鄭淑娟 仝濤，2 許文濤，2，3 黃昆侖，2，3

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083；2. 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

點擊化學反應是通過碳-雜原子鍵的連接快速合成有用的新化合物的反應，由化學家Sharpless、Kolb及Finn于2001年提出后受到越來越多的關注［1］。點擊化學有以下一種或多種特征：反應快速；通量合成高；操作簡單；反應條件溫和；原料來源廣；反應產(chǎn)物易純化，產(chǎn)物得率高［1］。

點擊反應的有多種，包括環(huán)加成反應、親核開環(huán)反應、非醇醛的羰基化反應、碳-碳多重鍵加成反應、疊氮-膦偶合反應。狄爾斯-阿爾德反應（Diels-Alder reaction）和 1，3-偶極-環(huán)加成反應（copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC）屬于環(huán)加成反應；氮丙啶、環(huán)氧化物和環(huán)狀硫酸酯等發(fā)生的反應屬于親核開環(huán)反應；腙、肟醚和芳香族雜環(huán)的形成屬于非醇醛的羰基化反應；二羥基化反應和環(huán)氧化反應屬于碳-碳多重鍵加成反應；施陶丁格連接屬于疊氮-膦的偶合反應。

按照是否需要金屬作為反應催化劑可以將點擊反應分為金屬催化的點擊反應和無金屬催化的點擊反應。如CuAAC為金屬催化的點擊反應，而疊氮-炔環(huán)加成反應（strain-promoted alkyne-azide cycloadditions，SPAAC）和巰基-烯（thiol-ene）點擊反應則為無金屬催化的點擊反應。金屬催化的點擊反應在生物學領域的使用具有一定的限制性，因金屬離子難以被純化分離，而且具有潛在的生物毒性作用，可能會損害機體健康。因此，無金屬催化的點擊化學反應如狄爾斯-阿爾德反應、施陶丁格連接和巰基-烯點擊反應受到了廣泛的關注。

在材料合成和生物分子標記中，巰基-烯點擊反應都發(fā)揮著重要的作用。巰基-烯點擊反應被廣泛的應用于生物大分子的合成如樹枝狀化合物的合成和聚合物的合成等方面。巰基-烯點擊反應還可以應用于蛋白質(zhì)、核酸鏈和聚糖等生物分子的標記中。另外，巰基-烯點擊反應在材料表面功能化方面也具有很重要的作用。在生物傳感方面，巰基-烯點擊反應具有廣闊的應用前景。本文對巰基烯點擊反應進行了綜述，詳細介紹了巰基-烯點擊反應的反應機理、影響反應速率的因素和生物大分子的標記。并且介紹了巰基-烯點擊反應介導的生物傳感器及與生物傳感相關的應用，包括生物功能化納米材料和細胞成像等方面。最后對巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的發(fā)展進行了展望。

1 巰基-烯點擊反應偶聯(lián)機理及性質(zhì)

硫醇-烯點擊反應通常包括自由基介導的巰基-烯點擊反應和親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應（圖1）。自由基引發(fā)的巰基-烯反應機理可以分為以下幾個步驟：首先，在加熱或光照的條件下，引發(fā)劑吸收能量被激發(fā)裂解，形成自由基；接著，形成的自由基和巰基發(fā)生反應，奪取巰基上的氫原子，觸發(fā)巰基自由基形成；然后，形成的巰基自由基和烯基發(fā)生反應，形成烷基自由基；最后，烷基自由基會進攻巰基化合物，奪取巰基上的氫原子，引發(fā)鏈增長，同時產(chǎn)生新的巰基自由基。這些新產(chǎn)生的巰基自由基可繼續(xù)和烯基反應。其中第二步產(chǎn)生的巰基自由基可引發(fā)鏈增長也可以發(fā)生雙基終止［2］。親核試劑催化的巰基-邁克爾加成反應的反應機理包括以下步驟：硫醇與親核試劑的反應促使巰基去質(zhì)子化，成為相應的硫酸鹽陰離子。硫酸鹽是一種很強的親核體，與活化的C=C加成，形成中心碳為陰離子的中間體。之后這個中間體吸收一個質(zhì)子，形成巰基-烯產(chǎn)物［3］。

