孟曉建 于建東 鄭小梅，4 鄭平，4 李志敏 孫際賓，4葉勤

（1. 華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237；2. 中國科學院系統(tǒng)微生物工程重點實驗室，天津 300308；3. 中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；4. 國家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308）

檸檬酸是當前世界上產(chǎn)量和消費量最大的有機酸，廣泛用于食品飲料、醫(yī)藥化工和有機材料等領(lǐng)域［1］。目前，檸檬酸的全球年產(chǎn)量達到200萬t以上，并以每年3.5%-4.0%的速度增加［2］。黑曲霉是檸檬酸的主力生產(chǎn)菌株，具有極端耐酸性，能夠在pH低至1.5下正常生長發(fā)酵，具有強魯棒性，可快速利用工業(yè)粗原料大量積累檸檬酸［1］。黑曲霉獨特的檸檬酸合成與積累能力表明其具有一套獨特的代謝調(diào)控機制。目前已有許多相關(guān)研究致力于黑曲霉檸檬酸代謝中的關(guān)鍵調(diào)控作用，以期揭示黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸的機理［1，3-4］。黑曲霉檸檬酸合成代謝主要是六碳糖經(jīng)過糖酵解或者磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸進而降解為丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。在大多數(shù)生物體中，檸檬酸合成后會進一步代謝生成其他物質(zhì)供生物體利用，不會過量積累。但黑曲霉檸檬酸合成代謝中存在一系列受調(diào)控的關(guān)鍵酶，有效地保障了糖酵解途徑的暢通，同時阻斷了三羧酸循環(huán)中的檸檬酸下游降解，使得檸檬酸得以大量積累。其中，糖酵解途徑的調(diào)節(jié)是黑曲霉檸檬酸積累的重要調(diào)控機制［5］。

在糖酵解途徑中，己糖激酶、磷酸果糖激酶與丙酮酸激酶是3個重要的關(guān)鍵酶。在多數(shù)生物中，磷酸果糖激酶是控制糖酵解代謝流量的關(guān)鍵酶，會受檸檬酸的反饋抑制，因此黑曲霉的磷酸果糖激酶的調(diào)控也備受關(guān)注。黑曲霉磷酸果糖激酶PfkA被高濃度的ATP、Mn2+與檸檬酸所抑制，但被NH4+、Zn2+、Mg2+與果糖 -2，6-二磷酸所激活［6-7］。但相對而言，目前對己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控研究相對較少。在黑曲霉己糖激酶方面，Panneman等［8］發(fā)現(xiàn)黑曲霉已糖激酶受到海藻糖-6-磷酸的抑制，但Arisan-Atac等［9］發(fā)現(xiàn)海藻糖-6-磷酸對黑曲霉已糖激酶的調(diào)控作用較弱，尤其是在檸檬酸發(fā)酵過程中細胞內(nèi)的海藻糖-6-磷酸水平較低（46 μmol/g dw），當敲除海藻糖-6-磷酸合酶后，對檸檬酸發(fā)酵水平影響較小。在黑曲霉丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］通過硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素色譜和凝膠過濾純化了黑曲霉天然丙酮酸激酶，發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸可阻止純化過程中丙酮酸激酶的酶活降低，但對新純化的丙酮酸激酶無顯著影響而ATP有微弱的激活作用；當丙酮酸激酶純化后的樣品儲存3 d，其活性則可被果糖-1，6-二磷酸激活，被ATP抑制。這些研究多以黑曲霉天然已糖激酶與丙酮酸激酶為研究對象，檢測小分子代謝物對其表觀酶活的影響，可能存在內(nèi)源同工酶或小分子代謝物修飾帶來的干擾。

