魏文青 謝澤雄

（天津大學(xué)化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 教育部合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津 300072）

有絲分裂過程發(fā)生染色體分離錯誤，導(dǎo)致子代細(xì)胞增加或減少部分甚至整條染色體的現(xiàn)象稱為非整倍體化［1］。非整倍體是常見的細(xì)胞生理現(xiàn)象，存在于植物、動物、真菌等生命體中，影響疾病發(fā)生、生物進(jìn)化、細(xì)胞應(yīng)激等過程［2］。比如常見的唐氏綜合征（21三體綜合征）和愛德華氏綜合癥（18三體綜合征）等非整倍體疾病的發(fā)生［3］。非整倍體誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定性是驅(qū)動惡性腫瘤生長的重要因素。酵母菌被廣泛的應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)等過程，在自然界中一般以單倍體或者二倍體形式存在［4-5］。非整倍體酵母細(xì)胞通常會表現(xiàn)出多種形式的基因組不穩(wěn)定性，如細(xì)胞內(nèi)染色體丟失頻率增加，有絲分裂重組事件以及DNA損傷修復(fù)缺陷等（圖1）。Deutschbauer等［6］對基因雜合缺失的二倍體釀酒酵母菌株進(jìn)行適應(yīng)性分析，以確定細(xì)胞中所有導(dǎo)致單倍劑量不足的生長缺陷基因。通過將完整釀酒酵母菌株中測試得到的184個基因進(jìn)行敲除發(fā)現(xiàn)，這些基因處于雜合狀態(tài)時細(xì)胞的增殖能力會降低。所以非整倍體基因劑量的失衡會顯著降低細(xì)胞的適應(yīng)性，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］。非整倍體釀酒酵母細(xì)胞還會出現(xiàn)明顯的G1期延遲，細(xì)胞的長度發(fā)生變化等現(xiàn)象［8］。因此解析細(xì)胞分裂過程中染色體異常分離的機(jī)制，對于調(diào)控細(xì)胞完成正常增殖過程，以及理解和治療非整倍體疾病都是至關(guān)重要的。

圖1 酵母非整倍體的形成及影響Fig.1 Formation and influence of yeast aneuploidy

酵母主要分為芽殖酵母和裂殖酵母，其中裂殖酵母主要通過有性繁殖和無性繁殖兩種方式進(jìn)行細(xì)胞分裂。通常在營養(yǎng)環(huán)境充足的條件下，裂殖酵母主要通過有絲分裂的方式進(jìn)行一分為二的繁殖［9］，芽殖酵母主要通過出芽和接合兩種方式進(jìn)行繁殖，不同接合型的細(xì)胞既可以單獨(dú)進(jìn)行有絲分裂出芽繁殖，也可以與不同接合型細(xì)胞進(jìn)行接合并在一定的條件下開始減數(shù)分裂過程［10］。故酵母在不同的繁殖方式中都有可能發(fā)生錯誤，形成非整倍體細(xì)胞。其中芽殖酵母中比較典型的是釀酒酵母，綜合目前研究發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母細(xì)胞在有絲分裂過程中主要通過“染色體提前分離”和“不分離”兩種方式形成非整倍體［11］。

1 有絲分裂過程染色體提前分離

染色體提前分離是指細(xì)胞有絲分裂中期染色體無法正確排列在赤道板上，姐妹染色單體出現(xiàn)提前分離的現(xiàn)象［12-14］。染色體提前分離的原因主要包括姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷和紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效。研究表明這兩種原因都會導(dǎo)致非整倍體子代細(xì)胞產(chǎn)生。

