劉 冰,叢文杰,姚兵莉,周化嵐,張建國(guó)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院 食品科學(xué)與工程研究所,上海 200093)

穩(wěn)定性是酶成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素[10],特別是對(duì)于多亞基丙酮酸氧化酶,提升其穩(wěn)定性更為必要。目前,提高多亞基酶穩(wěn)定性的方法有基因突變、化學(xué)修飾、介質(zhì)工程和固定化等[11]。通過(guò)添加穩(wěn)定劑的介質(zhì)工程方法具有操作簡(jiǎn)便、可靠性好的優(yōu)點(diǎn)[12],多數(shù)商業(yè)酶利用該方法儲(chǔ)存。化學(xué)穩(wěn)定劑主要有多元醇、糖類(lèi)和無(wú)機(jī)鹽等,分別具有增強(qiáng)疏水作用和二價(jià)陽(yáng)離子的離子效應(yīng)[12]。然而,穩(wěn)定劑對(duì)酶的作用具有特異性,因此需要根據(jù)不同酶來(lái)選擇合適的穩(wěn)定劑。如,葡萄糖氧化酶、過(guò)氧化物酶和環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性分別通過(guò)添加乙二醇?xì)ぞ厶荹13]、多羥基化合物[14]和復(fù)合穩(wěn)定劑[15]而顯著提高。

本研究首先考察丙酮酸氧化酶在不同pH、環(huán)境溫度條件下的性質(zhì),接著通過(guò)復(fù)配甘油和PEG2000對(duì)丙酮酸氧化酶的活性和穩(wěn)定性進(jìn)行研究,最后將優(yōu)化后的復(fù)合穩(wěn)定劑用于純丙酮酸氧化酶的儲(chǔ)存,以期達(dá)到長(zhǎng)期儲(chǔ)存丙酮酸氧化酶的目的。

1 材料與方法

1.1 丙酮酸氧化酶的制備

所用的分析純化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

粗提丙酮酸氧化酶溶液(酶活1 725.16 U/L、蛋白質(zhì)115.44 mg/L)由重組大腸桿菌[7]發(fā)酵制備。具體步驟如下:20 mL重組大腸桿菌pET28a-pod細(xì)胞在12 000g和4 ℃下離心3 min,然后加入20 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 6.8),于冰浴中以135 W功率、φ2.0 mm 直徑探頭進(jìn)行超聲破碎(JY92-IIDN型,寧波新芝生物技術(shù)有限公司),每個(gè)循環(huán)破碎4 s、間隔6 s,共持續(xù)3 min。隨后破碎液在12 000g和4 ℃下離心5 min,取上清液作為粗提丙酮酸氧化酶溶液。

純丙酮酸氧化酶的制備:首先,1.0 mL純化介質(zhì)(Ni-NTA) 瓊脂糖柱以12 000g離心1 min,并用0.1 mol/L PBS(pH 6.8) 洗滌2次。接著將5 mL 粗提丙酮酸氧化酶溶液與Ni-NTA在16 ℃下混合1 h,然后以12 000g離心1 min去除上清液。最后,加入10 倍體積的20 mmol/L PBS(pH 6.8)洗滌。而Ni-NTA 瓊脂糖柱用含有500 mmol/L咪唑的20 mmol/L PBS (pH 6.8) 洗滌,并通過(guò)1 h振蕩和12 000g離心1 h的方法獲得的丙酮酸氧化酶溶液(236.63 U/L),即為純丙酮酸氧化酶溶液。

1.2 不同pH對(duì)粗提丙酮酸氧化酶的影響

將1 mL 粗提丙酮酸氧化酶溶液與 9 mL 0.1 mol/L PBS(用醋酸鈉調(diào)節(jié)pH至4.0 和5.0,用K3PO4調(diào)節(jié)pH 至6.0、6.8、7.0、8.0和9.0)混合,初始的酶活設(shè)為100%,并在4或20 ℃下儲(chǔ)存5 h,每小時(shí)測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活。

1.3 溫度對(duì)粗提丙酮酸氧化酶的影響

將1 mL丙酮酸氧化酶溶液與9 mL 0.1 mol/L PBS(pH 6.8)混合,初始酶活設(shè)為100%,于不同溫度條件下保持5 h,每小時(shí)測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活。

宿舍信息管理主要是實(shí)現(xiàn)宿舍衛(wèi)生評(píng)比，住宿費(fèi)、水電費(fèi)、違紀(jì)和維修信息的登記，外來(lái)人員出入宿舍登記，同時(shí)也是對(duì)宿舍樓棟和房間的使用情況進(jìn)行定期地記錄等。