為加深對己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控認識，本研究系統(tǒng)檢測了中心代謝中的小分子代謝物對己糖激酶與丙酮酸激酶的調(diào)控，鑒定出其酶活的關(guān)鍵效應物。然后，進一步利用同源建模獲得黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的三維蛋白結(jié)構(gòu)，利用分子成鍵分析對關(guān)鍵效應物與己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用進行計算機模擬，預測出黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的別構(gòu)調(diào)控位點，旨為后續(xù)黑曲霉代謝工程改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 FastPfu DNA聚合酶與限制性內(nèi)切酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ClonExpress?II一步重組基因克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。GST-BindTM親和層析樹脂購自Merck公司（美國）。果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）、果糖 -1，6-二磷酸（fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP）、丙酮酸（pyruvate）、磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）、草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）、檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、α-酮 戊 二 酸（α-Oxoglutarate，AKG）、ADP、ATP、NADP+、乳酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、來源于木霉的裂解酶均購自Sigma公司（美國）。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與引物 本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒均在本實驗室保存。大腸桿菌Escherichia coli Trans1-T1 菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建。黑曲霉A. niger G1與質(zhì)粒pGm-GST用于己糖激酶與丙酮酸激酶的表達。本研究所用的引物如表1所示。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒與引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組表達質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GSTPkiA的構(gòu)建 從Genbank基因數(shù)據(jù)庫中獲得己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA的核苷酸序列，設計用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物（表1）。然后以高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的基因組為模板，分別以HxkA-F/HxkA-R與PkiA-F/PkiA-R為引物擴增己糖激酶與丙酮酸激酶的基因片段。經(jīng)核酸瓊脂糖電泳檢測后，進行PCR產(chǎn)物純化，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ處理的質(zhì)粒pGm-GST利用ClonExpress? II一步重組基因克隆試劑盒進行目的片段與質(zhì)粒載體的重組，然后熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞。利用菌落PCR與重組表達質(zhì)粒的酶切驗證來篩選陽性克隆，并送金唯智測序驗證，得到重組表達質(zhì)粒pGm-GSTHxkA與pGm-GST-PkiA。

1.2.2 黑曲霉重組表達菌株的構(gòu)建 利用PEG介導的原生質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)化方法將重組表達質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GST-PkiA轉(zhuǎn)化至黑曲霉G1菌株的原生質(zhì)體中。黑曲霉DNA轉(zhuǎn)化方法參考文獻［11］，首先，進行原生質(zhì)體懸液的制備：將G1菌株的孢子懸液在30℃、200 r/min 培養(yǎng)16-18 h。然后采用含有1.0%（W/V）來源于木霉的裂解酶的酶解體系，在37℃孵育2-3 h，裂解菌體的細胞壁以制備原生質(zhì)體。用STC進行洗滌后，獲得原生質(zhì)體懸液。然后，在100 μL原生質(zhì)體中分別加入2 μg重組表達質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GST-PkiA以及25% PEG緩沖液，冰浴后依次加入1 mL 25% PEG緩沖液，加入2 mL STC 和10 mL預熱的MMSA上層培養(yǎng)基，然后平鋪至MMSA下層培養(yǎng)基上，在30℃倒置培養(yǎng)5 d。挑取轉(zhuǎn)化子在CMA固體平板上進行單孢子劃線分純，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。然后，采用天根植物基因組提取試劑盒來提取各轉(zhuǎn)化子的基因組。最后，以各轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以GV-F/GV-R為引物，來篩選陽性黑曲霉重組菌株。

1.2.3 黑曲霉重組酶的表達與純化 將陽性黑曲霉重組菌株的孢子懸液接種到100 mL蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃下200 r/min培養(yǎng)4 d。過濾收集菌體后，用液氮將菌體研磨成粉，然后再加10 mL的PBS蛋白提取液，渦旋振蕩。然后8 000 r/min，4℃離心10 min收集上清，即為蛋白粗提液。

采用GST·BindTM樹脂來對各重組蛋白進行親和層析純化。首先，用10 mL GST 洗滌緩沖液1.5 g/L Na2HPO4·12H2O，0.2 g/L KH2PO4，8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl來平衡GST·BindTM樹脂。然后，向親和層析柱中加入含有重組蛋白的蛋白粗提液，再用GST洗滌液進行洗滌未結(jié)合的蛋白，然后再用含有不同濃度的谷胱甘肽蛋白洗脫液進行洗脫，最后，將洗脫液用10 kD超濾管中超濾。將純化后的蛋白樣品進行12% SDS-PAGE蛋白電泳檢測與Pierce?BCA蛋白濃度定量檢測。