1.1 姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷

黏結(jié)蛋白是一種最早在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的多亞基復(fù)合物，主要由Smc1、Smc3、Scc1和Scc3四個核心亞基組成，在姐妹染色單體的聚合、分離和DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要的作用［14］。有絲分裂S期形成的姐妹染色單體被黏結(jié)蛋白聚合在一起，M期黏結(jié)蛋白被酶水解后姐妹染色單體在紡錘體的牽引下向細(xì)胞兩極移動，若此過程黏結(jié)蛋白發(fā)生缺陷則會導(dǎo)致姐妹染色單體因黏聚力缺失而提前分離，隨后紡錘體與姐妹染色單體之間將會發(fā)生隨機(jī)結(jié)合，錯誤的結(jié)合將會導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的產(chǎn)生［15］。

關(guān)于釀酒酵母細(xì)胞黏結(jié)蛋白如何將姐妹染色單體聚合的模型主要有3類，分別包括單環(huán)模型、雙環(huán)模型以及聚合桿狀模型。其中單環(huán)模型是最常見的模型，即Smc1、Smc3和Scc1/ Scc3形成一個大三角環(huán)狀黏結(jié)蛋白復(fù)合物，能夠環(huán)抱捕獲兩個長度約為10 nm的姐妹染色單體［16］。黏結(jié)確立蛋白1（Eco1）是一種乙酰轉(zhuǎn)移酶，是調(diào)節(jié)黏結(jié)蛋白形成的重要因子［17］。Eco1最早在酵母中鑒定成功，在有絲分裂S期促進(jìn)黏結(jié)蛋白亞基乙?；揎?，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)束縛姐妹染色單體［18］。Zhang等［19］通過研究酵母細(xì)胞Smc3亞基上，受Eco1乙?；揎椀膬蓚€賴氨酸位點(diǎn)（K112和K113）突變的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Eco1對黏結(jié)蛋白的修飾作用受到突變的破壞，導(dǎo)致姐妹染色單體黏結(jié)蛋白缺陷，子代細(xì)胞出現(xiàn)非整倍體現(xiàn)象。

雙環(huán)模型，即每個黏結(jié)蛋白環(huán)都捕獲一個姐妹染色單體。當(dāng)兩個環(huán)產(chǎn)生橋接即Smc1和Smc3形成二聚體環(huán)產(chǎn)生內(nèi)聚力，將姐妹染色單體聚合［20］。同樣，Eco1/Ctf7乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的缺失也會顯著影響雙環(huán)模型中黏結(jié)蛋白聚合姐妹染色單體的效果［16］。Zhang等［21］利用酵母雙雜交測定法分析黏結(jié)蛋白復(fù)合物亞基之間的相互作用，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黏結(jié)蛋白復(fù)合物中不同亞基之間會出現(xiàn)共同免疫沉淀現(xiàn)象，但是當(dāng)每個亞基單獨(dú)存在時則不顯示相似結(jié)果，這證明了雙環(huán)模型相比單環(huán)模型維持染色單體內(nèi)聚的靈活性更好。

聚合桿狀模型是指多個Smc1和Smc3組成的異源二聚體之間形成聚合桿狀環(huán)繞姐妹染色單體［22］。黏著蛋白與著絲粒特定作用的區(qū)域稱為染色體附著區(qū)。Surcel等［23］利用微染色體親和純化的方法，從芽殖酵母中分離出含有染色體附著區(qū)的微染色體，并利用透射電鏡拍攝和生化分析發(fā)現(xiàn)黏結(jié)蛋白是桿狀的，且與姐妹染色單體相互作用。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DNA的斷裂會直接影響聚合桿狀模型與微染色體的結(jié)合，說明黏結(jié)蛋白與姐妹染色單體之間的聯(lián)系是拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)而不是簡單的物理連接。因此黏結(jié)蛋白能夠行使正常活性功能的前提是保證黏結(jié)蛋白亞基的乙?；揎椷^程正常。未來關(guān)于黏結(jié)蛋白的研究還可以通過拓展新的方法，探尋并可視化黏結(jié)蛋白聚合姐妹染色單體的實(shí)際構(gòu)象。

