孟曉建 于建東 鄭小梅，4 鄭平，4 李志敏 孫際賓，4葉勤

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 中國(guó)科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308；3. 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308；4. 國(guó)家合成生物技術(shù)創(chuàng)新中心，天津 300308）

檸檬酸是當(dāng)前世界上產(chǎn)量和消費(fèi)量最大的有機(jī)酸，廣泛用于食品飲料、醫(yī)藥化工和有機(jī)材料等領(lǐng)域［1］。目前，檸檬酸的全球年產(chǎn)量達(dá)到200萬(wàn)t以上，并以每年3.5%-4.0%的速度增加［2］。黑曲霉是檸檬酸的主力生產(chǎn)菌株，具有極端耐酸性，能夠在pH低至1.5下正常生長(zhǎng)發(fā)酵，具有強(qiáng)魯棒性，可快速利用工業(yè)粗原料大量積累檸檬酸［1］。黑曲霉獨(dú)特的檸檬酸合成與積累能力表明其具有一套獨(dú)特的代謝調(diào)控機(jī)制。目前已有許多相關(guān)研究致力于黑曲霉檸檬酸代謝中的關(guān)鍵調(diào)控作用，以期揭示黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸的機(jī)理［1，3-4］。黑曲霉檸檬酸合成代謝主要是六碳糖經(jīng)過(guò)糖酵解或者磷酸戊糖途徑轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸進(jìn)而降解為丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰CoA，另一方面固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸與乙酰CoA縮合生成檸檬酸。在大多數(shù)生物體中，檸檬酸合成后會(huì)進(jìn)一步代謝生成其他物質(zhì)供生物體利用，不會(huì)過(guò)量積累。但黑曲霉檸檬酸合成代謝中存在一系列受調(diào)控的關(guān)鍵酶，有效地保障了糖酵解途徑的暢通，同時(shí)阻斷了三羧酸循環(huán)中的檸檬酸下游降解，使得檸檬酸得以大量積累。其中，糖酵解途徑的調(diào)節(jié)是黑曲霉檸檬酸積累的重要調(diào)控機(jī)制［5］。

在糖酵解途徑中，己糖激酶、磷酸果糖激酶與丙酮酸激酶是3個(gè)重要的關(guān)鍵酶。在多數(shù)生物中，磷酸果糖激酶是控制糖酵解代謝流量的關(guān)鍵酶，會(huì)受檸檬酸的反饋抑制，因此黑曲霉的磷酸果糖激酶的調(diào)控也備受關(guān)注。黑曲霉磷酸果糖激酶PfkA被高濃度的ATP、Mn2+與檸檬酸所抑制，但被NH4+、Zn2+、Mg2+與果糖 -2，6-二磷酸所激活［6-7］。但相對(duì)而言，目前對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控研究相對(duì)較少。在黑曲霉己糖激酶方面，Panneman等［8］發(fā)現(xiàn)黑曲霉已糖激酶受到海藻糖-6-磷酸的抑制，但Arisan-Atac等［9］發(fā)現(xiàn)海藻糖-6-磷酸對(duì)黑曲霉已糖激酶的調(diào)控作用較弱，尤其是在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的海藻糖-6-磷酸水平較低（46 μmol/g dw），當(dāng)敲除海藻糖-6-磷酸合酶后，對(duì)檸檬酸發(fā)酵水平影響較小。在黑曲霉丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］通過(guò)硫酸銨沉淀、DEAE-纖維素色譜和凝膠過(guò)濾純化了黑曲霉天然丙酮酸激酶，發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸可阻止純化過(guò)程中丙酮酸激酶的酶活降低，但對(duì)新純化的丙酮酸激酶無(wú)顯著影響而ATP有微弱的激活作用；當(dāng)丙酮酸激酶純化后的樣品儲(chǔ)存3 d，其活性則可被果糖-1，6-二磷酸激活，被ATP抑制。這些研究多以黑曲霉天然已糖激酶與丙酮酸激酶為研究對(duì)象，檢測(cè)小分子代謝物對(duì)其表觀酶活的影響，可能存在內(nèi)源同工酶或小分子代謝物修飾帶來(lái)的干擾。