1.2.4 不同小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響 己糖激酶酶活檢測方法參照文獻［12-13］。標準反應體系為50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ATP，0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L葡萄糖，3.5 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶。首先，30℃孵育5 min后，加入適量的己糖激酶重組酶，酶標儀340 nm下檢測反應體系中生成的NADH的吸光值。一單位己糖激酶的酶活力定義為30℃反應條件下，反應體系中每分鐘生成1 μmol NADPH所需的酶量。

丙酮酸激酶酶活力檢測方法參考文獻［12］。標準反應體系為 50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ADP，0.2 mmol/L NADH，1 mmol/L PEP，14 U 乳酸脫氫酶。首先，30℃孵育5 min后，加入適量的丙酮酸激酶重組酶，酶標儀340 nm下檢測反應體系中消耗的NADH的吸光值。一單位丙酮酸激酶的酶活力定義為30℃反應條件下，反應體系中每分鐘消耗1 μmol NADH所需的酶量。

為檢測不同小分子代謝物對重組己糖激酶與丙酮酸激酶的酶活力的影響，在標準反應體系中添加不同濃度的小分子代謝物，然后檢測殘留酶活。小分子代謝物具體包括磷酸-6-果糖、1，6-二磷酸果糖、丙酮酸、PEP、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、富馬酸、ADP與ATP。檢測數(shù)據(jù)采用t-檢驗進行進行顯著性檢驗：與對照相比，當P＜0.05時則表明樣本與對照存在顯著差異，當P＜0.01時則表明樣本與對照存在較為顯著差異。

1.2.5 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的同源建模與小分子代謝物的分子對接 首先，以來源于乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）的己糖激酶的晶體結(jié)構(gòu)［13］（PDB ID：3O4W）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的丙酮酸激酶的晶體結(jié)構(gòu)［14］（PDB ID：1A3W）為模板，利用YASARA軟件［15］分別對黑曲霉的己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA進行同源建模。利用在線分析軟件ESPript3.0［16］（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）進行基于蛋白結(jié)構(gòu)信息的多序列比對分析。然后，利用ChemBiodraw軟件與ChemBio3D軟件繪制小分子代謝物的立體結(jié)構(gòu)，然后在YASARA軟件中分別與己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA進行分子對接與成鍵分析。

2 結(jié)果

2.1 己糖激酶與丙酮酸激酶黑曲霉表達菌株的構(gòu)建

為揭示小分子代謝物對己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控，將高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的己糖激酶與丙酮酸激酶在黑曲霉蛋白表達菌株G1中進行內(nèi)源重組表達。首先，利用PCR擴增獲得高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的己糖激酶基因HxkA與丙酮酸激酶編碼基因PkiA。PCR結(jié)果如圖1-A所示，HxkA基因與PkiA基因的DNA序列理論大小分別為1 798 bp與2 052 bp，PCR擴增結(jié)果與理論大小相一致。然后，用ClonExpress? II試劑盒成功將各基因分別重組至GST融合表達表達質(zhì)粒pGm-GST，成功構(gòu)建了各重組表達質(zhì)粒pGm-GST-HxkA和pGm-GST-PkiA（圖1）。將各重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉G1菌株的原生質(zhì)體中，挑取5個轉(zhuǎn)化子來進行基因組提取后，采用GV-F與GV-R為引物來篩選陽性轉(zhuǎn)化子。HxkA基因與PkiA基因的GST融合蛋白重組表達菌株的PCR驗證產(chǎn)物的理論大小分別為3 052 bp與3 322 bp，如圖1-B所示，AnG1-HxkA1-AnG1-HxkA5與AnG1-PkiA1-AnG1-PkiA5分別為黑曲霉重組表達菌株，選取AnG1-HxkA1與AnG1-PkiA1來進行重組蛋白的表達。

圖1 己糖激酶與丙酮酸激酶黑曲霉重組表達菌株構(gòu)建的PCR擴增電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR products used for the construction of hexokinase（HxkA）and pyruvate kinase（PkiA）expressed A. niger strains