1.2 紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效

紡錘體組裝檢查點(diǎn)（spindle assembly checkpoint，SAC）最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母細(xì)胞中，是一套精確的反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)［24］。紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制通過監(jiān)控有絲分裂后期開啟，確保啟動前姐妹染色單體與紡錘體微管連接正確。釀酒酵母細(xì)胞中的獨(dú)立遺傳學(xué)篩選實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Mad1、Mad2、Mad3、Bub1和Bub3（紡錘體檢查點(diǎn)動粒蛋白基因）基因參與酵母細(xì)胞紡錘體組裝監(jiān)控通路［25］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)紡錘體極復(fù)制基因（Msp1）和極光激酶B基因（AuroraB）也是SAC的組成成分［26］。有絲分裂前中期，Mad2基因編碼的蛋白能夠感應(yīng)細(xì)胞中未與紡錘體微管正確連接的動粒發(fā)出的信號［27］。促進(jìn)后期復(fù)合體（anaphase promoting complex/cyclosome，APC/C），是指含有多個亞基的E3泛素連接酶，參與調(diào)控細(xì)胞周期從中期向后期過渡，是SAC激活的關(guān)鍵底物［28］。Mad1通過發(fā)生磷酸化改變Mad2的構(gòu)象，促使O-Mad2（Open-Mad2）轉(zhuǎn)化為具有穩(wěn)定活性的C-Mad2（Closed-Mad2）構(gòu)型，并結(jié)合APC/C的關(guān)鍵激活因子Cdc20形成有絲分裂檢查點(diǎn)復(fù)合物（MCC）［29-30］。MCC通過抑制APC/CCdc20的活性延遲酵母細(xì)胞有絲分裂后期的開始（圖 2）［31］。

圖2 姐妹染色單體黏結(jié)蛋白與紡錘體監(jiān)控機(jī)制Fig.2 Sister chromatid adhesion protein and spindle monitoring mechanism

泛素化是指泛素分子特定連接蛋白Lys位點(diǎn)進(jìn)行的修飾作用。泛素化修飾過程主要有泛素活化酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3三種酶參與，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的泛素化水平［32］。Reddy［33］等發(fā)現(xiàn)紡錘體檢查點(diǎn)的失效是一個耗能的過程，并依賴于APC/C的多泛素化過程。實(shí)驗(yàn)通過在細(xì)胞中過表達(dá)APC/C，觀察到APC/C發(fā)生多泛素化作用會導(dǎo)致Mad2從Cdc20上解離，使紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效。

磷酸化修飾是指將ATP的磷酸基團(tuán)加載到特定蛋白質(zhì)上的過程，需要磷酸轉(zhuǎn)移酶的調(diào)控作用［34］。Wartrin等［35］發(fā)現(xiàn)發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞存活率會顯著降低且染色體變異事件增加，黏結(jié)蛋白在進(jìn)行細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的同時亞基Smc1和Smc3發(fā)生磷酸化作用，也會導(dǎo)致SAC功能缺陷。此外，Lopes等［36］發(fā)現(xiàn)SAC基因尤其關(guān)鍵組分（如Mad2）失活或表達(dá)不足也會導(dǎo)致SAC失效，進(jìn)而產(chǎn)生非整倍體細(xì)胞甚至誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，有絲分裂過程中染色體的正常分離需要功能正常的SAC蛋白維持和調(diào)控。若SAC相關(guān)亞基的泛素化、磷酸化以及基因表達(dá)不足都會導(dǎo)致紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制失效，并對非整倍體現(xiàn)象普遍存在的癌癥的發(fā)生具有促進(jìn)作用［37］。

2 有絲分裂過程染色體不分離

有絲分裂過程染色體不分離是指細(xì)胞分裂后期姐妹染色單體無法正常分離，一起進(jìn)入相同子細(xì)胞核中，形成染色體數(shù)目不均等的子細(xì)胞［38］?？偨Y(jié)介紹釀酒酵母有絲分裂染色體不分離的原因主要有兩個，動粒與紡錘體微管連接錯誤和多中心體途徑。其中動粒與紡錘體連接錯誤在酵母細(xì)胞中發(fā)生的頻率較高，相關(guān)的研究結(jié)果比較充分。多中心體途徑在一些疾病的發(fā)生過程中較為常見。