圖1 常見的巰基-烯點擊化學反應類型［4］Fig. 1 Common types of thiol-ene click chemistry reactions

近幾年，巰基-烯反應點擊化學的特性受到了人們的廣泛關注，在生物應用領域也已經(jīng)擴展到交聯(lián)網(wǎng)絡、生物傳感以及功能化生物材料等方面。從合成的角度看，巰基-烯的反應有十分顯著的優(yōu)勢，如反應速度快，應用范圍廣（不管反應物活性如何，大多數(shù)的烯烴和所有的巰基幾乎都能滿足反應條件），基本上屬于最簡便的一種無金屬催化的點擊化學反應。

2 巰基-烯點擊反應的影響因素

2.1 巰基結構對反應速率的影響

參與巰基-烯點擊反應的巰基化合物主要有4種，包括烷基硫醇酯類、烷基（芳基）硫醇類、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。在巰基-烯點擊化學反應中，反應速率和巰基化合物的結構有關。含有推電子基團的巰基化合物的反應活性較高，如異丙撐基；含有吸電子基團的巰基化合物反應活性較低，如酯基。巰基-烯點擊反應的巰基化合物的反應活性由小到大分別為硫苯酚類、烷基硫醇酯、烷基3-巰基酯類硫醇和烷基硫醇。

2.2 烯類單體結構對反應速率的影響

缺電子烯和富電子烯與巰基的反應是巰基-烯點擊化學反應的主要兩種類型。巰基與富電子烯之間反應迅速，如降冰片烯與巰基的反應速率很快。巰基與缺電子烯之間反應較慢，如馬來酰亞胺、丙烯酸酯等。這是由于缺電子烯的雙鍵需要被激活，所以需要弱堿性的催化劑催化才能進行，如三乙胺等親核試劑。一般而言，巰基-烯點擊反應的反應速率隨著烯類單體碳碳雙鍵電荷密度的下降而下降。

為了確定不同烯烴在巰基-烯點擊反應中的速率，Cramer等［5］將硫醇和丙烯酸酯、丙烯基醚、乙烯基醚、降冰片烯和乙烯基氮烷分別與tetrathiola進行光聚合反應，結果如表1所示。從表中可以看出，降冰片烯的聚合速率最大，為6.0；其次是乙烯基醚，為4.8。在這兩種反應中烯基官能團和巰基官能團對反應速率的貢獻率相等。烯類單體反應速率的由小到大的順序為：烯丙基醚、丙烯酸酯類、乙烯基硅氮烷、乙烯基醚和降冰片烯。

表1 不同烯烴與tetrathiola在巰基-烯點擊反應中的最大速率Table 1 Maximum rates of different olefins in thiol-ene click reactions with tetrathiola

2.3 巰基和雙鍵官能團的濃度

在巰基-烯點擊反應的光聚合體系中，反應速率與巰基和烯基官能團的濃度呈一級反應。光聚合反應速率與鏈增長動力學常數(shù)（Kp）和鏈轉移動力學常數(shù)（Kct）比值顯著相關。在反應起始階段，反應體系中存在著足量的巰基和烯基，二者的消耗速率相等。隨著反應的進行，會出現(xiàn)3種不同的情況：當Kp≈Kct時，聚合反應的速率與巰基官能團和雙鍵官能團的濃度都相關；當Kp＜＜Kct時，聚合反應的速率僅和雙鍵的濃度呈一級反應；當Kp＞＞Kct時，聚合反應的速率僅和巰基的濃度呈一級反應［4］。

3 巰基-烯反應介導的生物標記技術

目前，巰基-烯點擊反應已經(jīng)應用于反應物官能化和聚合反應中，并且在生物分子的官能化方面已經(jīng)有良好的應用。巰基-烯點擊反應滿足生物材料所要求的選擇性、易于實施和高產(chǎn)率的特點，因此可以應用于生物材料的標記以實現(xiàn)生物分子功能化。雖然熱敏自由基引發(fā)劑如偶氮二異丁腈已經(jīng)被應用于在生物材料的功能化領域，但是在大規(guī)模合成時，受反應器設計和光衰減等因素的限制，升高反應溫度才能更好的實現(xiàn)生物材料本體自由基均勻生成［6］。而巰基-烯點擊反應在不需要升高溫度的條件下，也可以容易地實現(xiàn)生物材料本體自由基均勻化和官能化。