2.2 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的表達與純化

為檢測己糖激酶HxkA基因與丙酮酸激酶PkiA基因能否正確表達，對黑曲霉表達菌株AnG1-HxkA1與AnG1-PkiA1進行蛋白發(fā)酵檢測。如圖2所示，重組GST融合蛋白在蛋白發(fā)酵終點出現(xiàn)顯著積累，HxkA基因與PkiA基因的編碼序列（cDNA序列）理論大小分別為1 473 bp與1 581 bp，各自蛋白的理論大小分別為54 kD與58 kD，因而GST-HxkA與GST-PkiA融合蛋白的理論大小分別為80 kD與84 kD，如圖2所示GST融合蛋白與理論大小相一致，這表明重組GST融合蛋白GST-HxkA與GST-PkiA在黑曲霉中成功表達。

為獲得重組GST融合蛋白，采用GST·BindTM樹脂來對各重組GST融合蛋白進行親和層析純化，如圖2所示，分別獲得純化的重組GST融合蛋白。對純化的重組GST融合蛋白進行酶活測定，發(fā)現(xiàn)GST-HxkA與GST-PkiA的比酶活分別為（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg。

圖2 己糖激酶與丙酮酸激酶GST融合蛋白親和層析純化前后的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the recombinant GST-fused HxkA and PkiA proteins before and after protein purification by affinity chromatography

2.3 不同小分子代謝物對己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響

為研究小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響，首先檢測了在1 mmol/L 小分子代謝物條件下HxkA與PkiA酶活的變化。結(jié)果如圖3所示，HxkA受4種小分子代謝物的抑制，兩種小分子代謝物的激活。在果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP存在時，HxkA酶活受到顯著的抑制，殘留酶活分別為81.75%±1.67%、71.97%±0.95%、75.60%±1.88%與50.89%±2.78%。在草酰乙酸和異檸檬酸存在時，HxkA酶活受到一定的激活，殘留酶活分別為112.30%±1.14%與109.34%±1.04%。而PkiA受3種小分子代謝物的抑制與一種小分子代謝物的激活。在果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸存在時，PkiA酶活受到顯著的抑制，殘留酶 活 分 別 為56.51%±1.04%、88.45%±3.09%與83.54%±2.47%。僅在ADP存在時，PkiA酶活受到顯著的激活，殘留酶活提高至179.36%±3.47%。

圖3 小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶酶活（B）影響的檢測結(jié)果Fig. 3 Effects of metabolites on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

為進一步驗證小分子代謝物對己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響，檢測了不同濃度小分子代謝物存在時HxkA與PkiA酶活的變化。由于在檸檬酸生產(chǎn)菌株中，檸檬酸的生理濃度為1-5 mmol/L［3］，每摩爾檸檬酸凈生成等摩爾的ATP，由此借鑒，本文檢測了0、0.5、2.5、5、7.5、10 mmol/L的小分子代謝物對HxkA與PkiA酶活的影響。結(jié)果如圖4所示，不同濃度的果糖-6-磷酸、異檸檬酸與草酰乙酸對HxkA酶活影響幅度相對較小，而不同濃度的PEP、ATP與ADP對HxkA酶活的影響顯著。隨PEP、ATP與ADP濃度的提高，HxkA酶活顯著下降。在2.5 mmol/L濃度的PEP、ATP與ADP下，HxkA殘留酶活分別為66.67%±1.28%（P=0.014）、5.49%±0.47%（P=0.003）與41.74%±0.97%（P=0.011）；在10 mmol/L濃度的PEP、ATP與ADP下，HxkA殘留酶活分別為0.85%±0.42%（P=0.003）、0.08%±0.02%（P=0.000 1）與23.33%±0.03%（P=0.000 2）。對于PkiA而言，不同濃度的ADP對PkiA酶活具有顯著的激活作用，在2.5 mmol/L下，酶活提高1.38倍（P=0.039）；至5 mmol/L時，PkiA酶活提高1.55倍（P=8.7E-05）；但濃度進一步提高時，PkiA酶活提高幅度則出現(xiàn)下降。而3種抑制小分子代謝物則隨濃度的提高對PkiA的抑制效果逐漸增強。在2.5 mmol/L濃度的果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸下，PkiA殘留酶活分別為97.21%±1.08%、89.30%±1.55%與81.24%±0.31%；在10 mmol/L濃度的果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸下，PkiA殘留酶活分別為84.19%±1.09%、83.72%±1.46%與73.64%±3.21%。

圖4 不同濃度的關(guān)鍵小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶酶活（B）影響的檢測結(jié)果Fig.4 Effects of key metabolites under different concentrations on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