2.1 動粒-紡錘體微管連接錯誤

動粒是著絲粒上的多亞基蛋白復(fù)合物，對于有絲分裂染色體的正確分離起著決定性作用［39］。Dam1復(fù)合體位于動粒的外層，是動粒的重要組分之一，在動粒與微管之間起重要的連接作用［40］。動粒在有絲分裂過程中的作用主要包括3個方面，（1）動粒與染色體的運(yùn)動密切相關(guān)，即微管與動粒正確連接且滿足張力時，染色體運(yùn)動并促進(jìn)有絲分裂后期進(jìn)程的開始；（2）紡錘體微管通過與動粒連接捕獲姐妹染色體單體；（3）由動粒通過感知微管連接的張力大小決定紡錘體檢查點(diǎn)的激活或沉默［41］。目前關(guān)于釀酒酵母動粒的研究較為深入，許多組成動粒模型的相關(guān)蛋白或者亞基都是高度保守的［42］。

有絲分裂早期動粒與紡錘體微管的結(jié)合不穩(wěn)定，可能會發(fā)生連接錯誤［43］。酵母細(xì)胞動粒與微管錯誤結(jié)合的方式主要有3種：Monotelic連接、Syntelic連接和Merotelic連接（圖3-a）。Monotelic連接（單極連接）是指有絲分裂中期一對姐妹染色體單體中只有一條染色體的動粒與一極紡錘體微管連接，而另一條染色單體的動粒沒有被紡錘體微管捕獲連接［44］。Cheeseman等［45］通過在酵母細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建熒光表達(dá)蛋白鑒定證明出4個組成Dam1復(fù)合體的新亞基，且無法實(shí)現(xiàn)磷酸化的Dam1復(fù)合體不能及時建立正確的動粒-微管連接，從而導(dǎo)致Monotelic連接在有絲分裂后期出現(xiàn)。

Syntelic連接（同極連接）是指一對姐妹染色單體的動粒都與一側(cè)紡錘體微管連接。有絲分裂中期紡錘體組裝監(jiān)控機(jī)制在接收到Monotelic連接、Syntelic連接的信號后，會延遲細(xì)胞有絲分裂后期的開始。若紡錘體組裝檢查點(diǎn)的功能失活，有絲分裂后期開始前動粒-微管的錯誤連接則得不到糾正，最終會造成細(xì)胞有絲分裂后期一條甚至多條染色體不分離的現(xiàn)象［46］。極光激酶是調(diào)控細(xì)胞有絲分裂過程正確進(jìn)行的一類重要絲氨酸激酶，極光酶B在校正酵母細(xì)胞動粒-微管連接錯誤事件中發(fā)揮重要的作用［47］。缺陷的極光酶B無法感知動粒-微管中產(chǎn)生的張力變化，從而導(dǎo)致細(xì)胞中出現(xiàn)Syntelic連接［48-49］。

Merotelic連接（梅洛蒂克連接）是指一對姐妹染色單體中有一個染色體的動粒與兩極紡錘體微管都發(fā)生連接，且有絲分裂后期Merotelic連接的染色單體會依據(jù)連接兩極微管的多少進(jìn)行運(yùn)動定位。Gregan等［50］認(rèn)為Merotelic連接是生物有絲分裂過程形成非整倍體的主要機(jī)制，同時也是促進(jìn)癌細(xì)胞染色體不穩(wěn)定的主要原因。所以動粒與紡錘體微管之間正確連接的關(guān)鍵是動粒能否正常發(fā)揮功能，以及感知動粒-微管連接張力變化的極光激酶是否可以正常接收信號。

