王歡禹 常昊宛 章崇祺 金衛(wèi)林 魏芳

（上海交通大學生命科學技術學院，上海 200240）

嵌合抗原受體T細胞治療（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR T cell therapy）是目前較為有效的腫瘤免疫治療方法，主要是通過慢病毒等方式改造病人外周血中分離的T細胞，獲得表達特異性嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細胞，從而實現(xiàn)對腫瘤的特異性治療［1］。嵌合抗原受體是將識別腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）的單鏈抗體（single chain antibody fragment，scFv）、跨細胞膜錨定序列以及T細胞的活化序列在體外進行基因重組而成的人工融合基因。它能夠?qū)⒖贵w對腫瘤抗原的高親和性和T淋巴細胞的殺傷機制相結(jié)合，使其能特異性地識別和殺傷腫瘤細胞［2］。與T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）不同，CAR可以不依賴于主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）的識別，高度特異性地靶向抗原［3］。迄今為止，CAR T細胞在血液惡性腫瘤的治療療效顯著。2017年8月，F(xiàn)DA批準使用靶向CD19的CAR（Kymriah）治療小兒復發(fā)或難治性急性淋巴細胞白血?。ˋLL）；同年10月，F(xiàn)DA批準了另一種靶向CD19的CAR（Yescarta）用于治療成人復發(fā)或難治性大B細胞淋巴瘤。此外，歐洲藥品管理局（EMA）也于2018年6月批準了這兩種藥物的使用。然而對實體瘤的CAR T細胞治療的療效尚待進一步的研究及提高［4］，而決定這一療法成功與否的關鍵因素之一就是選擇合適的腫瘤標志性抗原為靶點。目前在實體瘤中在實驗及臨床前對多個靶點開發(fā)相應的靶向CAR T治療［5-6］。隨著人們對不同腫瘤類型的更深入了解，更多靶向腫瘤特異抗原的CAR T也在不斷涌現(xiàn)。這些靶向腫瘤特異的標志性抗原的新型CAR-T細胞，需要使用敏感的CAR分子檢測方法對CAR-T細胞染色及鑒定以確定其有效性。

當前最常見的CAR分子檢測方法包括熒光染色流式細胞檢測［7］、與CAR蛋白共表達的熒光蛋白流式細胞檢測［8］、qPCR檢測CAR載體在基因組中整合的頻率等［9］。但這3類檢測方法之間的敏感性和適用性的系統(tǒng)性比較研究目前尚不多見。同時對處于研發(fā)階段的新型CAR分子中單鏈可變區(qū)部分的輕鏈重鏈排布的順序和靶向同一位點的不同CAR分子是否會對不同檢測方法的結(jié)果有所影響，以及檢測方法的選擇還需在同一水平進行試驗，提供系統(tǒng)化的參考。

因此，本文使用多種CAR分子（包括正在研發(fā)階段的4種新型CAR分子）對這些方法之間的敏感性和適用性進行比較。對6種分別靶向多種腫瘤過表達的間皮素（mesothelin）及肝細胞生長因 子 受 體（mesenchymal-epithelial transition factor，MET），膠質(zhì)瘤中高表達的異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）廣譜點突變蛋白［10］（IDH1 R132H）（基于靶向同一位點R132H兩種不同scFv序列），以及原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）過表達的 IL-4Rα［11-12］（包含同一scFV的輕重鏈不同排列順序，即HL代表N端-重鏈-輕鏈-C端，LH代表N端-輕鏈-重鏈-C端）的CAR分子在Jurkat細胞的表達水平逐一評估，為后續(xù)新型CAR分子鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株、菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)菌株Stbl3；人外周血T淋巴細胞Jurkat細胞系；慢病毒表達質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器 去內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自Omega公司；胎牛血清購自Biological Industries公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基和Opti-MEM購自Thermo Fisher Scientific 公司 ；BamH I、Xba I、Sal I、Avr II和T4 DNA連接酶購自NEB公司；Biotin-protein L購自金斯瑞生物科技有限公司；Biotin-SP Goat Anti-Mouse IgG、Biotin-SP Rabbit Anti-Human IgG購自美國Jackson ImmunoResearch公司；PE-Streptavidin購自BD公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；BSA購自生工生物；引物合成和測序由北京擎科生物科技有限公司上海分公司完成；實驗所需的主要儀器包括CO2細胞培養(yǎng)箱、C6流式細胞儀、qPCR儀、低溫冷凍離心機、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 六種新型CAR分子表達載體構建 構建Meso-BBζ（靶向 Mesothelin）、Met-BBζ（靶向 Met）、CAR1-2-BBζ-GFP（ 靶 向 IDH1 R132H）、CAR2-4-BBζ-GFP（ 靶 向 IDH1 R132H）、Dupixent HL-BBζ-GFP（靶向 IL-4Rα）、Dupixent LH-BBζ-GFP（靶向IL-4Rα）6種CAR分子表達載體。