3.1 巰基-烯反應在DNA分子標記中的應用

利用巰基-烯點擊化學反應可以將官能化的DNA分子應用于DNA微流控芯片領域，以實現(xiàn)鑒定單堿基對錯配等目的。利用巰基-烯點擊反應可以將巰基修飾的DNA分子以共價鍵的方式固定到烯基修飾的硅基材料上，得到固定密度約6 pmol/cm2的DNA微陣列。整個反應過程不需要使用交聯(lián)劑，并且具有直接連接、照射時間短（20 min）和雜交效率高（65%）的優(yōu)點。得到的DNA微陣列可以對單堿基對錯配進行鑒定［7］。另外，利用巰基-烯點擊化學反應還可以將生物素探針固定于巰基化的硅表面。之后借助于鏈霉親和素就可以實現(xiàn)生物素化DNA與硅基表面的組裝，形成DNA微流控芯片。該方法獲得的微流控芯片具有2 pmol/cm2的固定化密度和90%以上的雜交效率，性質(zhì)優(yōu)良［8］。巰基-烯點擊反應還可以應用于制備特異性性檢測沙門氏菌PCR產(chǎn)物的核酸微陣列。這種核酸微陣列由多巰基化的DNA與硅基材料通過巰基-烯點擊化學反應制得，靈敏度達到20 μmol/L。并且這種硅基材料探針連接方式能夠改善以核酸微陣列為基礎的分析技術在重復性、可靠性和分析靈敏度方面的不足［9］。巰基-烯點擊反應可以將巰基封端的鄰苯二甲酸酯的核酸適配體結合到載體上，得到一種新型的基于適配體的鄰苯二甲酸酯吸附劑。這種方法為特異性富集和高靈敏度檢測鄰苯二甲酸酯提供了新的方法，吸附回收率高達66.10%-108.90%［10］。除了硅基材料，利用巰基-烯點擊反應還能將官能化的DNA引入金表面。巰基-烯點擊化學反應可以將聚丁二烯的低聚物固定在α，ω-二硫醇巰基化的金表面上。之后再次通過巰基-點擊化學反應使聚丁二烯殘基與含巰基的化合物偶聯(lián)，包括十八烷硫醇，1H、1H、2H、2H-全氟烷硫醇和巰基封端的25聚體 DNA［11］。另外，Wang等［12］利用巰基-烯點擊反應可以將巰基化的凝血酶適配體固定在有機二氧化硅平臺上，得到一種新型的核酸適體基有機硅雜化整體柱。這種親和柱可以用來富集凝血酶，檢測限為0.01 μmol/L，具有簡單、快速和高效的特點。

3.2 巰基-烯反應在蛋白質(zhì)標記中的應用

蛋白質(zhì)在巰基或烯基的官能化后可以用來進行巰基-烯點擊化學反應。對生物素或生物素蛋白進行烯丙基官能化之后，利用巰基-烯點擊反應可以將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到巰基化的表面上。蛋白質(zhì)的偶聯(lián)密度受暴露時間控制。并且蛋白質(zhì)在與表面偶聯(lián)后仍能保持活性［13］。Witrotk等［14］利用免疫相容的硫醚與牛血清白蛋白結合來制備與腫瘤相關的疫苗。巰基-烯點擊化學反應可以將烯丙基官能化的牛血清白蛋白核心與巰基糖肽偶聯(lián)，得到一種新的生物大分子。每個分子平均可以達到8個糖肽。

3.3 巰基-烯反應在其他化合物標記中的應用

化合物被巰基或烯基標記之后，不僅可以用來制備水凝膠、利用糖-蛋白質(zhì)特異識別系統(tǒng)識別蛋白質(zhì)，還可以被應用于生物醫(yī)藥中，如制備藥物、遞送藥物等。