為加深對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控認(rèn)識(shí)，本研究系統(tǒng)檢測(cè)了中心代謝中的小分子代謝物對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶的調(diào)控，鑒定出其酶活的關(guān)鍵效應(yīng)物。然后，進(jìn)一步利用同源建模獲得黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的三維蛋白結(jié)構(gòu)，利用分子成鍵分析對(duì)關(guān)鍵效應(yīng)物與己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬，預(yù)測(cè)出黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的別構(gòu)調(diào)控位點(diǎn)，旨為后續(xù)黑曲霉代謝工程改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 FastPfu DNA聚合酶與限制性內(nèi)切酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。ClonExpress?II一步重組基因克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。GST-BindTM親和層析樹脂購(gòu)自Merck公司（美國(guó)）。果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）、果糖 -1，6-二磷酸（fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP）、丙酮酸（pyruvate）、磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）、草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）、檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、α-酮 戊 二 酸（α-Oxoglutarate，AKG）、ADP、ATP、NADP+、乳酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、來(lái)源于木霉的裂解酶均購(gòu)自Sigma公司（美國(guó)）。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與引物 本研究所使用的所有菌株和質(zhì)粒均在本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌Escherichia coli Trans1-T1 菌株購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。黑曲霉A. niger G1與質(zhì)粒pGm-GST用于己糖激酶與丙酮酸激酶的表達(dá)。本研究所用的引物如表1所示。

表1 本研究所用的菌株、質(zhì)粒與引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GSTPkiA的構(gòu)建 從Genbank基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA的核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物（表1）。然后以高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌株的基因組為模板，分別以HxkA-F/HxkA-R與PkiA-F/PkiA-R為引物擴(kuò)增己糖激酶與丙酮酸激酶的基因片段。經(jīng)核酸瓊脂糖電泳檢測(cè)后，進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，再與經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ處理的質(zhì)粒pGm-GST利用ClonExpress? II一步重組基因克隆試劑盒進(jìn)行目的片段與質(zhì)粒載體的重組，然后熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞。利用菌落PCR與重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，并送金唯智測(cè)序驗(yàn)證，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-GSTHxkA與pGm-GST-PkiA。

1.2.2 黑曲霉重組表達(dá)菌株的構(gòu)建 利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)化方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GST-PkiA轉(zhuǎn)化至黑曲霉G1菌株的原生質(zhì)體中。黑曲霉DNA轉(zhuǎn)化方法參考文獻(xiàn)［11］，首先，進(jìn)行原生質(zhì)體懸液的制備：將G1菌株的孢子懸液在30℃、200 r/min 培養(yǎng)16-18 h。然后采用含有1.0%（W/V）來(lái)源于木霉的裂解酶的酶解體系，在37℃孵育2-3 h，裂解菌體的細(xì)胞壁以制備原生質(zhì)體。用STC進(jìn)行洗滌后，獲得原生質(zhì)體懸液。然后，在100 μL原生質(zhì)體中分別加入2 μg重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-GST-HxkA與pGm-GST-PkiA以及25% PEG緩沖液，冰浴后依次加入1 mL 25% PEG緩沖液，加入2 mL STC 和10 mL預(yù)熱的MMSA上層培養(yǎng)基，然后平鋪至MMSA下層培養(yǎng)基上，在30℃倒置培養(yǎng)5 d。挑取轉(zhuǎn)化子在CMA固體平板上進(jìn)行單孢子劃線分純，以獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。然后，采用天根植物基因組提取試劑盒來(lái)提取各轉(zhuǎn)化子的基因組。最后，以各轉(zhuǎn)化子基因組為模板，以GV-F/GV-R為引物，來(lái)篩選陽(yáng)性黑曲霉重組菌株。

1.2.3 黑曲霉重組酶的表達(dá)與純化 將陽(yáng)性黑曲霉重組菌株的孢子懸液接種到100 mL蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃下200 r/min培養(yǎng)4 d。過(guò)濾收集菌體后，用液氮將菌體研磨成粉，然后再加10 mL的PBS蛋白提取液，渦旋振蕩。然后8 000 r/min，4℃離心10 min收集上清，即為蛋白粗提液。