1.2.2 慢病毒包裝及感染 將表達6種CAR的載體DNA與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細胞，培養(yǎng)24 h和48 h時收集細胞培養(yǎng)液，高速離心濃縮。使用24 h和48 h的病毒感染Jurkat細胞系，得到穩(wěn)定表達CAR的6種Jurkat細胞。

1.2.3 流式抗體染色及檢測［7］取1 × 106個細胞，預冷的 1 × PBS（含 4% BSA）洗 3次，100 μL重懸，加入0.5 μg Biotin-protein L（Biotin-SP Goat Anti-Mouse IgG/Biotin-SP Rabbit Anti-Human IgG 5 μg），4℃，45 min；預冷的1 × PBS（含4% BSA）洗3次，50 μL 重懸，加入 2 μL PE-Streptavidin，避光 4℃，15 min；預冷的1 × PBS（含4% BSA）洗3次，流式細胞儀檢測。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 絕對定量［13］：選擇CAR載體上WPRE（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element）基因為定量檢測基因，ALB（albumin）基因為內(nèi)參基因。制備標準品的基因片段，標準品PCR引物：ALB，F(xiàn)- AGGCCATATTCAGTAGAAAAAGATG，R-TGGGGAGGCTATAGAAAATAAGG；WPRE，F(xiàn)-ACAGCCACCAAGGACACCTAC，R-GAAGGAAGGTCCGCTGGATTGA。檢測標準品基因片段濃度，將標準品成比例稀釋成4個梯度，計算每微升標準品質(zhì)粒的拷貝數(shù)，對標準品進行梯度濃度稀釋，取4個不同稀釋比例（102-108拷貝）的標準品，標準品與細胞基因組樣品同時進行實時熒光定量PCR，每一個標準品梯度和每一個樣品均設置兩個重復，得到標準品和樣品的循環(huán)閾值，計算循環(huán)閾值的平均值。并根據(jù)標準品的Ct值和拷貝數(shù)繪制標準曲線，將待測樣品的Ct值代入標準曲線，計算獲得待測樣品的WPRE 和Alb的拷貝數(shù)［13］。從而計算每個細胞整合的慢病毒數(shù)目，計算公式為：每個細胞CAR分子的拷貝數(shù)=（WPRE基因拷貝數(shù)均值/ALB基因均值）×2，進而推測CAR分子表達水平。相對定量：以Jurkat-Dupixent-HL-GFP細胞作為標準品，將Jurkat-Dupixent-HLGFP細胞用Jurkat細胞混合稀釋成不同綠色熒光蛋白表達比例的細胞標準品，選擇綠色熒光蛋白表達比例分別為0（Jurkat）、20%、40%、60%的標準品梯度。每一個梯度和樣品細胞分別取1.5×106個細胞提取基因組，進行WPRE基因的實時熒光定量PCR，內(nèi)參基因是ALB，每一個標準品梯度和每一個樣品均設置兩個重復，得到標準品和樣品的循環(huán)閾值，計算循環(huán)閾值的平均值。計算得到WPRE相對于ALB基因的相對表達量，根據(jù)GFP比例和WPRE基因的相對表達量繪制曲線，將待測樣品的WPRE基因的相對表達量代入標準曲線，可以確定CAR是否在細胞內(nèi)表達以及大致表達水平。

2 結(jié)果

2.1 特異靶向間皮素、肝細胞生長因子受體、IDH1突變蛋白及IL-4Rα的CAR載體的構建

成功構建6種帶有CAR分子的慢病毒載體。后4種CAR分子為新型的CAR分子，故構建其與綠色熒光蛋白GFP通過T2A系統(tǒng)同時表達的載體（圖1）。對CAR載體進行雙酶切（圖2）及測序驗證，確證其構建的正確性（圖3）。

圖2 CAR載體酶切圖Fig. 2 Map of restriction enzyme digestion of CAR vectors

圖3 CAR分子scFv段測序圖譜（部分）Fig. 3 Sequencing profiles of scFv segments in CAR molecules（partial）