利用巰基-烯點擊反應可以使巰基乙醇與核心為碳水化合物單體的樹枝狀大分子末端烯基發(fā)生連續(xù)的合成反應，得到的合成產(chǎn)物可以應用于細菌黏附［15］。這個反應過程的反應效率高達94%。Ortiz等［16］開發(fā)出一種利用巰基-烯點擊反應快速制備水凝膠的新方法。在該方法中，利用巰基-烯點擊反應可以在20 s 內(nèi)完成硫醇單體與二烯醚基官能團化的水凝膠分子聚合，得到聚合網(wǎng)絡。硫醇-烯點擊化學反應和氮雜-邁克爾加成反應可以用于制備磺基甜菜堿官能化的聚縮醛樹狀大分子。這種生物大分子表現(xiàn)出pH響應藥物釋放行為，并且在負載了阿霉素后顯示出顯著的抗癌活性。這種制備方法不僅為聚縮醛樹狀聚合物的應用提供了新的思路，而且為開發(fā)具有臨床應用潛力的抗癌納米材料提供了參考［17］。碳水化合物被巰基或烯基標記之后，還可以用于識別特定蛋白。由于糖和蛋白質(zhì)具有互補識別系統(tǒng)，利用巰基-烯點擊化學反應可以將標記了巰基的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）與涂覆在石英表面的烯烴偶聯(lián)，制備得到碳水化合物傳感器。這種傳感器可用于凝集素的檢測，具有快速、有效和通量高的特點，并且可以檢測未標記的蛋白質(zhì)［18］。

利用巰基-烯點擊化學反應可以構建具有藥物遞送功能的膠束結構。Chen等［19］利用巰基-烯點擊反應將乙烯基的官能化的聚乙二醇-甲基丙烯酸酯與葡萄糖胺偶聯(lián)，得到的產(chǎn)物為葡萄糖官能化的聚甲基丙烯酸2-羥乙酯。這種產(chǎn)物可以形成熱可逆膠束，能夠用于包封藥物。巰基-烯點擊化學反應可以用于高效生產(chǎn)具有抑制糖苷酶和抗H病毒活性的硫代二糖。通過巰基-烯點擊化學反應可以將含巰基的糖分子和含烯基的糖分子進行偶聯(lián)，得到硫代二糖。這種方法具有產(chǎn)率高、便捷，在硫代二糖的生產(chǎn)方面具有很大的應用優(yōu)勢［20］。

利用巰基-烯點擊反應可以將含有喜樹堿的甲硅烷基醚固定在介孔二氧化硅納米顆粒上，得到喜樹堿介孔二氧化硅納米顆粒。在正常血漿條件下（pH7.4），喜樹堿介孔二氧化硅納米顆粒不會釋放喜樹堿；在體外酸性條件下（pH4.0），喜樹堿會從介孔二氧化硅納米顆粒中釋放。這種功能化的納米粒子具有藥物控制釋放的臨床治療潛力［21］。利用巰基-烯點擊化學反應可以將C6位上烯基化的殼聚糖和巰基化的聚乙二醇交聯(lián)，得到pH響應型殼聚糖水凝膠。這種水凝膠的溶脹和收縮可以有效調(diào)節(jié)阿霉素和牛血清白蛋白在不同pH介質(zhì)中的相應釋放行為。通過巰基-烯點擊化學反應交聯(lián)得到的殼聚糖水凝膠可能為藥物靶向遞送提供一種新的載體［22］。

4 巰基-烯點擊反應在生物傳感中的應用

隨著巰基-烯反應應用范圍的不斷拓寬以及生物傳感器在檢測中的快速發(fā)展，巰基-烯反應介導的生物傳感器逐漸增多，如熒光生物傳感器、細胞傳感器、電化學傳感器等。可以實現(xiàn)miRNA、DNA、含有巰基的生物活性物質(zhì)、整合素αvβ3過表達細胞、哺乳動物細胞、葡萄糖氧化酶、乳糖酶和凝集素等的檢測。