采用GST·BindTM樹脂來(lái)對(duì)各重組蛋白進(jìn)行親和層析純化。首先，用10 mL GST 洗滌緩沖液1.5 g/L Na2HPO4·12H2O，0.2 g/L KH2PO4，8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl來(lái)平衡GST·BindTM樹脂。然后，向親和層析柱中加入含有重組蛋白的蛋白粗提液，再用GST洗滌液進(jìn)行洗滌未結(jié)合的蛋白，然后再用含有不同濃度的谷胱甘肽蛋白洗脫液進(jìn)行洗脫，最后，將洗脫液用10 kD超濾管中超濾。將純化后的蛋白樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)與Pierce?BCA蛋白濃度定量檢測(cè)。

1.2.4 不同小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響 己糖激酶酶活檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)［12-13］。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ATP，0.4 mmol/L NADP+，4 mmol/L葡萄糖，3.5 U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶。首先，30℃孵育5 min后，加入適量的己糖激酶重組酶，酶標(biāo)儀340 nm下檢測(cè)反應(yīng)體系中生成的NADH的吸光值。一單位己糖激酶的酶活力定義為30℃反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系中每分鐘生成1 μmol NADPH所需的酶量。

丙酮酸激酶酶活力檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)［12］。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系為 50 mmol/L Tis-HCl（pH 7.5），5 mmol/L MgSO4·6H2O，100 mmol/L KCl，2 mmol/L ADP，0.2 mmol/L NADH，1 mmol/L PEP，14 U 乳酸脫氫酶。首先，30℃孵育5 min后，加入適量的丙酮酸激酶重組酶，酶標(biāo)儀340 nm下檢測(cè)反應(yīng)體系中消耗的NADH的吸光值。一單位丙酮酸激酶的酶活力定義為30℃反應(yīng)條件下，反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 μmol NADH所需的酶量。

為檢測(cè)不同小分子代謝物對(duì)重組己糖激酶與丙酮酸激酶的酶活力的影響，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中添加不同濃度的小分子代謝物，然后檢測(cè)殘留酶活。小分子代謝物具體包括磷酸-6-果糖、1，6-二磷酸果糖、丙酮酸、PEP、草酰乙酸、檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、富馬酸、ADP與ATP。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)：與對(duì)照相比，當(dāng)P＜0.05時(shí)則表明樣本與對(duì)照存在顯著差異，當(dāng)P＜0.01時(shí)則表明樣本與對(duì)照存在較為顯著差異。

1.2.5 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的同源建模與小分子代謝物的分子對(duì)接 首先，以來(lái)源于乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis）的己糖激酶的晶體結(jié)構(gòu)［13］（PDB ID：3O4W）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的丙酮酸激酶的晶體結(jié)構(gòu)［14］（PDB ID：1A3W）為模板，利用YASARA軟件［15］分別對(duì)黑曲霉的己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA進(jìn)行同源建模。利用在線分析軟件ESPript3.0［16］（http：//espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/）進(jìn)行基于蛋白結(jié)構(gòu)信息的多序列比對(duì)分析。然后，利用ChemBiodraw軟件與ChemBio3D軟件繪制小分子代謝物的立體結(jié)構(gòu)，然后在YASARA軟件中分別與己糖激酶HxkA與丙酮酸激酶PkiA進(jìn)行分子對(duì)接與成鍵分析。