1.4 穩(wěn)定劑對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

將穩(wěn)定劑添加到粗提丙酮酸氧化酶溶液中,將終體積為150 μL的樣品于20 ℃下儲(chǔ)存2 h,以未添加穩(wěn)定劑的丙酮酸氧化酶酶活作為初始酶活(100%)。表1為含有0.01 mmol/L CuSO4的甘油和PEG2000作為復(fù)合穩(wěn)定劑的組成。

表1 甘油和PEG2000混合物的濃度梯度

1.5 復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)純丙酮酸氧化酶性質(zhì)的影響

1)熱穩(wěn)定性。將含有優(yōu)化后穩(wěn)定劑的1 mL丙酮酸氧化酶溶液置于不同溫度下儲(chǔ)存5 h,每小時(shí)測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活,以未添加穩(wěn)定劑且未保溫的純丙酮酸氧化酶的酶活為100%。

2)pH穩(wěn)定性。將1 mL純丙酮酸氧化酶溶液與 9 mL不同pH的PBS(用0.1 mmol/L醋酸鈉調(diào)節(jié)pH至 4.0和5.0,用0.1 mmol/L PBS調(diào)節(jié)pH至 6.0、6.8、7.0、8.0和9.0)混合,分別置于20 ℃保持5 h,每隔1小時(shí)測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活,以未保溫的純丙酮酸氧化酶的酶活為100%。

3)保藏穩(wěn)定性。將1 mL純丙酮酸氧化酶溶液與9 mL 0.1 mol/L PBS(pH 6.0)混合,分別置于不同溫度(4、20、25和30 ℃)中保持5 h,每小時(shí)測(cè)定酶活。以未保溫的純丙酮酸氧化酶初始酶活設(shè)為100%。

1.6 穩(wěn)定劑對(duì)純丙酮酸氧化酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響

添加復(fù)合穩(wěn)定劑的丙酮酸氧化酶溶液(0.1 mol/L PBS,pH 6.0)分別在-20、4和20 ℃下儲(chǔ)存。以未添加穩(wěn)定劑的純丙酮酸氧化酶的酶活為100%。

1.7 丙酮酸氧化酶酶活的測(cè)定

將100 μL丙酮酸氧化酶溶液與1.0 mL反應(yīng)液混合,反應(yīng)液含有0.1 mol/L丙酮酸鈉、0.015 mol/L MgCl2、9 g/L苯酚、1.5 mmol/L 4-氨基安替比林、0.1 mol/L PBS (pH 6.8)、0.1 mmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸、1.0 mmol/L焦磷酸硫胺素和50 U/mL辣根過(guò)氧化物酶,于37 ℃孵育10 min。隨后,使用酶標(biāo)儀(LMR-340M型,Labexim International公司)在510 nm處測(cè)定吸光度A510。丙酮酸氧化酶的酶活定義:37 ℃、pH 6.8條件下,每分鐘生成的1 μmol的H2O2所需要的酶量為1個(gè)酶活單位(U)。

1.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

將丙酮酸氧化酶置于37 ℃水浴中,每隔1 h取出一定量樣品測(cè)定酶活,重復(fù)測(cè)定3次,取平均值后計(jì)算酶的殘留酶活。丙酮酸與氧化酶失活速率常數(shù)(Kd)以酶的殘留酶活的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),時(shí)間t為橫坐標(biāo),通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)的線(xiàn)性擬合獲得,其酶的失活半衰期(t1/2)按式(1)計(jì)算而得到。

(1)

在37 ℃和pH 6.8條件下,丙酮酸氧化酶和不同濃度的丙酮酸鈉(0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、1.8、2.0、2.5、3.5和4.0 mol/L) 在 0.1 mol/L PBS 中反應(yīng),測(cè)定丙酮酸氧化酶的酶活,利用米氏方程計(jì)算重組丙酮酸氧化酶的最大反應(yīng)速率(Vmax)。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH和溫度對(duì)粗丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

考察pH和溫度對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知:粗丙酮酸氧化酶的酶活在pH 6.0時(shí)最高,在 pH 6.8、7.0、8.0、9.0、5.0和4.0時(shí)的相對(duì)酶活分別為對(duì)照的86.3%、82.8%、81.0%、60.0%、46.7%和9.9%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),丙酮酸氧化酶的酶活在pH 6.0、6.8和7.0時(shí)緩慢下降,5 h后,相對(duì)酶活分別降至81.1%、60.8%和59.8%。在pH 5.0、8.0和9.0條件下,丙酮酸氧化酶儲(chǔ)存1 h后相對(duì)酶活顯著降至29.6%、45.3%和24.6%,5 h后相對(duì)酶活分別降至13.9%、32.1%和17.7%。而當(dāng)pH 4.0時(shí),丙酮酸氧化酶的酶活在4 h內(nèi)穩(wěn)定為8%～9%,但在5 h時(shí)完全失去酶活。