4.1 熒光生物傳感器

在熒光生物傳感方面，巰基-烯點擊反應發(fā)揮了重要的作用。Su等［23］通過在硅納米顆粒表面結合DNA分子，構建了能夠檢測癌癥相關基因miR-21的DNA共軛硅納米粒子（SiNPs）。巰基官能化DNA通過與烯烴接枝的SiNP發(fā)生巰基-烯點擊化學反應，生成SiNP-DNA綴合物。當沒有靶標miR-21時，熒光基團和淬滅基團的距離很近，整個反應體系處于熒光淬滅的狀態(tài)，不顯現(xiàn)熒光；當靶標miR-21出現(xiàn)時，miR-21可以與DNA的一條鏈發(fā)生鏈置換反應，熒光基團和淬滅基團發(fā)生分離，顯現(xiàn)熒光。因此可以通過是否顯示熒光來判斷癌癥相關基因miR-21是否存在。這種方法不僅反應條件溫和，而且具有良好的特異性，可以應用于癌癥的治療和診斷。有學者報道了一種通過在硅表面上使用固定化分子信標來檢測DNA的方法。巰基-烯點擊化學反應可以將熒光標記的探針連接到硅基表面。錨定的分子信標能夠以微陣列形式高選擇性和靈敏度的與互補靶標雜交，檢測限為（9.9 ± 1.1）nmol/L［24］。利用巰基-稀點擊反應制作的合成紙產(chǎn)生的熒光信號能夠用于檢測全脂牛奶中的抗生素恩諾沙星。合成紙的檢測限為1.64 nmol/L，低于玻璃和硝化纖維素基質(zhì)［25］。Rong等［26］設計了一種基于谷胱甘肽調(diào)制的開啟熒光策略的開啟式上轉換熒光傳感器，用于快速檢測丙烯酰胺。首先通過水熱法制備了聚乙烯亞胺改性的上轉換納米顆粒，然后通過非共價鍵合將羅丹明B衍生物負載在其表面上。谷胱甘肽與羅丹明B衍生物耦合后，通過熒光共振能量轉移強烈淬滅上轉換熒光。加入三（2-羧乙基）膦后，有效催化了谷胱甘肽和丙烯酰胺之間的巰基-烯邁克爾加成反應，觸發(fā)被淬滅的熒光。利用巰基-烯點擊化學反應和葉酸改性制備的C60熒光納米顆粒可以靈敏且特異性的檢測葉酸。并且這種C60熒光納米顆粒易于進入葉酸受體表達水平更高的癌細胞，從而識別靶標細胞并對靶標細胞成像［27］。利用馬來酰亞胺將四苯基乙烯官能化后，可以得到馬來酰亞胺-四苯基乙烯復合物。當含有巰基的生物活性物質(zhì)存在時，馬來酰亞胺-四苯基乙烯復合物中的馬來酰亞胺側鏈會和巰基發(fā)生巰基-烯點擊化學反應。得到的產(chǎn)物具有聚集誘導發(fā)射性質(zhì)，會產(chǎn)生熒光。這種方法的檢測限低至1 ppb，并且產(chǎn)生的信號易于觀察。另外，所制備的馬來酰亞胺-四苯基乙烯復合物還可作為可視化試劑對活細胞進行染色。這種方法制備的細胞熒光圖像可用來描繪細胞中巰基物質(zhì)分布［28］。

4.2 細胞傳感器

巰基-烯點擊反應還被應用于細胞傳感器。巰基-烯點擊反應可以用于檢測特異蛋白過表達的細胞。利用CuAAC和巰基-烯雙點擊的方法可以制備的N-乙?；?1-半胱氨酸-聚甲基丙烯酸甲酯-b-聚己內(nèi)酯嵌段共聚物（N-Acetyl-l-cysteine-capped poly（methyl methacrylate）-b-polycaprolactone block copolymer，PMMA-b-PCL-NAC）可以作為生物分子結合的固定基質(zhì)。通過共價結合的方式可以將精氨酸甘氨酸天冬氨酸（arginine（R），glycine（G），and aspartic acid（D），RGD）肽序列固定到PMMA-b-PCL-NAC的表面上，形成PMMA-b-PCL-NAC-RGD平臺。之后可通過光學特異性和電化學轉導監(jiān)測整合素αvβ3過表達的細胞［29］。巰基-烯點擊化學反應可以將巰基化透明質(zhì)酸/巰基化明膠的巰基基團與聚乙二醇-降冰片烯分子的烯基快速偶聯(lián)，得到透明質(zhì)酸/明膠水凝膠。利用分子印刷儀器能夠直接印刷和控制水凝膠基質(zhì)內(nèi)活細胞的固化，實現(xiàn)微米級哺乳動物細胞印刷，制備微米級細胞圖案［30］。