2 結(jié)果

2.1 己糖激酶與丙酮酸激酶黑曲霉表達(dá)菌株的構(gòu)建

為揭示小分子代謝物對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶的代謝調(diào)控，將高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的己糖激酶與丙酮酸激酶在黑曲霉蛋白表達(dá)菌株G1中進(jìn)行內(nèi)源重組表達(dá)。首先，利用PCR擴(kuò)增獲得高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉的己糖激酶基因HxkA與丙酮酸激酶編碼基因PkiA。PCR結(jié)果如圖1-A所示，HxkA基因與PkiA基因的DNA序列理論大小分別為1 798 bp與2 052 bp，PCR擴(kuò)增結(jié)果與理論大小相一致。然后，用ClonExpress? II試劑盒成功將各基因分別重組至GST融合表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒pGm-GST，成功構(gòu)建了各重組表達(dá)質(zhì)粒pGm-GST-HxkA和pGm-GST-PkiA（圖1）。將各重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入黑曲霉G1菌株的原生質(zhì)體中，挑取5個(gè)轉(zhuǎn)化子來(lái)進(jìn)行基因組提取后，采用GV-F與GV-R為引物來(lái)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。HxkA基因與PkiA基因的GST融合蛋白重組表達(dá)菌株的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物的理論大小分別為3 052 bp與3 322 bp，如圖1-B所示，AnG1-HxkA1-AnG1-HxkA5與AnG1-PkiA1-AnG1-PkiA5分別為黑曲霉重組表達(dá)菌株，選取AnG1-HxkA1與AnG1-PkiA1來(lái)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。

圖1 己糖激酶與丙酮酸激酶黑曲霉重組表達(dá)菌株構(gòu)建的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of PCR products used for the construction of hexokinase（HxkA）and pyruvate kinase（PkiA）expressed A. niger strains

2.2 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的表達(dá)與純化

為檢測(cè)己糖激酶HxkA基因與丙酮酸激酶PkiA基因能否正確表達(dá)，對(duì)黑曲霉表達(dá)菌株AnG1-HxkA1與AnG1-PkiA1進(jìn)行蛋白發(fā)酵檢測(cè)。如圖2所示，重組GST融合蛋白在蛋白發(fā)酵終點(diǎn)出現(xiàn)顯著積累，HxkA基因與PkiA基因的編碼序列（cDNA序列）理論大小分別為1 473 bp與1 581 bp，各自蛋白的理論大小分別為54 kD與58 kD，因而GST-HxkA與GST-PkiA融合蛋白的理論大小分別為80 kD與84 kD，如圖2所示GST融合蛋白與理論大小相一致，這表明重組GST融合蛋白GST-HxkA與GST-PkiA在黑曲霉中成功表達(dá)。

為獲得重組GST融合蛋白，采用GST·BindTM樹脂來(lái)對(duì)各重組GST融合蛋白進(jìn)行親和層析純化，如圖2所示，分別獲得純化的重組GST融合蛋白。對(duì)純化的重組GST融合蛋白進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)GST-HxkA與GST-PkiA的比酶活分別為（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg。

圖2 己糖激酶與丙酮酸激酶GST融合蛋白親和層析純化前后的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of the recombinant GST-fused HxkA and PkiA proteins before and after protein purification by affinity chromatography

2.3 不同小分子代謝物對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響

為研究小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響，首先檢測(cè)了在1 mmol/L 小分子代謝物條件下HxkA與PkiA酶活的變化。結(jié)果如圖3所示，HxkA受4種小分子代謝物的抑制，兩種小分子代謝物的激活。在果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP存在時(shí)，HxkA酶活受到顯著的抑制，殘留酶活分別為81.75%±1.67%、71.97%±0.95%、75.60%±1.88%與50.89%±2.78%。在草酰乙酸和異檸檬酸存在時(shí)，HxkA酶活受到一定的激活，殘留酶活分別為112.30%±1.14%與109.34%±1.04%。而PkiA受3種小分子代謝物的抑制與一種小分子代謝物的激活。在果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸存在時(shí)，PkiA酶活受到顯著的抑制，殘留酶 活 分 別 為56.51%±1.04%、88.45%±3.09%與83.54%±2.47%。僅在ADP存在時(shí)，PkiA酶活受到顯著的激活，殘留酶活提高至179.36%±3.47%。

圖3 小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶酶活（B）影響的檢測(cè)結(jié)果Fig. 3 Effects of metabolites on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