2.2 多中心體途徑

中心體是主要的微管組織中心，不僅調(diào)控微管的成核運(yùn)動，而且推動著細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程［51］。每個細(xì)胞周期中心體僅復(fù)制一次，復(fù)制形成的兩個中心體產(chǎn)生微管并移動到細(xì)胞兩極。若細(xì)胞不能正確調(diào)控中心體的復(fù)制將會出現(xiàn)中心體數(shù)目異?，F(xiàn)象［52-54］。當(dāng)細(xì)胞中中心體數(shù)量超過兩個時，便會出現(xiàn)紡錘絲與動粒之間短暫的多極連接，姐妹染色單體因受力不均勻分離形成非整倍體子細(xì)胞［55］（圖 3-b）。

圖3 動粒-微管結(jié)合錯誤和多中心體途徑Fig.3 Miscellaneous kinetochore-microtubule binding and polycentric pathway

多中心體產(chǎn)生的原因主要包括：中心體擴(kuò)增、中心粒聚合缺陷以及中心體片段化［56］。Polo樣蛋白激酶4（PLK4）是參與調(diào)控中心體復(fù)制過程的重要組分，當(dāng)PLK4過表達(dá)時中心體復(fù)制機(jī)制會發(fā)生缺陷，將會導(dǎo)致一個細(xì)胞周期內(nèi)中心體發(fā)生多次復(fù)制［57-58］。Meraldi等［59］進(jìn)行細(xì)胞中心體復(fù)制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，E2F轉(zhuǎn)錄因子和Cdk2-周期蛋白A活性的激活也是中心體復(fù)制必須的。所以這些蛋白或因子的過表達(dá)都有可能促使細(xì)胞內(nèi)中心體的擴(kuò)增。

然而當(dāng)細(xì)胞中某些蛋白表達(dá)不足時，中心粒之間的聚合張力會降低甚至消失，導(dǎo)致中心粒聚合發(fā)生缺陷［60］。此外，中心體結(jié)構(gòu)的缺陷可能導(dǎo)致片段化的中心粒與微管連接形成極紡錘體［57］。以上3種多中心產(chǎn)生的機(jī)制都會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生多極分裂，即有絲分裂過程形成3個甚至更多個子細(xì)胞核。很多研究表明多極分裂最終導(dǎo)致非整倍體細(xì)胞的產(chǎn)生，尤其在多種癌癥的發(fā)生中較為明顯［61］。

3 總結(jié)與展望

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對酵母有絲分裂過程中染色體異常分離機(jī)制的研究已經(jīng)有了顯著的成果。從最初的細(xì)胞學(xué)觀察到如今深層次的遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)很多蛋白和調(diào)節(jié)因子參與有絲分裂染色體分離，并且起到密切的調(diào)控作用。但是綜合目前的研究會發(fā)現(xiàn)還有很多蛋白或亞基的作用機(jī)制未闡釋清晰，如調(diào)節(jié)動粒-微管連接的Dam1復(fù)合體相關(guān)亞基。此外，是否還有新的調(diào)控蛋白或通路未發(fā)現(xiàn)對于研究者而言也是一個挑戰(zhàn)。其次，染色體分離異常直接導(dǎo)致非整倍體的產(chǎn)生?，F(xiàn)有的研究都表明非整倍體是癌癥細(xì)胞的顯著特征，增加了癌細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，但是非整倍體與腫瘤發(fā)生的關(guān)系亟待進(jìn)一步的研究闡明。最后，在酵母細(xì)胞中染色體分裂異常也會導(dǎo)致多倍體細(xì)胞的形成，但是多倍體細(xì)胞與非整倍體細(xì)胞之間的調(diào)控關(guān)系仍是一個懸而未決的問題。系統(tǒng)且全面的了解和建立不同物種非整倍體形成方式及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是必要的，縮小研究的成本及時間范疇，探尋和解釋細(xì)胞有絲分裂染色體分離異常的原理，并應(yīng)用其解決與人類息息相關(guān)的實(shí)際問題是本研究的終極任務(wù)。