4.3 電化學傳感器

巰基-烯點擊反應在電化學傳感器中也具有很好的應用前景。例如，利用巰基-烯點擊反應可以將石墨烯（graphene，GR）與半胱胺鹽酸鹽（HS-（CH2）2-NH2·HCl）結合，得到功能化的石墨烯表面。石墨烯表面的N原子能吸附并穩(wěn)定金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNP）， 形 成 GR-Cys-AuNPs復合物。將獲得的GR-Cys-AuNPs復合物沉積在玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上，通過電化學的方法可以確定確定樣品中尿酸（uric acid，UA）和葉酸（folic acid，F(xiàn)A）的含量（圖2）［31］。Zeng等［32］利用巰基-烯基點擊化學反應將含有烯基的Ru（bpy′）3Cl2衍生物和含有巰基的3-巰丙基三甲氧基硅烷進行偶聯(lián)，將Ru（bpy′）3Cl2衍生物固定在3-巰丙基三甲氧基硅烷預處理的氧化銦錫基底上，制備了固態(tài)電化學發(fā)光傳感器。使用三正丙胺作為模型分析物時，這種電化學傳感器的線性范圍在（5×10-6-5×10-3）mol/L之間，檢測限為1×10-6mol/L。這種固定化方法簡單、快速、高效。并且所得到的 Ru（bpy′）32+單層膜在有機溶劑中表現(xiàn)出極好的穩(wěn)定性。

圖2 GR-Cys-AuNPs納米復合傳感器的制備示意圖［31］Fig. 2 Schematic diagram of the fabrication of GR-Cys-AuNPs nanocomposite sensor［31］

4.4 其他類型傳感器

利用巰基-烯點擊化學反應可以將聚乙烯亞胺修飾在負載表面上，得到的多胺表面具有高的表面氨基濃度和鏈霉抗生物素蛋白負載能力。這種方法在氨基酸和蛋白質(zhì)傳感方面有很大的優(yōu)勢［33］。利用巰基-烯點擊反應可以將聚乙二醇、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽和精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-纈氨酸肽引入到烯烴修飾的底物上。這種方法可以很好地用在內(nèi)皮細胞的高通量篩選中［34］。通過使用巰基-烯點擊化學反應，還可以在負載表面上快速、簡便、易行的固定酶。具體方法在玻璃表面上生成烯烴封端的自組裝單層膜，之后通過巰基-烯點擊化學反應，使得酶的游離巰基和基質(zhì)上的烯烴之間形成共價鍵，從而可以實現(xiàn)酶的固定。利用這種方法固定的酶不會失去原有的活性，如葡萄糖氧化酶和乳糖酶被固定之后仍然具有活性。這種方法在表面上綴合酶傳感器陣列方面具有很大的應用潛力［35］。

巰基-烯點擊化學反應在碳水化合物傳感器中也有應用。在石英表面先進行烯烴/炔烴的涂覆，隨后利用巰基-烯和巰基-炔點擊化學反應使得含有烯烴/炔烴的表面與能夠和凝集素特異性結合的碳水化合物（1-硫代-碳水化合物和硫代乙基-碳水化合物）直接在一滴水中進行反應，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的特異性檢測。這種方法具有高速、有效、通量高的特點，且對未標記的蛋白質(zhì)也可以進行檢測［18］。

5 巰基-烯點擊反應在細胞成像中的應用

生物成像可以用于詳細了解細胞過程和疾病機制。巰基-烯點擊反應作為無金屬參與的點擊反應，在反應動力學、反應物毒性以及生物利用度等屬性上都十分適用于生物分子在細胞及體內(nèi)的成像，有助于人們更好地了解生物分子參與的生物過程以及在生物體系中的發(fā)揮的作用。細胞成像一般需要發(fā)生肽或蛋白質(zhì)特異性反應，才能實現(xiàn)細胞的圖案化。利用巰基-烯點擊反應可以將烯基官能化（烯丙基和降冰片烯殘基）防污聚合物刷與細胞黏附肽RGD和精氨酸谷氨酸天冬氨酸纈氨酸偶聯(lián)后，可以觀察聚合物刷對臍靜脈內(nèi)皮細胞的黏附作用。另外，為了實現(xiàn)良好的細胞成像功能，可以在聚合物刷子的表面連接上光致發(fā)光肽，通過熒光顯微鏡和原子力顯微鏡能夠觀察到細胞微陣列［36］。含有烯基的四苯乙烯-馬來酰亞胺加合物是一種巰基特異性生物探針。當這種生物探針暴露于含有巰基的L-半胱氨酸時，通過巰基-烯點擊化學反應，可以產(chǎn)生易于觀察的熒光。因此可以利用四苯乙烯-馬來酰亞胺加合物作為可視化試劑對活細胞進行標記，得到清晰的熒光圖像。這為描繪細胞中含有巰基的化合物的分布提供了一個簡便、特異、靈敏的熒光標記方法［28］。利用硫醇-烯點擊化學反應可以將含有巰基的聚乙二醇有效地引入非熒光納米金剛石中，得到聚乙二醇化的熒光納米金剛石。這種復合材料顯示出高的水分散性、強的熒光性和低的細胞毒性，并具有良好的細胞染色性能，在生物成像方面顯示出巨大潛力［37］。

