大小、鮮艷程度、表面光滑度和氣味香度等方面區(qū)分，可分為三大類(lèi)：一類(lèi)是尾食品種；一類(lèi)是酒用品種；一類(lèi)是烹調(diào)品種[1]。不同品種的蘋(píng)果，丹寧、酸度與糖分的含量各不相同[2]。此外，蘋(píng)果還具有降低膽固醇、保護(hù)肺部不受煙塵的影響、緩解不良情緒和提神醒腦等功能。蘋(píng)果中含有人體所需的大多數(shù)微量元素，飯前吃蘋(píng)果可以使人食欲降低，從而減少進(jìn)食量，達(dá)到減肥的目的。這些特性，使得蘋(píng)果深受大眾的喜愛(ài)。

青棗學(xué)名牛奶棗，是一種常見(jiàn)的熱帶水果。其中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有清涼解毒的功效。[3]此外，其還具有抗氧化、抗癌等功能，可以增強(qiáng)人類(lèi)的免疫力、促進(jìn)血液循環(huán)，常常吃青棗，不但可以美容養(yǎng)顏，而且還能夠延緩衰老。

蘋(píng)果和青棗通常作為鮮食或用來(lái)打漿收汁，但收汁剩下的蘋(píng)果泥和青棗泥往往當(dāng)垃圾丟棄，這樣不但浪費(fèi)資源而且污染環(huán)境。蘋(píng)果泥和青棗泥糖類(lèi)含量非常高，兩者所含的大量營(yíng)養(yǎng)成分為微生物的生長(zhǎng)提供了良好的環(huán)境。因此，將蘋(píng)果泥和青棗泥經(jīng)微生物發(fā)酵制成酵素，可以減少資源浪費(fèi)，為農(nóng)產(chǎn)品深加工和帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)扶貧提供新的思路。

由于蘋(píng)果和青棗都是常見(jiàn)的可食用水果，研究主要探究用這些可食用水果做成可食用植物酵素[4]?？墒秤弥参锝退氐臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量非常多，含有微生物發(fā)酵中產(chǎn)生的一些次級(jí)代謝產(chǎn)物及其活性成分，而其本身就含有多種酶、維生素和礦物質(zhì)元素等[5]。相比于直接食用青棗和蘋(píng)果，可食用酵素中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更加容易被人體吸收利用。

以新鮮蘋(píng)果泥和青棗泥作為原材料，研究在發(fā)酵過(guò)程中各種生物學(xué)特征的改變以及酵素液中的抗氧化活性變動(dòng)規(guī)律。以期為可食用蘋(píng)果青棗酵素作用和功能的進(jìn)一步闡釋、分析提供理論基礎(chǔ)。蘋(píng)果青棗酵素所呈現(xiàn)出的良好生理活性與其發(fā)酵過(guò)程有著緊密的聯(lián)系，但目前蘋(píng)果青棗混合發(fā)酵的酵素類(lèi)型卻鮮有報(bào)道。因此，深入地探究蘋(píng)果青棗酵素在發(fā)酵環(huán)境中的各種生物學(xué)特征和其抗氧化活性的改變，對(duì)研究和開(kāi)發(fā)高品質(zhì)的蘋(píng)果青棗酵素產(chǎn)品具有重要作用。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所使用的實(shí)驗(yàn)材料見(jiàn)表1。

表1 生物學(xué)特性和抗氧化活性研究實(shí)驗(yàn)材料

2.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所用儀器見(jiàn)表2。

表2 生物學(xué)特性和抗氧化活性研究實(shí)驗(yàn)儀器

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 蘋(píng)果青棗酵素的制備

將蘋(píng)果泥和青棗泥與水1:2混勻后，加入不同含量的木聚糖酶(0U/g，150U/g，300U/g，450U/g，600U/g)，首先55℃酶解5h，再加入2%蔗糖、0.05%磷酸氫二鉀、0.2%酵母膏、0.1%氯化鋅、0.1%硫酸鎂、0.05%磷酸二氫鉀。滅菌、冷卻后，接種0.25%酵母菌，于30℃發(fā)酵24h，接種0.1%乳酸菌，37℃下發(fā)酵24h，最后于2～8℃下發(fā)酵24h，使基質(zhì)產(chǎn)香[6]。

