□ 林金新 福建齊衡科技有限公司

丙酮酸鈣是丙酮酸的鈣鹽，其性質(zhì)穩(wěn)定，主要作用有減肥清脂、增加耐力、鈣營養(yǎng)補充劑、降低膽固醇和低密度膽固醇、改善心臟功能等[1]。至今為止未發(fā)現(xiàn)任何副作用，也可以通過興奮劑測試，所以丙酮酸鈣剛在美國上市就被評為A類膳食補充劑。其生產(chǎn)方法有天然提取、化學合成，天然提取由于從蘋果中提取收率低、成本高不具有工業(yè)生產(chǎn)意義，目前主要使用化學合成制備丙酮酸鈣，以丙酮酸為底物，鈣的來源為碳酸鈣分解為氧化鈣，再加水生產(chǎn)氫氧化鈣，與丙酮酸反應生產(chǎn)丙酮酸鈣[2]。而丙酮酸的來源主要有酒石酸合成法和發(fā)酵法，酒石酸合成丙酮酸鈉的工藝簡單但污染嚴重，同時成本過高，達8元/t[3]；發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸，使用光滑球擬酵母發(fā)酵70 h左右，丙酮酸含量70 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率70%，發(fā)酵成本低但周期長，且發(fā)酵液中雜質(zhì)過多，不適合直接使用丙酮酸溶液進行丙酮酸鈣的合成[4]。開發(fā)酶法生產(chǎn)丙酮酸鈣的工藝對其生產(chǎn)來說具有一定的現(xiàn)實意義，具有一定的工藝創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

表達乳酸氧化酶的大腸桿菌基因工程菌E.coli-pET28a-MLOD，本實驗室構建保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨（OXOID）10 g/L、酵母提取物（OXOID）5 g/L、NaCl 10 g/L，121 ℃ 滅 菌22 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（TB）：甘油5 g/L、細菌學蛋白胨（環(huán)凱）24 g/L、酵母提取物（環(huán)凱）12 g/L、KH2PO42.31 g/L、 K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，121 ℃滅菌 22 min。

1.1.3 藥品、試劑

L-乳酸（河南金丹）、過氧化氫酶（夏盛）、氫氧化鈣（國藥）。

1.1.4 儀器

梅特勒pH計、電動攪拌器、真空循環(huán)水泵恒溫水浴鍋、搖床、滅菌鍋、鼓風干燥箱和恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶發(fā)酵工藝

以上兩起謠言稍有點科學常識的人都能辨別，但前幾年熱炒的“碘鹽致癌”論，則顯得有科學性了。隨著人們生活習慣和環(huán)境的改變，國家標準也會進行適當?shù)恼{(diào)整，如2011年國家標準將食鹽中碘含量從20-50mg/kg（mg/kg）調(diào)整為20～30 mg/kg，這本是正常的事情，卻有人質(zhì)疑道，是不是我們過去吃碘太多了？而碘攝入過多，會引起甲狀腺癌，于是得出結論：我國居民過去吃碘太多，引起了甲狀腺癌高發(fā)。其實，只要看一看國家食品安全風險評估中心的《中國食鹽加碘和居民碘營養(yǎng)狀況的風險評估》報告，就知道過去的碘攝入并未引起甲狀腺癌高發(fā)。

甘油管中劃LB平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h；從平板中挑取單菌落至LB試管，37 ℃，220 r/min恒溫搖床培養(yǎng)16 h；從LB試管按接種量2%接種至TB搖瓶（裝液量20%），37 ℃培養(yǎng)4～5 h，然后加入誘導劑IPTG至終濃度0.2 mmol/L，降溫至30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)20 h結束發(fā)酵。

1.2.2 酶催化工藝

發(fā)酵菌體離心收集后，-20 ℃冷凍16 h待用。使用5 L搖瓶，裝液量1 L，加入濃度100 g/L的L-乳酸，調(diào)節(jié)pH和溫度至預定值，加入冷凍菌體和過氧化氫酶，固定轉(zhuǎn)速250 r/min，生物酶膜反應器SBA-40E檢測乳酸含量，直至無底物殘留停止反應，溫度、pH和過氧化氫酶的添加量做單因素試驗確定。