2.4 關(guān)鍵小分子代謝物與己糖激酶與丙酮酸激酶的互作模擬分析

為揭示關(guān)鍵小分子代謝物對己糖激酶和丙酮酸激酶的作用機制，首先利用同源建模模擬HxkA和PkiA的三維結(jié)構(gòu)。首先，通過在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫PDB中進行蛋白序列比對來選取同源建模的蛋白結(jié)構(gòu)模板。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HxkA和K. lactis來源的己糖激酶KlHxkA的蛋白同源性最高，序列相似性為27.6%；PkiA和S. cerevisiae 來源的丙酮酸激酶ScPkiA的蛋白同源性最高，序列相似性為34.0%（圖5）。因此，分別以KlHxkA（PBD ID：3O4W）與ScPkiA（PBD ID：1A3W）的晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用同源建模獲得HxkA和PkiA的三維蛋白結(jié)構(gòu)（圖6）。具體來看，如圖6所示，HxkA為同源二聚體，而PkiA為同源四聚體。具體而言，HxkA各亞基中分別包括小的頭部結(jié)構(gòu)域（head-domain）與大的尾部結(jié)構(gòu)域（tail-domain），并兩個亞基以“頭-尾”相連的方式形成對稱的同源二聚體，HxkA的底物葡萄糖結(jié)合位點分別為Asn210、Asp211、Thr212、Gly235、Glu266與Glu299（圖5）。黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的各亞基中具有A-結(jié)構(gòu)域（TIM-barrel）、B-結(jié)構(gòu)域（lid-domain）與C-結(jié)構(gòu)域（allosteric-domain）3個結(jié)構(gòu)域，活性位點分別為Arg63、Asn65、Asp98、Phe228、Lys254、Glu256、Asp280與 Thr325，位于A-結(jié)構(gòu)域與B-結(jié)構(gòu)域之間（圖5、圖6），PkiA四個亞基分別以A/A′與C/C′的方式形成同源四聚體。

圖5 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的多序列比對結(jié)果Fig.5 Multiple sequence alignment of HxkA and PkiA from A. niger

圖6 基于同源建模的黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶（B）三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果Fig.6 Simulated 3D structure results of HxkA（A）and PkiA（B）from A. niger based on homologous modeling

為進一步解析關(guān)鍵小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用，利用YASARA軟件對關(guān)鍵小分子代謝物與HxkA和PkiA進行分子對接與成鍵分析。如圖7所示，黑曲霉己糖激酶HxkA與具有抑制關(guān)鍵小分子代謝物果糖-6-磷酸、PEP、ATP與ADP的互作位點均位于底物葡萄糖結(jié)合口袋附近，并且具有較強抑制活性的PEP、ATP與ADP都與關(guān)鍵底物結(jié)合位點Asn210形成氫鍵。具體而言，ADP與關(guān)鍵底物結(jié)合位點Asn210形成一個氫鍵，PEP與ATP則分別與該位點形成2個與3個氫鍵，而具有較弱抑制作用的果糖-6-磷酸則未與該位點形成氫鍵，這表明Asn210與關(guān)鍵小分子代謝物的結(jié)合強弱可能參與關(guān)鍵小分子代謝物對HxkA酶活的抑制程度。果糖-6-磷酸與HxkA的Asn66 和Asn264形成氫鍵；PEP與HxkA的Asn66、Ala161、Asn210和Asn264形成氫鍵；ADP與HxkA的Ala161、Asn210和Asn264形成氫鍵。由此推測，位于底物結(jié)合口袋附近的Asn66、Ala161和Asn264也可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要位點。與果糖-6-磷酸、PEP與ADP的互作位點方向不同，ATP則與HxkA的Thr175、Lys176、Asn210和Asn237形成氫鍵，也表明底物結(jié)合口袋另一側(cè)的Thr175、Lys176與Asn237也可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要位點。

圖7 己糖激酶HxkA與關(guān)鍵小分子代謝物的分子對接模擬結(jié)果Fig.7 Molecular docking simulation of HxkA with key metabolites