2.3.2 生物量的測(cè)定

取適量發(fā)酵液，離心沉淀后即為生物[7]。

2.3.3 pH值的測(cè)定

按照pH計(jì)說(shuō)明書(shū)指導(dǎo)測(cè)定[8]。

2.3.4 可滴定酸度的測(cè)定

吸得1mL發(fā)酵液測(cè)量其重量，記為(W)，后定容至100mL的蒸餾水中，則稀釋倍數(shù)為100，記為(F)，加入酚酞指示劑4滴，用0.1%mol/L NaOH(C)溶液滴定至微紅色30s內(nèi)不褪色，記錄消耗NaOH的體積(V)，平行測(cè)定三次?？傻味偹岫鹊挠?jì)算公式：

總酸度(%)=V·C·K·F×1000/W

K為酸的換算系數(shù)[9]。

2.3.5 還原糖含量的測(cè)定

參照DNS法[10]。

2.3.6 總黃酮含量的測(cè)定

稱(chēng)取20mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于200mL的容量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解并定容，得到0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.00mL，0.30mL，0.60mL，1.20mL，1.80mL，2.40mL，3.00mL標(biāo)準(zhǔn)液于5mL的容量瓶中，加入0.4mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6min后加入0.4mL 10%的硝酸鋁溶液，靜置6min，然后加入1.2mL 4%的氫氧化鈉溶液，用70%的乙醇溶液定容，搖勻，靜置15min后于510nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。發(fā)酵液經(jīng)離心后收集上清液，按照上述方法測(cè)得510nm處吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算發(fā)酵液中黃酮含量(mg/mL)[11]。

2.3.7 還原力的測(cè)定

參照鐵氰化鉀法[12]，吸光度的高低與還原力強(qiáng)弱成正比。

2.3.8 羥自由基清除力的測(cè)定

參照鄰二氮菲法[13]。

2.3.9 超氧化物歧化酶(SOD)活力的測(cè)定

參照鄰苯三酚自氧化法[14]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵過(guò)程中生物量的變化

由圖1可知，在蘋(píng)果和青棗酵素發(fā)酵過(guò)程中，生物量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)。其中，30～42h生物量快速上升，可能是由于乳酸菌快速增殖，產(chǎn)生了大量的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致生物量快速上升；但當(dāng)?shù)竭_(dá)42h后，生物量幾乎不再增加，可能是由于發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，濕菌體繁殖受到抑制。同時(shí)，在發(fā)酵前期加入的木聚糖酶的含量對(duì)于溶液的生物量也有影響，同等發(fā)酵時(shí)間下，木聚糖酶的含量越高生物量越多，當(dāng)木聚糖酶的含量為600U/g時(shí)，生物量最高。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中生物量的變化

3.2 發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

由圖2可知，由于酵母菌是需氧型真菌，在發(fā)酵前期，采用通氣發(fā)酵會(huì)使發(fā)酵液的pH值降低，這可能是由于酵母菌代謝生成的有機(jī)物質(zhì)造成的；24h之后接入乳酸菌，因?yàn)槿樗峋菂捬跣图?xì)菌，所以對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行靜置封閉發(fā)酵。結(jié)果顯示：發(fā)酵液的pH值降低的速度會(huì)加快，大量增加的乳酸菌會(huì)不斷將糖類(lèi)等物質(zhì)轉(zhuǎn)化成乳酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵液酸度上升。同時(shí)，在發(fā)酵前期加入木聚糖酶的含量對(duì)于發(fā)酵液的pH值也有一定的影響，木聚糖酶的含量越低，溶液的酸度越弱，pH值越大，其中不加入木聚糖酶時(shí)的發(fā)酵液的pH值最大，48h后pH值為4.31。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中pH值的變化