2.2 流式細胞法檢測CAR分子的表達

包裝慢病毒并感染Jurkat細胞，獲得表達不同CAR分子的Jurkat細胞，即Jurkat-Meso，Jurkat-Met，Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP 和 Jurkat-Dupixent-LH-GFP。流式細胞儀檢測不同染色方法所示的CAR表達水平（圖4）。分別計算IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色平均熒光強度（MFI），如圖5所示。從平均熒光強度和陽性率來看，兩種方法的配對t檢驗分析，均有顯著性差異（P值均為0.031 3），IgG抗體染色較優(yōu)。表明IgG抗體染色較蛋白質(zhì)L染色陽性峰偏移程度更高，對CAR分子的反應靈敏性更高，染色效果好。

圖4 流式細胞儀檢測CAR表達結(jié)果Fig. 4 Results of CAR expression detected by flow cytometry

圖5 兩種染色方法平均熒光強度及陽性率比較Fig. 5 Comparison of two staining methods shown as average fluorescence intensity and positive percentage

對于Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP四種細胞，IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色法檢測效率低，靶向同一位點的不同scFv序列以及同一scFv序列的不同輕重鏈排布的樣品均沒有顯示染色優(yōu)勢。對熒光法染色檢測不可行的CAR分子，GFP共表達的水平可體現(xiàn)編碼CAR分子的慢病毒在細胞的感染效率。

2.3 絕對定量法和相對定量法qPCR檢測編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率

PCR得到ALB和WPRE基因片段（圖6）。在絕對定量法中，建立標準品起始拷貝數(shù)的對數(shù)值和循環(huán)閾值的標準曲線（圖7）。標準品（按100倍稀釋）WPRE拷貝數(shù)與循環(huán)閾值作圖，得到標準曲線y=-4.016 9x+40.018（R2為0.995 4）；標準品（按100倍稀釋）ALB拷貝數(shù)與循環(huán)閾值作圖，標準曲線y=-4.071x+38.493（R2為0.994 9）。根據(jù)樣品循環(huán)閾值計算得到樣品WPRE和ALB基因的拷貝數(shù)，繼而得到每個細胞整合CAR拷貝數(shù)。其中，無法用IgG抗體和蛋白質(zhì)L染色法檢測的表達4種新型CAR分子Jurkat細 胞 ：Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LHGFP中每個細胞平均整合的CAR分子拷貝數(shù)分別為0.36、0.66、3.50、3.29。

圖6 PCR片段DNA標準品的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis profile of the standard DNA samples by PCR

圖7 標準品標準曲線圖（絕對定量法）Fig. 7 Standard curve diagrams of standard samples（absolute quantitative method）

在相對定量法中，Jurkat-Dupixent-HL-GFP細胞按綠色熒光蛋白表達比例加入對照Jurkat細胞制備標準品梯度，與樣品同時提取基因組，進行實時熒光定量PCR，建立不同綠色熒光蛋白表達比例和WPRE相對表達量之間的標準曲線（圖8），得到R2為0.997 7的標準曲線y=0.988 9x+0.239 8。根據(jù)樣品基因組中WPRE相對表達量，計算得到綠色熒光蛋白表達比例（CAR分子表達比例），可以推測CAR分子的表達水平，結(jié)果見圖9。

圖8 HL-GFP百分比與WPRE相對表達量的標準曲線圖（相對定量法）Fig. 8 Standard curve of the percentage of HL-GFP and the relative expression of WPRE（relative quantitative method）

2.4 五種實驗方法檢測結(jié)果比較

將定量qPCR法與GFP共表達的結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)兩種不同策略之間有一定的對應性，且進行配對t檢驗分析，相對定量法與綠色熒光蛋白共表達法的結(jié)果沒有明顯差異，即在標準曲線所示的范圍內(nèi)，WPRE基因含量越高，編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率越高。由此樣品基因組中WPRE基因含量在一定程度上反映了編碼CAR分子的病毒轉(zhuǎn)染效率（圖 9）。

圖9 四種新型CAR分子3種不同檢測方法的比較圖Fig. 9 Comparison of 3 different methods in detecting 4 novel CAR molecules

從適用性、直觀性等方面比較5種實驗方法（表1），綠色熒光蛋白與CAR分子共表達的流式細胞檢測法、相對定量和絕對定量的實時熒光定量檢測法可適用于所有的CAR分子檢測；IgG抗體和蛋白質(zhì)L染色的流式細胞檢測法均可以直接反應CAR分子的表達比例。通過將CAR分子與不同顏色的熒光蛋白共表達，以及通過檢測CAR分子上特定的序列來檢測CAR分子的相對定量和絕對定量實時熒光定量檢測法可間接反應CAR分子表達。