圖1 pH和溫度對(duì)丙酮酸氧化酶酶活的影響

在4～60 ℃范圍內(nèi),丙酮酸氧化酶的酶活均隨時(shí)間延長(zhǎng)而下降。當(dāng)丙酮酸氧化酶在4 ℃條件下儲(chǔ)存5 h后,相對(duì)酶活緩慢降至 69.7%;在20、25和40 ℃下儲(chǔ)存5 h后,丙酮酸氧化酶的相對(duì)酶活分別降至28.8%、15.4%和0。在37 ℃下儲(chǔ)存3 h以及在40、50和60 ℃儲(chǔ)存2 h后,丙酮酸氧化酶均完全失去酶活。盡管綠色氣球菌的丙酮酸氧化酶的酶活在4 ℃下可以穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)小時(shí),但相對(duì)來(lái)說(shuō),總體酶活較低。

表2和表3為丙酮酸氧化酶在不同pH和溫度下的失活速率常數(shù)和半衰期。由表2和3可知:丙酮酸氧化酶在pH 6.0時(shí)有最小的失活速率常數(shù)和最大的半衰期;丙酮酸氧化酶的失活速率常數(shù)隨著溫度升高而增大,半衰期隨著溫度升高而降低。丙酮酸氧化酶的不穩(wěn)定性主要?dú)w因于其四聚體結(jié)構(gòu)[16]。丙酮酸氧化酶在酸性和堿性條件下,穩(wěn)定性急劇下降可能是由于其亞基的解離[17]。因此,采用穩(wěn)定劑有助于提高丙酮酸氧化酶的穩(wěn)定性,有利于丙酮酸氧化酶的儲(chǔ)存。

表2 不同pH下丙酮酸氧化酶的半衰期

表3 不同溫度下丙酮酸氧化酶的半衰期

2.2 穩(wěn)定劑對(duì)粗提丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

為了提高丙酮酸氧化酶的穩(wěn)定性,考察多元醇類(lèi)、大分子有機(jī)物類(lèi)、糖類(lèi)和金屬離子這4類(lèi)穩(wěn)定劑對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知:對(duì)照組的丙酮酸氧化酶儲(chǔ)存5 h后相對(duì)酶活約為40%,添加的異丙醇對(duì)丙酮酸氧化酶的酶活具有抑制作用;而添加10～500 g/L的其他6種多元醇后,丙酮酸氧化酶的酶活隨多元醇添加量呈鐘形分布。當(dāng)添加200 g/L乙醇、200 g/L乙二醇、300 g/L甘油、300 g/L山梨醇、200 g/L PEG400和300 g/L PEG2000時(shí),丙酮酸氧化酶的相對(duì)酶活分別為71.2%、82.1%、103.3%、94.8%、74.2%和114.4%,分別是對(duì)照組的1.5、1.9、2.6、2.3、1.7和2.6倍。

圖2 穩(wěn)定劑加量對(duì)粗提丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

添加0.5～8 g/L明膠和果膠均對(duì)丙酮酸氧化酶的酶活有抑制作用。

添加海藻糖、葡萄糖、蔗糖和鼠李糖后發(fā)現(xiàn),只有鼠李糖對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性有提高作用。當(dāng)添加5 g/L鼠李糖時(shí),丙酮酸氧化酶酶活為對(duì)照組的1.1倍。

添加不同金屬離子后發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,MnSO4和ZnCl2對(duì)丙酮酸氧化酶酶活有抑制作用;(NH4)2SO4對(duì)丙酮酸氧化酶酶活的影響不顯著;而金屬離子Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cu2+和Fe2+對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性都具有一定的提高作用,且丙酮酸氧化酶的相對(duì)酶活隨金屬離子添加量呈鐘形分布。當(dāng)分別添加0.03 mmol/L NaCl、0.03 mmol/L KCl、0.1 mmol/L CaCl2、0.03 mmol/L MgSO4、0.01 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L FeSO4時(shí),丙酮酸氧化酶的相對(duì)酶活分別為初始酶活的56.4%、52.3%、52.8%、38.2%、72.7%和42.0%,是對(duì)照組的1.3、1.5、1.1、1.2、1.7和1.3倍,其中添加0.01 mmol/L CuSO4時(shí),丙酮酸氧化酶的穩(wěn)定性最佳,與Lu等[9]的研究結(jié)果相一致。

由于金屬離子和多元醇穩(wěn)定酶活的作用機(jī)制并不相同,因此將0.01 mmol/L CuSO4作為儲(chǔ)存丙酮酸氧化酶的基礎(chǔ)溶液,再進(jìn)一步優(yōu)化甘油和PEG2000的配方(表1),結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知:丙酮酸氧化酶的相對(duì)酶活最終為68.0%～102.9%。添加30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合物和60 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合物具有相同的效果,但由于30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合液黏度低于60 g/L甘油與90 g/L PEG2000的混合液,所以選擇30 g/L甘油、90 g/L PEG2000的混合液進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。最后,使用含有30 g/L甘油和90 g/L PEG2000、0.01 mmol/L CuSO4作為復(fù)合穩(wěn)定劑后,丙酮酸氧化酶在20 ℃儲(chǔ)存2 h后的酶活仍為初始酶活的102.9%。