6 巰基-烯點擊反應在納米材料的生物功能化中的應用

隨著新型材料的特性不斷被發(fā)掘，納米材料作為其中一員，因其結構龐大，負載能力高以及獨特且可調(diào)控的物理和化學性質(zhì)成為藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)中的重要工具。巰基-烯點擊反應介導的納米材料藥物遞送技術也得到一定程度的發(fā)展。巰基烯點擊化學反應可以將具有巰基的各種化合物綴合到烯基官能化的硅納米顆粒的表面，而不影響硅納米顆粒的特征熒光性質(zhì)［38］。硫醇-烯烴點擊化學反應可以在大氣環(huán)境下功能化硅表面而不引入氧化硅，否則會對電子性能產(chǎn)生不利影響。有的研究學者在非常溫和的條件下利用巰基-烯點擊化學的方法將各種功能分子連接到無氧化物的Si（111）表面上，而不引入氧化硅。這種方法具有通用、有效、簡便的和可模式化等特點，為生物功能電子學提供了新的途徑［39］。利用巰基-烯點擊化學可以將含有巰基的酶綴合到烯基官能化的硅納米晶體表面，得到得到生物無機雜化物。這種雜化物在緩沖液中分散性好、光穩(wěn)定性強，并且具有光致發(fā)光和催化活性，在硝基苯酯和尿素的化學檢測中具有潛在的應用［40］。磁性納米顆粒與生物分子結合是一個很有前景的研究領域。利用巰基-烯點擊化學方法可以將納米磁性顆粒胺基原位官能化，可以得到能夠結合抗Englrailed-2蛋白的抗體的功能化磁性納米顆粒。共價鍵合法的固定效率比物理吸附法高（1.775 mg/g vs 0.54 mg/g）［41］。在微乳液中以肌紅蛋白為模版，利用硫醇-烯點擊化學反應制備的分子印跡納米顆粒能夠選擇性的識別肌紅蛋白［42］。

7 展望

巰基-烯點擊化學反應因其簡便性受到了科研工作者的青睞。巰基-烯點擊反應的操作性強，產(chǎn)率和轉化率高，反應速度快等優(yōu)勢，使其在聚合物科學和分子合成方面具有很大的潛力。然而巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的應用仍有一些不足之處：（1）目前合成含有雙鍵的單體或聚合物的方法已經(jīng)比較成熟，且得到的化合物種類豐富。而含有巰基的化合物的合成過程復雜，并且?guī)€基化合物結構種類不足。這不利于了巰基-烯點擊化學反應在生物傳感領域擴大應用范圍。因此，探索合成不同種類和官能度的巰基化合物是之后的研究重點之一。（2）對生物分子不同位置進行官能團標記的成本較高也限制了巰基-烯點擊反應在生物傳感領域的廣泛應用。（3）目前巰基-烯點擊化學反應主要集中于檢測小分子和核酸的熒光傳感器，導致傳感器的種類缺乏多樣性。因此，將巰基-烯點擊化學反應更多的應用于其他類型生物傳感器是值得研究的方向，如光譜生物傳感器、可視顯色傳感器、仿生傳感器等。這將有助于拓寬巰基-烯點擊反應的應用范圍。（4）目前巰基-烯點擊反應的研究仍處于實驗室研究階段，還未在生物傳感領域達到大規(guī)?；瘧玫碾A段。利用巰基-烯點擊反應搭載重現(xiàn)性好、靈敏、準確的生物傳感器是實現(xiàn)商業(yè)化和規(guī)模化生產(chǎn)的基礎。另外，基于巰基-烯點擊化學反應被較多的應用于合成生物聚合物、功能化納米顆粒，以及檢測多種生物分子等方面，巰基-烯點擊化學反應具有應用于化學和生物學前沿領域的巨大潛力。巰基-烯點擊化學反應還有可能更加深入的擴展到材料科學領域，廣泛用于合成或功能化聚合物，并在涉及特殊性能材料的學科中具有廣闊的應用前景。