表1 五種方法CAR檢測方法的優(yōu)劣比較表Table 1 Comparison of the five methods in detecting CAR moleculars

此外，IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L染色的流式細胞檢測適用于檢測一部分CAR分子上的單鏈抗體片段，可直觀反應能被染色CAR分子的表達比例，但是無法適用于本文中的4個新型CAR分子。

3 討論

本研究以感染6種CAR分子（包括正在研發(fā)階段的4種新型CAR分子）的Jurkat-Meso，Jurkat-Met，Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP細胞為樣本，通過5種最常見的嵌合型抗原受體檢測方法來比較這幾種方法的優(yōu)劣。

目前存在多種通過流式染色鑒定嵌合抗原受體表達的方法［14］，其中比較常用的兩種CAR分子檢測方法是通過IgG抗體和蛋白質(zhì)L結(jié)合細胞表面表達的CAR分子。這兩種方法因IgG抗體和蛋白質(zhì)L可能與細胞表面非CAR蛋白發(fā)生交叉反應可能引入假陽性。此外，對于一個細胞上表達兩種不同CAR分子的檢測也存在不適用的問題，同時這兩種染色劑只能結(jié)合一部分CAR分子中單鏈抗體片段（scFv）的輕鏈部分，不能結(jié)合所有CAR分子中單鏈抗體片段（scFv）的輕鏈部分，如本文使用的Jurkat-CAR1-2-GFP，Jurkat-CAR2-4-GFP，Jurkat-Dupixent-HL-GFP和Jurkat-Dupixent-LH-GFP四株細胞就不能被這兩種染色劑檢測到，但Jurkat-Meso，Jurkat-Met兩種細胞上的CAR分子可以通過IgG抗體染色和蛋白質(zhì)L抗體染色檢測到。從峰值偏移水平、陽性率以及平均熒光強度顯著性分析可以看出IgG抗體染色比蛋白質(zhì)L染色的效果更佳。隨著嵌合抗原受體T細胞療法的發(fā)展，更多檢測嵌合抗原受體的方法報道相繼出現(xiàn)，如數(shù)字PCR（dPCR）精確定量CAR-T細胞［15］、分析單細胞RNA測序數(shù)據(jù)集CAR mRNA的含量［16］、共聚焦顯微鏡以高空間分辨率可視化CAR［17］等。文章中使用的5種方法是目前最常見且廉價方便的檢測方法，并在同一水平同時利用這些檢測方法分析其敏感性和適用性，提供了系統(tǒng)化的參考。

將CAR分子通過T2A系統(tǒng)與綠色熒光蛋白共表達的方法可用于所有嵌合抗原受體表達水平的檢測，然而此方法僅適用于研究。此外，在載體中額外引入GFP的序列會影響病毒的包裝效率。在本文中，這為我們提供qPCR相對定量檢測CAR表達水平的參考值，以便通過綠色熒光蛋白表達比例和qPCR循環(huán)閾值之間的標準曲線，從而計算表達CAR分子細胞的比例。qPCR絕對定量的方法早先應用于檢測病毒滴度［13］，近幾年有關于監(jiān)測外周血嵌合抗原受體T細胞的qPCR分析方法的報道［9］，與相對定量的方法相比，結(jié)果精確性高，能計算得到平均每一個細胞基因組整合CAR分子的數(shù)目，可體現(xiàn)CAR分子表達水平的趨勢。

綜上所述，qPCR的絕對定量方法是在基因水平上檢測細胞基因組中整合的CAR分子數(shù)目，可大致推測CAR分子表達水平趨勢。而具體CAR分子的表達水平和含有CAR分子細胞比例的結(jié)果還需在蛋白質(zhì)水平上得到驗證，可通過qPCR的相對定量、流式抗體染色或偶聯(lián)GFP蛋白，通過流式細胞儀直觀的檢測。

4 結(jié)論

在 穩(wěn) 定 表 達Meso-CAR、Met-CAR、CAR1-2-GFP、CAR2-4-GFP、Dupixent-HL-CAR-GFP、Dupixent-HL-CAR-GFP的6種Jurkat細胞中，CAR分子與綠色熒光蛋白共表達可用于CAR表達水平的試驗階段的檢測，免疫球蛋白G抗體染色的靈敏性較蛋白質(zhì) L染色好，對于免疫球蛋白G抗體及蛋白質(zhì) L無法識別的CAR分子，則可以使用相對或絕對定量實時熒光PCR方法，兩者均可以反映CAR表達水平的趨勢。