（1）溫度。濕菌投量4%，初始pH8.0，過氧化酶添加量2%，溫度控制10、15、20、25、30、35 ℃和40 ℃，反應1 h檢測丙酮酸含量。

（2）pH。濕菌投量4%，溫度20 ℃，過氧化酶添加量2%，pH控制6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，反應1h檢測丙酮酸含量。

（3）過氧化酶添加量。濕菌投量4%，溫度20 ℃，pH 8.0，過氧化酶添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%，反應1 h檢測丙酮酸含量。

1.2.3 丙酮酸鈣合成工藝

配制500 mL 20%的氫氧化鈣乳液，保溫50℃，保持攪拌。緩慢滴加丙酮酸轉(zhuǎn)化液，直至pH 7.0～7.5。pH穩(wěn)定后，逐漸降溫至20 ℃以下，抽濾收集晶體，烘干稱重，HPLC測定丙酮酸鈣的含量。

1.3 丙酮酸和丙酮酸鈣含量測定[5]

2 結果與分析

2.1 酶催化工藝條件試驗

2.1.1 最適溫度

如圖1所示，乳酸氧化酶酶活隨溫度的升高呈拋物線變化，先上升再下降。在低溫區(qū)域，溫度升高有利于底物與酶的有效結合，促進酶促反應；在高溫區(qū)域，溫度升高不利于酶的穩(wěn)定性，所以乳酸氧化酶的最適溫度應在20 ℃。

2.1.2 最適pH

如圖2所示，隨pH增加，乳酸氧化酶的酶活也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于pH 8.0丙酮酸含量最高，最適pH應為8.0。

2.1.3 過氧化氫酶（CAT）添加量

圖1 不同溫度條件對乳酸氧化酶酶活的影響

圖2 不同pH對乳酸氧化酶酶活的影響

圖3 不同CAT添加量對酶活的影響

如圖3所示，隨著過氧化氫酶的添加量增加，丙酮酸含量先升高再降低。這是因為乳酸生產(chǎn)丙酮酸的過程中，會有副產(chǎn)物過氧化氫生產(chǎn)，過氧化氫會分解丙酮酸。所以增加CAT的含量有助于丙酮酸的積累，但如果CAT含量過高，CAT酶液中的雜質(zhì)會一定程度上抑制酶活，最終選取2%為CAT的添加量。

2.1.4 小結

發(fā)酵菌體離心收集后，-20 ℃冷凍16 h待用。使用5 L搖瓶，裝液量1 L，加入濃度100 g/L的L-乳酸，調(diào)節(jié)pH 8.0，20 ℃，加入40 g冷凍菌體和20 mL過氧化氫酶，固定轉(zhuǎn)速250 r/min，生物酶膜反應器SBA-40E檢測乳酸含量，直至無底物殘留或底物不減少停止反應。反應24 h后經(jīng)HPLC檢測丙酮酸含量為89.6 g/L，乳酸未檢出。

2.2 丙酮酸鈣合成工藝

配制500 mL 20%的氫氧化鈣乳液，保溫50 ℃，保持攪拌。緩慢滴加2.1中所得丙酮酸轉(zhuǎn)化液，直至pH 7.0～7.5。pH穩(wěn)定后，逐漸降溫至20 ℃以下，抽濾收集晶體，烘干稱重，HPLC測定丙酮酸鈣的含量。

上述反應共滴加丙酮酸轉(zhuǎn)化液1 060 mL，含丙酮酸約95 g，與氫氧化鈣的摩爾比約為0.8∶1，抽濾后烘干稱重為100.9 g，丙酮酸鈣含量經(jīng)HPLC檢測為91.7%，核算純丙酮酸鈣的收率為80.1%。

3 結論與展望

以乳酸為底物通過乳酸氧化酶合成丙酮酸，然后用丙酮酸轉(zhuǎn)化液代替市售丙酮酸鈉作為底物合成丙酮酸鈣，經(jīng)實驗證明，該路線具有可行性，并在丙酮酸鈣的工業(yè)生產(chǎn)上具有較大的應用價值，可以減少污染并增加丙酮酸鈣的產(chǎn)品附加值。