丙酮酸激酶催化PEP與ADP生成丙酮酸與ATP。如上文所述，底物ADP對PkiA的活性具有顯著的前饋激活作用，而果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸則具有一定的抑制作用。如圖8所示，底物ADP與抑制關(guān)鍵小分子代謝物分別結(jié)合于不同的結(jié)構(gòu)域。ADP與PkiA的結(jié)合位點位于A-結(jié)構(gòu)域與B-結(jié)構(gòu)域之間的催化活性位點附近，分別與Asn65、His68、Asp161、Gln313和Glu316形成氫鍵。而果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸這些關(guān)鍵小分子代謝物則結(jié)合于別構(gòu)效應結(jié)構(gòu)域C-結(jié)構(gòu)域。具體來看，果糖-1，6-磷酸與PkiA的 Thr416、Thr417、Ser418、Arg477、Trp470和Gly508各形成一個氫鍵；蘋果酸分別與Thr416和Thr417形成一個和兩個氫鍵；富馬酸也分別與Thr417、Trp470和Gly502形成一個氫鍵。

圖8 丙酮酸激酶PkiA與關(guān)鍵小分子代謝物的分子對接模擬結(jié)果Fig.8 Molecular docking simulation of PkiA and key metabolites

3 討論

黑曲霉是檸檬酸的主力生產(chǎn)菌株，可快速轉(zhuǎn)化粗放的淀粉等碳源大量積累檸檬酸［1，3］。黑曲霉的中心代謝尤其是糖酵解途徑具有獨特的代謝調(diào)控機制以實現(xiàn)檸檬酸的不斷合成與分泌［1，3-4］。糖酵解途徑存在由己糖激酶、磷酸果糖激酶與丙酮酸激酶催化3個不可逆反應，成為調(diào)控糖酵解途徑的主要靶點。黑曲霉中磷酸果糖激酶受高濃度的ATP與檸檬酸的抑制，但這種抑制可通過體內(nèi)的2，6-二磷酸果糖與NH4+的激活作用而解除。目前在黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的代謝調(diào)控研究相對較少。雖然有文獻報道黑曲霉己糖激酶受體內(nèi)海藻糖-6-磷酸的抑制［8］，但僅在檸檬酸發(fā)酵初期檢測到較低水平的海藻糖-6-磷酸，推測這種調(diào)控作用相對較小［9］。在丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］檢測發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸可能對黑曲霉直接純化丙酮酸激酶的有一定的激活作用，但這一結(jié)果會受蛋白純化與儲存時間的影響。為加深對這兩個關(guān)鍵酶的代謝調(diào)控的認識，本文系統(tǒng)檢測13種中心代謝途徑中的小分子代謝物對其酶活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)己糖激酶的酶活受高濃度PEP、ATP與ADP的顯著抑制，而丙酮酸激酶的酶活則被果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸的小幅度抑制，被底物ADP顯著激活。

在細胞工廠的代謝改造中，對于糖酵解途徑的改造，除加強關(guān)鍵酶的表達來提高代謝通量［17］外，解除小分子代謝物對關(guān)鍵酶的抑制是較為重要的改造策略［18］。這一策略中小分子代謝物與關(guān)鍵酶的互作位點的發(fā)現(xiàn)是首要步驟。對于尚無蛋白晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶來說，蛋白結(jié)構(gòu)的同源建模與分子對接成為有效的分析手段來推測參與關(guān)鍵小分子代謝物互作的關(guān)鍵氨基酸位點。本文首先利用同源建模模擬獲得了HxkA和PkiA的三維結(jié)構(gòu)，然后利用YASARA軟件進行分子對接與成鍵分析，為解析關(guān)鍵小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用與調(diào)控機制提供參考。通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬與成鍵分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉己糖激酶HxkA的具有抑制關(guān)鍵小分子代謝物果糖-6-磷酸、PEP、ATP與ADP的互作位點均位于底物葡萄糖結(jié)合口袋附近，并且具有較強抑制活性的PEP、ATP與ADP都與關(guān)鍵底物結(jié)合位點Asn210形成氫鍵。黑曲霉HxkA的 Asn210 與 K. lactis來 源 的 KlHxk1 的 Asn209［14］相對應，是底物葡萄糖的重要結(jié)合位點。KlHxk1存在開放構(gòu)象（open-state）與閉合構(gòu)象（closedstate）這兩種構(gòu)象。在開放構(gòu)象中，葡萄糖分子與Asn209，Asp210，Thr211，Glu268與Glu301的側(cè)鏈以及Gly234的主鏈形成氫鍵，在閉合構(gòu)象中，位于KlHxk1小亞基兩個loop上的Thr174與Lys175會進一步與葡萄糖形成氫鍵［14］。本文預測發(fā)現(xiàn)果糖-6-磷酸、PEP與ADP結(jié)合于HxkA的底物結(jié)合口袋附近的Asn66、Asn210、Ala161和Asn264，而ATP則與Thr175、Lys176、Asn210和Asn237 形成氫鍵。通過與KlHxk1的氨基酸比對分析推測，ATP可能通過影響閉合構(gòu)象中葡萄糖與Thr175、Lys176氫鍵的形成而抑制HxkA的功能。