為進(jìn)一步驗(yàn)證小分子代謝物對(duì)己糖激酶與丙酮酸激酶酶活的影響，檢測(cè)了不同濃度小分子代謝物存在時(shí)HxkA與PkiA酶活的變化。由于在檸檬酸生產(chǎn)菌株中，檸檬酸的生理濃度為1-5 mmol/L［3］，每摩爾檸檬酸凈生成等摩爾的ATP，由此借鑒，本文檢測(cè)了0、0.5、2.5、5、7.5、10 mmol/L的小分子代謝物對(duì)HxkA與PkiA酶活的影響。結(jié)果如圖4所示，不同濃度的果糖-6-磷酸、異檸檬酸與草酰乙酸對(duì)HxkA酶活影響幅度相對(duì)較小，而不同濃度的PEP、ATP與ADP對(duì)HxkA酶活的影響顯著。隨PEP、ATP與ADP濃度的提高，HxkA酶活顯著下降。在2.5 mmol/L濃度的PEP、ATP與ADP下，HxkA殘留酶活分別為66.67%±1.28%（P=0.014）、5.49%±0.47%（P=0.003）與41.74%±0.97%（P=0.011）；在10 mmol/L濃度的PEP、ATP與ADP下，HxkA殘留酶活分別為0.85%±0.42%（P=0.003）、0.08%±0.02%（P=0.000 1）與23.33%±0.03%（P=0.000 2）。對(duì)于PkiA而言，不同濃度的ADP對(duì)PkiA酶活具有顯著的激活作用，在2.5 mmol/L下，酶活提高1.38倍（P=0.039）；至5 mmol/L時(shí)，PkiA酶活提高1.55倍（P=8.7E-05）；但濃度進(jìn)一步提高時(shí)，PkiA酶活提高幅度則出現(xiàn)下降。而3種抑制小分子代謝物則隨濃度的提高對(duì)PkiA的抑制效果逐漸增強(qiáng)。在2.5 mmol/L濃度的果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸下，PkiA殘留酶活分別為97.21%±1.08%、89.30%±1.55%與81.24%±0.31%；在10 mmol/L濃度的果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸下，PkiA殘留酶活分別為84.19%±1.09%、83.72%±1.46%與73.64%±3.21%。

圖4 不同濃度的關(guān)鍵小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶酶活（B）影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Effects of key metabolites under different concentrations on the activities of HxkA（A）and PkiA（B）in A. niger

2.4 關(guān)鍵小分子代謝物與己糖激酶與丙酮酸激酶的互作模擬分析

為揭示關(guān)鍵小分子代謝物對(duì)己糖激酶和丙酮酸激酶的作用機(jī)制，首先利用同源建模模擬HxkA和PkiA的三維結(jié)構(gòu)。首先，通過(guò)在蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB中進(jìn)行蛋白序列比對(duì)來(lái)選取同源建模的蛋白結(jié)構(gòu)模板。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HxkA和K. lactis來(lái)源的己糖激酶KlHxkA的蛋白同源性最高，序列相似性為27.6%；PkiA和S. cerevisiae 來(lái)源的丙酮酸激酶ScPkiA的蛋白同源性最高，序列相似性為34.0%（圖5）。因此，分別以KlHxkA（PBD ID：3O4W）與ScPkiA（PBD ID：1A3W）的晶體結(jié)構(gòu)為模板，利用同源建模獲得HxkA和PkiA的三維蛋白結(jié)構(gòu)（圖6）。具體來(lái)看，如圖6所示，HxkA為同源二聚體，而PkiA為同源四聚體。具體而言，HxkA各亞基中分別包括小的頭部結(jié)構(gòu)域（head-domain）與大的尾部結(jié)構(gòu)域（tail-domain），并兩個(gè)亞基以“頭-尾”相連的方式形成對(duì)稱的同源二聚體，HxkA的底物葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)分別為Asn210、Asp211、Thr212、Gly235、Glu266與Glu299（圖5）。黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的各亞基中具有A-結(jié)構(gòu)域（TIM-barrel）、B-結(jié)構(gòu)域（lid-domain）與C-結(jié)構(gòu)域（allosteric-domain）3個(gè)結(jié)構(gòu)域，活性位點(diǎn)分別為Arg63、Asn65、Asp98、Phe228、Lys254、Glu256、Asp280與 Thr325，位于A-結(jié)構(gòu)域與B-結(jié)構(gòu)域之間（圖5、圖6），PkiA四個(gè)亞基分別以A/A′與C/C′的方式形成同源四聚體。