3.3 發(fā)酵過(guò)程中可滴定酸度的變化

由圖3可知，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，可滴定酸度總體呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)，在0～24h時(shí)，酵母菌產(chǎn)生二氧化碳、有機(jī)酸等物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵液的酸度不斷上升；24h后又加入的乳酸菌將碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸，也導(dǎo)致了發(fā)酵液的酸度不斷上升。在發(fā)酵前期加入木聚糖酶的含量對(duì)于發(fā)酵液的酸度也有影響，木聚糖酶的含量越高，溶液的酸度越強(qiáng)，則可滴定酸度越高，其中可滴定酸度最高的為加入600U/g木聚糖酶的發(fā)酵液，達(dá)0.65%。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中可滴定酸度的變化

3.4 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

如圖4所示，實(shí)驗(yàn)得到的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.5788x-0.0148，R2=0.9985。由圖5可知，還原糖含量在6h內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過(guò)程中酵母菌充分發(fā)動(dòng)蔗糖酶水解蔗糖誘使蔗糖不斷水解為葡萄糖和果糖，使得還原糖含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在發(fā)酵6～24h期間還原糖含量呈現(xiàn)不斷下降的現(xiàn)象能說(shuō)明這個(gè)階段酵母菌增殖量較大。加入乳酸菌之后，在6h內(nèi)還原糖含量下降速度較明顯，表明這個(gè)階段乳酸菌繁殖量也比較大。同時(shí)，在發(fā)酵前期加入木聚糖酶的含量對(duì)于溶液的還原糖含量也有影響，木聚糖酶的含量越高，還原糖的含量越高，發(fā)酵后期，木聚糖酶的加入量對(duì)于還原糖含量影響不大，還原糖的最低含量趨近于0.174mg/mL。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

圖5 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

3.5 發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量的變化

如圖6所示，實(shí)驗(yàn)所得的黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.0019x-0.019,R2=0.9948。由圖7可知，發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量總體呈不斷上升的趨勢(shì)，尤其是在接種乳酸菌后，黃酮含量上升明顯變快，表明這個(gè)階段乳酸菌繁殖量也比較大。在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌可能會(huì)破壞植物的細(xì)胞壁，而黃酮類(lèi)物質(zhì)大部分會(huì)與細(xì)胞壁中的木質(zhì)素結(jié)合在一起，當(dāng)細(xì)胞壁遭到破壞時(shí)，發(fā)酵液中的黃酮含量則會(huì)上升。同時(shí)，在發(fā)酵中加入木聚糖酶的含量對(duì)于溶液的黃酮含量也有一定的影響，木聚糖酶含量越高，黃酮含量越高，最后都趨近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明顯偏低，趨近于315mg/mL，可能是木聚糖酶在發(fā)酵過(guò)程中，破壞了蘋(píng)果和青棗的細(xì)胞壁，使得黃酮的含量有所增加。

圖6 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖

圖7 發(fā)酵液過(guò)程中黃酮含量的變化

3.6 發(fā)酵過(guò)程中還原力的變化

由圖8可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中還原力總體呈上升趨勢(shì)，可能是由于酵母菌和乳酸菌本來(lái)就有一定的抗氧化性，也可能是菌體表面和代謝產(chǎn)物中存在一定量的抗氧化物質(zhì)。酵母菌和乳酸菌的發(fā)酵會(huì)很大程度的提高蘋(píng)果青棗酵素的抗氧化活力。同時(shí)，在發(fā)酵前期加入木聚糖酶的含量對(duì)于溶液的還原力也有一定的影響，隨著木聚糖酶含量的增高，發(fā)酵液的抗氧化性會(huì)增強(qiáng)，故還原力會(huì)不斷升高。其中不加木聚糖酶的發(fā)酵液還原力最低，在48hOD值達(dá)到0.208，加入600U/g木聚糖酶的還原力最高，在48hOD值達(dá)0.268。

圖8 發(fā)酵液過(guò)程中還原力的變化

3.7 發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除率的變化

由圖9可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的推移，發(fā)酵液內(nèi)羥自由基的清除率逐漸呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，這很有可能是因?yàn)榻湍妇腿樗峋陨矶季哂休^強(qiáng)的抗氧化作用。此外，發(fā)酵過(guò)程中酵母菌和乳酸菌可能誘發(fā)發(fā)酵液對(duì)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、還原型輔酶Ⅰ氧化酶和還原型輔酶Ⅰ過(guò)氧化酶等多種抗氧化酶產(chǎn)生清除活性氧的活動(dòng)[15-17]。說(shuō)明蘋(píng)果青棗酵素經(jīng)過(guò)酵母菌和乳酸菌的發(fā)酵，其抗氧化性得到了極大的增強(qiáng)。同時(shí)，在發(fā)酵前期添加木聚糖酶的含量對(duì)于發(fā)酵液中的羥自由基清除率也會(huì)產(chǎn)生影響，木聚糖酶的含量越高，羥自由基清除率越高，但在發(fā)酵達(dá)48h后都趨近于99%。