圖3 不同甘油和PEG2000添加量對(duì)丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性影響結(jié)果的等高線(xiàn)

2.3 純丙酮酸氧化酶特性的表征

考察pH和溫度對(duì)純丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知:丙酮酸氧化酶酶活在pH 6.0時(shí)始終保持最佳,pH 6.8時(shí)次之。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng),最終分別降至初始酶活的56.2%和12.6%。盡管丙酮酸氧化酶在4和20 ℃儲(chǔ)存1 h后的酶活高于它的初始酶活,但總體來(lái)說(shuō),丙酮酸氧化酶的酶活隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。與粗提丙酮酸氧化酶溫度穩(wěn)定性不同的是,純丙酮酸氧化酶在20 ℃儲(chǔ)存時(shí)的酶活高于4 ℃時(shí)的酶活。

圖4 純丙酮酸氧化酶的pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性

2.4 復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)純丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

在4和20 ℃及不同pH條件下儲(chǔ)存5 h后,考察復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)純丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知:當(dāng)保藏條件為4 ℃、pH為5.0～8.0時(shí),添加復(fù)合穩(wěn)定劑的丙酮酸氧化酶的酶活高于對(duì)照組,且在pH 6.0時(shí)相對(duì)酶活為119.0%,為對(duì)照組的1.5倍;當(dāng)保藏條件為20 ℃、pH 5.0時(shí),復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)丙酮酸氧化酶酶活的影響不顯著;但當(dāng)pH為6.0～9.0時(shí),復(fù)合穩(wěn)定劑顯著提高了丙酮酸氧化酶的酶活,尤其當(dāng)pH為6.0時(shí),丙酮酸氧化酶酶活為初始酶活的109.8%。這可能由于添加復(fù)合穩(wěn)定劑增強(qiáng)了丙酮酸氧化酶亞基之間的連接。

圖5 復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)純丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性的影響

表4為復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)丙酮酸氧化酶的最大反應(yīng)速率的影響。由表4可知:丙酮酸氧化酶在380.2 mg/L時(shí),最大反應(yīng)速率增加了91.22%,為最大提高幅度。這表明復(fù)合穩(wěn)定劑在較高濃度的丙酮酸氧化酶中更易形成穩(wěn)定的立體構(gòu)象,酶活更穩(wěn)定[16]。Vmax的升高也證實(shí)了添加復(fù)合穩(wěn)定劑使丙酮酸氧化酶亞基更易組合成有酶活的丙酮酸氧化酶。

表4 添加復(fù)合穩(wěn)定劑的丙酮酸氧化酶的最大反應(yīng)速率

通常,酶在4或-20 ℃下儲(chǔ)存以保持較佳的活性,但丙酮酸氧化酶在4 ℃條件下儲(chǔ)存20 d后,酶活降至0;雖然在-20 ℃儲(chǔ)存7 d后仍保持100%酶活,但在28 d后,酶活降至46.7%(圖5(c))。

目前,提高酶穩(wěn)定性的方法主要有蛋白質(zhì)改造、固定化和添加穩(wěn)定劑等,但利用基因工程方法改造丙酮酸氧化酶的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。劉冰等[18]采用溶膠-凝膠的方法固定化丙酮酸氧化酶,5 h后剩余酶活為66.4%。本研究?jī)?yōu)化后的復(fù)合穩(wěn)定劑使用方便,28 d后仍剩余46.7%的酶活,可見(jiàn)復(fù)合穩(wěn)定劑的效果較好,且成本較低,有進(jìn)一步推廣的價(jià)值。

3 結(jié)論

對(duì)不同種類(lèi)穩(wěn)定劑篩選可知,甘油、PEG2000和CuSO4這3種穩(wěn)定劑對(duì)維持丙酮酸氧化酶酶活有效,而糖類(lèi)對(duì)丙酮酸氧化酶酶活沒(méi)有顯著影響。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后,含有0.01 mmol/L CuSO4、30 g/L甘油和90 g/L PEG2000的復(fù)合穩(wěn)定劑顯著提高丙酮酸氧化酶穩(wěn)定性。含有復(fù)合穩(wěn)定劑的丙酮酸氧化酶在4 ℃下的酶活為對(duì)照組的1.5倍。添加復(fù)合穩(wěn)定劑使丙酮酸氧化酶在-20 ℃下儲(chǔ)存28 d后仍保持46.7%的酶活,顯著提高了丙酮酸氧化酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性,有助于丙酮酸氧化酶的更廣泛應(yīng)用。