圖5 黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的多序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Multiple sequence alignment of HxkA and PkiA from A. niger

圖6 基于同源建模的黑曲霉己糖激酶（A）與丙酮酸激酶（B）三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果Fig.6 Simulated 3D structure results of HxkA（A）and PkiA（B）from A. niger based on homologous modeling

為進(jìn)一步解析關(guān)鍵小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用，利用YASARA軟件對(duì)關(guān)鍵小分子代謝物與HxkA和PkiA進(jìn)行分子對(duì)接與成鍵分析。如圖7所示，黑曲霉己糖激酶HxkA與具有抑制關(guān)鍵小分子代謝物果糖-6-磷酸、PEP、ATP與ADP的互作位點(diǎn)均位于底物葡萄糖結(jié)合口袋附近，并且具有較強(qiáng)抑制活性的PEP、ATP與ADP都與關(guān)鍵底物結(jié)合位點(diǎn)Asn210形成氫鍵。具體而言，ADP與關(guān)鍵底物結(jié)合位點(diǎn)Asn210形成一個(gè)氫鍵，PEP與ATP則分別與該位點(diǎn)形成2個(gè)與3個(gè)氫鍵，而具有較弱抑制作用的果糖-6-磷酸則未與該位點(diǎn)形成氫鍵，這表明Asn210與關(guān)鍵小分子代謝物的結(jié)合強(qiáng)弱可能參與關(guān)鍵小分子代謝物對(duì)HxkA酶活的抑制程度。果糖-6-磷酸與HxkA的Asn66 和Asn264形成氫鍵；PEP與HxkA的Asn66、Ala161、Asn210和Asn264形成氫鍵；ADP與HxkA的Ala161、Asn210和Asn264形成氫鍵。由此推測(cè)，位于底物結(jié)合口袋附近的Asn66、Ala161和Asn264也可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要位點(diǎn)。與果糖-6-磷酸、PEP與ADP的互作位點(diǎn)方向不同，ATP則與HxkA的Thr175、Lys176、Asn210和Asn237形成氫鍵，也表明底物結(jié)合口袋另一側(cè)的Thr175、Lys176與Asn237也可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要位點(diǎn)。

圖7 己糖激酶HxkA與關(guān)鍵小分子代謝物的分子對(duì)接模擬結(jié)果Fig.7 Molecular docking simulation of HxkA with key metabolites

丙酮酸激酶催化PEP與ADP生成丙酮酸與ATP。如上文所述，底物ADP對(duì)PkiA的活性具有顯著的前饋激活作用，而果糖-1，6-磷酸、蘋果酸和富馬酸則具有一定的抑制作用。如圖8所示，底物ADP與抑制關(guān)鍵小分子代謝物分別結(jié)合于不同的結(jié)構(gòu)域。ADP與PkiA的結(jié)合位點(diǎn)位于A-結(jié)構(gòu)域與B-結(jié)構(gòu)域之間的催化活性位點(diǎn)附近，分別與Asn65、His68、Asp161、Gln313和Glu316形成氫鍵。而果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸這些關(guān)鍵小分子代謝物則結(jié)合于別構(gòu)效應(yīng)結(jié)構(gòu)域C-結(jié)構(gòu)域。具體來(lái)看，果糖-1，6-磷酸與PkiA的 Thr416、Thr417、Ser418、Arg477、Trp470和Gly508各形成一個(gè)氫鍵；蘋果酸分別與Thr416和Thr417形成一個(gè)和兩個(gè)氫鍵；富馬酸也分別與Thr417、Trp470和Gly502形成一個(gè)氫鍵。

圖8 丙酮酸激酶PkiA與關(guān)鍵小分子代謝物的分子對(duì)接模擬結(jié)果Fig.8 Molecular docking simulation of PkiA and key metabolites