丙酮酸激酶是糖酵解途徑中最后一步反應，催化PEP與ADP生成丙酮酸與ATP［12］。丙酮酸激酶的結(jié)構(gòu)相對復雜為同源四聚體，每個單體有3個結(jié)構(gòu)域，存在較為典型的別構(gòu)調(diào)控，當與激活劑結(jié)合時，會從較為緊實無活性的構(gòu)象（T-state）轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為松散的有活性的構(gòu)象（R-state），當與抑制劑合時則發(fā)逆向的別構(gòu)變化［15，19-21］。Jurica 等［15］發(fā)現(xiàn)酵母丙酮酸激酶YPK受果糖-1，6-二磷酸的別構(gòu)激活，YPK中果糖-1，6-二磷酸的結(jié)合位點位于C結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的 Ser402、Ser404、Thr407、Asp455、Arg459與Trp452，結(jié)合前后的lys446到Trp452位的loop區(qū)域與Ala487到Asn493的轉(zhuǎn)角區(qū)域的變化而進一步導致YPK構(gòu)象變化［15］。本文發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸對黑曲霉丙酮酸激酶PkiA則具有小幅的抑制作用，但互作位點類似，Thr416、Thr417、Ser418與果糖-1，6-二磷酸的磷酸基團形成氫鍵，Trp470與果糖-1，6-二磷酸的呋喃糖基團形成氫鍵，推測果糖-1，6-二磷酸等關(guān)鍵小分子代謝物的結(jié)合也可能導致β17與α17之間從Glu460到Trp470的柔性loop區(qū)域以及β18與β19之間從Gly505到Asn511的轉(zhuǎn)角區(qū)域的構(gòu)象協(xié)同變化。此外，蘋果酸分別與Thr416和Thr417形成一個和兩個氫鍵；富馬酸也分別與Thr417、Trp470和Gly502形成一個氫鍵。由此推測，黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的Thr416、Thr417與Trp470可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要結(jié)合位點。本文細致分析中心代謝中的小分子代謝物對黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的酶活影響并預測了其調(diào)控位點，為黑曲霉細胞工廠的代謝調(diào)控改造提供借鑒。

4 結(jié)論

本文構(gòu)建了黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的過表達菌株，利用GST親和層析進行重組蛋白的純化，獲得比酶活分別為（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg的己糖激酶和丙酮酸激酶。通過中心代謝途徑中的小分子代謝物對重組蛋白的酶活影響檢測，發(fā)現(xiàn)果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP對黑曲霉己糖激酶存在抑制作用，果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸對丙酮酸激酶有抑制作用，而ADP對黑曲霉丙酮酸激酶具有顯著激活作用。利用蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模及蛋白與小分子代謝物互作的成鍵分析，發(fā)現(xiàn)己糖激酶底物口袋的Asn210位點及其附近氨基酸可能為參與別構(gòu)調(diào)控的關(guān)鍵氨基酸，丙酮酸激酶別構(gòu)結(jié)構(gòu)域的Thr416、Thr417與Trp470參與別構(gòu)調(diào)控小分子代謝物的互作。

致謝

衷心感謝趙晶老師與譚子瑊在蛋白結(jié)構(gòu)模擬與分子對接分析上給予的幫助，衷心感謝德國柏林理工大學Dr. Timothy C. Cairns對英文摘要的修改與潤色。