圖9 發(fā)酵液中羥自由基清除率的變化

3.8 發(fā)酵過(guò)程中SOD酶活力的變化

由圖10可知，發(fā)酵液中SOD酶活力會(huì)隨著發(fā)酵的時(shí)間增加而增強(qiáng)。對(duì)照?qǐng)D1中生物量的結(jié)果來(lái)看，可以很明顯地看出兩個(gè)圖具有相關(guān)性。這些現(xiàn)象表明了乳酸菌和酵母菌兩種菌類(lèi)都可以產(chǎn)生超氧化物歧化酶使蘋(píng)果青棗酵素的抗氧化活性得到提高。同時(shí)，在發(fā)酵前期加入木聚糖酶的含量對(duì)于發(fā)酵液的SOD酶活力也有一定的影響，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越強(qiáng)，當(dāng)加入的木聚糖酶含量為600U/g時(shí)，SOD酶活力達(dá)到111U/mL。

圖10 發(fā)酵液中SOD酶活力的變化

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本文以新鮮的蘋(píng)果泥和青棗泥作為原材料，在基質(zhì)中加入了兩種常用菌種發(fā)酵(乳酸菌和酵母菌)，研究了在發(fā)酵過(guò)程中的各種生物學(xué)特性和抗氧化活性的變動(dòng)規(guī)律。在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)測(cè)量可以得出：(1)生物量不斷上升，當(dāng)?shù)竭_(dá)42h后，生物量幾乎不再增加，當(dāng)木聚糖酶的含量為600U/g時(shí)，生物量最高為1.09g。(2)pH值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不加入木聚糖酶時(shí)的發(fā)酵液的pH值最大，48h后pH值達(dá)4.31。(3)可滴定酸度總體呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)，可滴定酸度最高的為加入600U/g木聚糖酶的發(fā)酵液，達(dá)0.65%。(4)還原糖含量在6h內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在發(fā)酵6～24h期間還原糖含量不斷下降，說(shuō)明這個(gè)階段酵母菌增殖量較大；加入乳酸菌之后，在6h內(nèi)還原糖含量下降速度較明顯，表明這個(gè)階段乳酸菌繁殖量也比較大；木聚糖酶的含量越高，還原糖的含量越高，發(fā)酵后期，木聚糖酶的加入量對(duì)于還原糖含量影響不大，還原糖的含量趨近于0.174mg/mL。(5)黃酮含量呈不斷上升的趨勢(shì)，木聚糖酶含量越高，黃酮的含量越高，最后都趨近于359mg/mL，但未加木聚糖酶的含量明顯偏低，趨近于315mg/mL。(6)還原力總體呈上升趨勢(shì)，在48hOD值達(dá)到0.208，加入600U/g木聚糖酶的發(fā)酵液還原力最高，在48hOD值達(dá)0.268。(7)羥自由基的清除率逐漸呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，木聚糖酶的含量越高，羥自由基清除率越高，在發(fā)酵48h后清除率趨近于99%。(8)SOD酶活力不斷上升，木聚糖酶的含量越高，SOD酶活力也越強(qiáng)，當(dāng)加入的木聚糖酶含量為600U/g時(shí)，SOD酶活力達(dá)到111U/mL。

綜上，經(jīng)酵母菌和乳酸菌發(fā)酵后的蘋(píng)果青棗酵素的抗氧化活性大大提高，利用收汁后的蘋(píng)果泥和青棗泥，不但避免了浪費(fèi)，還減少了環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)了資源的充分利用，為農(nóng)產(chǎn)品深加工和帶動(dòng)產(chǎn)業(yè)扶貧提供新思路。