3 討論

黑曲霉是檸檬酸的主力生產(chǎn)菌株，可快速轉(zhuǎn)化粗放的淀粉等碳源大量積累檸檬酸［1，3］。黑曲霉的中心代謝尤其是糖酵解途徑具有獨(dú)特的代謝調(diào)控機(jī)制以實(shí)現(xiàn)檸檬酸的不斷合成與分泌［1，3-4］。糖酵解途徑存在由己糖激酶、磷酸果糖激酶與丙酮酸激酶催化3個(gè)不可逆反應(yīng)，成為調(diào)控糖酵解途徑的主要靶點(diǎn)。黑曲霉中磷酸果糖激酶受高濃度的ATP與檸檬酸的抑制，但這種抑制可通過(guò)體內(nèi)的2，6-二磷酸果糖與NH4+的激活作用而解除。目前在黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的代謝調(diào)控研究相對(duì)較少。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道黑曲霉己糖激酶受體內(nèi)海藻糖-6-磷酸的抑制［8］，但僅在檸檬酸發(fā)酵初期檢測(cè)到較低水平的海藻糖-6-磷酸，推測(cè)這種調(diào)控作用相對(duì)較小［9］。在丙酮酸激酶方面，Meixner等［10］檢測(cè)發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸可能對(duì)黑曲霉直接純化丙酮酸激酶的有一定的激活作用，但這一結(jié)果會(huì)受蛋白純化與儲(chǔ)存時(shí)間的影響。為加深對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵酶的代謝調(diào)控的認(rèn)識(shí)，本文系統(tǒng)檢測(cè)13種中心代謝途徑中的小分子代謝物對(duì)其酶活的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)己糖激酶的酶活受高濃度PEP、ATP與ADP的顯著抑制，而丙酮酸激酶的酶活則被果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸的小幅度抑制，被底物ADP顯著激活。

在細(xì)胞工廠的代謝改造中，對(duì)于糖酵解途徑的改造，除加強(qiáng)關(guān)鍵酶的表達(dá)來(lái)提高代謝通量［17］外，解除小分子代謝物對(duì)關(guān)鍵酶的抑制是較為重要的改造策略［18］。這一策略中小分子代謝物與關(guān)鍵酶的互作位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)是首要步驟。對(duì)于尚無(wú)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵酶來(lái)說(shuō)，蛋白結(jié)構(gòu)的同源建模與分子對(duì)接成為有效的分析手段來(lái)推測(cè)參與關(guān)鍵小分子代謝物互作的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。本文首先利用同源建模模擬獲得了HxkA和PkiA的三維結(jié)構(gòu)，然后利用YASARA軟件進(jìn)行分子對(duì)接與成鍵分析，為解析關(guān)鍵小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的相互作用與調(diào)控機(jī)制提供參考。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)模擬與成鍵分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉己糖激酶HxkA的具有抑制關(guān)鍵小分子代謝物果糖-6-磷酸、PEP、ATP與ADP的互作位點(diǎn)均位于底物葡萄糖結(jié)合口袋附近，并且具有較強(qiáng)抑制活性的PEP、ATP與ADP都與關(guān)鍵底物結(jié)合位點(diǎn)Asn210形成氫鍵。黑曲霉HxkA的 Asn210 與 K. lactis來(lái) 源 的 KlHxk1 的 Asn209［14］相對(duì)應(yīng)，是底物葡萄糖的重要結(jié)合位點(diǎn)。KlHxk1存在開放構(gòu)象（open-state）與閉合構(gòu)象（closedstate）這兩種構(gòu)象。在開放構(gòu)象中，葡萄糖分子與Asn209，Asp210，Thr211，Glu268與Glu301的側(cè)鏈以及Gly234的主鏈形成氫鍵，在閉合構(gòu)象中，位于KlHxk1小亞基兩個(gè)loop上的Thr174與Lys175會(huì)進(jìn)一步與葡萄糖形成氫鍵［14］。本文預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)果糖-6-磷酸、PEP與ADP結(jié)合于HxkA的底物結(jié)合口袋附近的Asn66、Asn210、Ala161和Asn264，而ATP則與Thr175、Lys176、Asn210和Asn237 形成氫鍵。通過(guò)與KlHxk1的氨基酸比對(duì)分析推測(cè)，ATP可能通過(guò)影響閉合構(gòu)象中葡萄糖與Thr175、Lys176氫鍵的形成而抑制HxkA的功能。

丙酮酸激酶是糖酵解途徑中最后一步反應(yīng)，催化PEP與ADP生成丙酮酸與ATP［12］。丙酮酸激酶的結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜為同源四聚體，每個(gè)單體有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，存在較為典型的別構(gòu)調(diào)控，當(dāng)與激活劑結(jié)合時(shí)，會(huì)從較為緊實(shí)無(wú)活性的構(gòu)象（T-state）轉(zhuǎn)變?yōu)檩^為松散的有活性的構(gòu)象（R-state），當(dāng)與抑制劑合時(shí)則發(fā)逆向的別構(gòu)變化［15，19-21］。Jurica 等［15］發(fā)現(xiàn)酵母丙酮酸激酶YPK受果糖-1，6-二磷酸的別構(gòu)激活，YPK中果糖-1，6-二磷酸的結(jié)合位點(diǎn)位于C結(jié)構(gòu)域內(nèi)部的 Ser402、Ser404、Thr407、Asp455、Arg459與Trp452，結(jié)合前后的lys446到Trp452位的loop區(qū)域與Ala487到Asn493的轉(zhuǎn)角區(qū)域的變化而進(jìn)一步導(dǎo)致YPK構(gòu)象變化［15］。本文發(fā)現(xiàn)果糖-1，6-二磷酸對(duì)黑曲霉丙酮酸激酶PkiA則具有小幅的抑制作用，但互作位點(diǎn)類似，Thr416、Thr417、Ser418與果糖-1，6-二磷酸的磷酸基團(tuán)形成氫鍵，Trp470與果糖-1，6-二磷酸的呋喃糖基團(tuán)形成氫鍵，推測(cè)果糖-1，6-二磷酸等關(guān)鍵小分子代謝物的結(jié)合也可能導(dǎo)致β17與α17之間從Glu460到Trp470的柔性loop區(qū)域以及β18與β19之間從Gly505到Asn511的轉(zhuǎn)角區(qū)域的構(gòu)象協(xié)同變化。此外，蘋果酸分別與Thr416和Thr417形成一個(gè)和兩個(gè)氫鍵；富馬酸也分別與Thr417、Trp470和Gly502形成一個(gè)氫鍵。由此推測(cè)，黑曲霉丙酮酸激酶PkiA的Thr416、Thr417與Trp470可能是參與別構(gòu)調(diào)控的重要結(jié)合位點(diǎn)。本文細(xì)致分析中心代謝中的小分子代謝物對(duì)黑曲霉己糖激酶與丙酮酸激酶的酶活影響并預(yù)測(cè)了其調(diào)控位點(diǎn)，為黑曲霉細(xì)胞工廠的代謝調(diào)控改造提供借鑒。

4 結(jié)論

本文構(gòu)建了黑曲霉己糖激酶和丙酮酸激酶的過(guò)表達(dá)菌株，利用GST親和層析進(jìn)行重組蛋白的純化，獲得比酶活分別為（4.86±0.14）U/mg和（1.83±0.02）U/mg的己糖激酶和丙酮酸激酶。通過(guò)中心代謝途徑中的小分子代謝物對(duì)重組蛋白的酶活影響檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)果糖-6-磷酸、PEP、ADP和ATP對(duì)黑曲霉己糖激酶存在抑制作用，果糖-1，6-二磷酸、蘋果酸和富馬酸對(duì)丙酮酸激酶有抑制作用，而ADP對(duì)黑曲霉丙酮酸激酶具有顯著激活作用。利用蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模及蛋白與小分子代謝物互作的成鍵分析，發(fā)現(xiàn)己糖激酶底物口袋的Asn210位點(diǎn)及其附近氨基酸可能為參與別構(gòu)調(diào)控的關(guān)鍵氨基酸，丙酮酸激酶別構(gòu)結(jié)構(gòu)域的Thr416、Thr417與Trp470參與別構(gòu)調(diào)控小分子代謝物的互作。

致謝

衷心感謝趙晶老師與譚子瑊在蛋白結(jié)構(gòu)模擬與分子對(duì)接分析上給予的幫助，衷心感謝德國(guó)柏林理工大學(xué)Dr. Timothy C. Cairns對(duì)英文摘要的修改與潤(rùn)色。