高 盼,鄒巧根

(1.南京工業(yè)大學 生物與制藥工程學院,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學 藥學院,江蘇 南京 211800)

乙型肝炎病毒(HBV)是一個世界性的公眾健康難題,據(jù)統(tǒng)計,全世界至少有數(shù)億人曾感染過HBV[1]。每年有3億多人為HBV慢性感染者,我國是HBV感染的高流行區(qū)[1]。慢性乙型肝炎(CHB)感染者前期大多無明顯癥狀,直到發(fā)病后期才會出現(xiàn)。臨床治療CHB目前以采取干擾素、核苷酸類似物為主[2-3]。富馬酸替諾福韋二吡呋酯作為一種新型的核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑[4-5],由美國Cilead公司開發(fā),可有效對抗多種病毒,被用于治療病毒感染疾病,也是治療CHB的首選藥物之一。

元素雜質(zhì)可能存在于原料、輔料或制劑中。主要來源于藥物合成中催化劑的殘留;或是由藥品生產(chǎn)制備過程中引入;或輔料中存在的,由生產(chǎn)設備、或是由容器密閉系統(tǒng)引入。某些元素雜質(zhì)不僅會對藥品的穩(wěn)定性、保質(zhì)期產(chǎn)生不利影響,還可能因為潛在的毒性,從而引發(fā)副反應[6]。根據(jù)文獻[7]的規(guī)定:口服給藥途徑的風險應評估1類元素雜質(zhì)砷(As)、鎘(Cd)、鉛(Pb)、汞(Hg)和2A類元素雜質(zhì)釩(V)、鈷(Co)和鎳(Ni)在藥品中的可能性。富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒在制劑生產(chǎn)過程中,使用了加工助劑聚乙烯,而鈦(Ti)系催化劑,作為目前應用最廣泛的聚烯烴催化劑,在反應過程中易存在殘留的風險[8]。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)對比電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)具有靈敏度高、檢出限低及分析速度快等優(yōu)點[9]。參照中、美藥典中相關(guān)要求和準則[10-11],筆者建立了濕法消解,即ICP-MS法測定富馬酸替諾福韋二吡呋酯中元素雜質(zhì)含量的方法,以期為產(chǎn)品質(zhì)量的控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 7800電感耦合等離子體質(zhì)譜儀,美國安捷倫公司;Digiblock EHD36電熱消解儀,北京市萊伯泰科公司;MilliDirectQ純水儀,美國密理博公司;XS105十萬分之一電子分析天平,美國梅特勒公司。

1.2 試劑

HNO3(批號:C0210606,UP級),德國CNW Technologies Gmb21公司;試驗用水均為超純水;富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒(批號:190122121、190124121、190126121、190310121、190312121和190314121),南京市海納醫(yī)藥科技股份有限公司;容量瓶均為聚4-甲基-1-戊烯(PMP)材質(zhì)。

As、Cd、Pb、Hg、Co、V和Ni單元素標準溶液各100 μg/mL,Ti單元素標準溶液10 000 μg/mL,國家有色金屬及電子材料分析測試中心;鋰(Li)、鈧(Sc)、鍺(Ge)、銠(Rh)、銦(In)、鋱(Tb)、镥(Lu)和鉍(Bi)多元素內(nèi)標溶液各100 μg/mL,美國安捷倫科技有限公司。

2 方法

2.1 儀器的工作條件

射頻功率(RF)1 550 W,等離子體流量15 L/min,采樣深度10.0 mm,霧化室溫度2 ℃,蠕動泵速0.1 r/s,載氣流量1.07 L/min,He碰撞模式,He流量5.0 mL/min,測量方式為跳峰采樣模式,每峰采樣點為3,重復次數(shù)6次,采集質(zhì)量數(shù)為47Ti、51V、59Co、60Ni、75As、111Cd、201Hg和208Pb,積分時間為0.999 s。

2.2 內(nèi)標溶液的配制

精密量取內(nèi)標溶液0.1 mL,置于100 mL容量瓶中,用HNO3與水混合溶液(體積比為1∶99)稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL的內(nèi)標儲備液。

2.3 標準曲線溶液的配制

分別精密量取As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti單元素標準溶液0.30、0.10、0.10、0.60、1.00、2.00、4.00和2.60 mL,置于100 mL量瓶中,用HNO3與水混合溶液(體積比為1∶99)稀釋至刻度,搖勻,制成質(zhì)量濃度分別為0.3、0.1、0.1、0.6、1.0、2.0、4.0和260.0 μg/mL的混合元素儲備液。

分別精密量取0.025、0.075、0.125、0.200、0.250、0.300和0.375 mL上述混合元素儲備液,置于25 mL量瓶中,用HNO3與水混合溶液(體積比為1∶99)稀釋至刻度,搖勻,作為10%、30%、50%、80%、100%、120%及150%標準曲線溶液。以同樣方法制備空白試劑。

2.4 供試品溶液的配制

取富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒50 mg,精密稱定后,置于聚四氟乙烯消解罐中,移入濃HNO35 mL,混勻,置于電熱消解儀上,130 ℃消解30 min,消解后,于130 ℃趕酸30 min,取出放冷,將消解液全部轉(zhuǎn)至25 mL量瓶中,用純水洗滌消解罐2～3次,洗液并入量瓶中,用純水定容至刻度,搖勻后即得。以同樣方法制備空白試劑。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性實驗的測定結(jié)果

取空白試劑及標準曲線溶液,依次進樣測定,以待測元素強度與內(nèi)標強度比(Y)為縱坐標,質(zhì)量濃度(X)為橫坐標,進行線性回歸,得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表1。由表1可知:8種元素雜質(zhì)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)>0.999 1。

表1 線性實驗結(jié)果

3.2 LOD、LOQ的實驗測定結(jié)果

連續(xù)進樣11次,以空白試劑響應值的3.3倍標準差對應的濃度作為LOD,以空白試劑響應值的10倍標準差對應的濃度作為LOQ。根據(jù)式(1)和(2)計算LOD和LOQ。

LOD=3.3δ/S

(1)

LOQ=10δ/S

(2)

式中:δ為連續(xù)測定空白樣品中各元素雜質(zhì)的每秒計數(shù)(CPS)比率的標準偏差;S為標準曲線的斜率。

3.3 專屬性實驗的測定結(jié)果

按2.3及2.4節(jié)方法,分別制備空白試劑、空白樣品、混合元素對照品(100%限度濃度水平)及樣品+對照品(100%限度濃度水平),測定各元素的CPS與內(nèi)標元素的CPS的比(以下簡稱CPS比率),結(jié)果見表2和圖1～4。由表2和圖1～4可知:溶劑和樣品經(jīng)稀釋后,均不干擾各元素的檢測,表明該方法的專屬性良好。

圖1 空白試劑的專屬性測定結(jié)果

圖2 對照品的專屬性測定結(jié)果

圖3 空白樣品的專屬性測定結(jié)果

圖4 樣品+對照品的專屬性測定結(jié)果

表2 專屬性實驗測定結(jié)果 (CPS比率)

3.4 重復性實驗的測定結(jié)果

取6份富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒適量,精密稱定后,準確加入混合元素對照品0.250 mL,按2.4節(jié)方法制備樣品,按2.1節(jié)儀器參數(shù)測定樣品,要求每個元素濃度的相對標準偏差(RSD)不超過20%。結(jié)果發(fā)現(xiàn):As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分別為2.0%、1.5%、1.4%、3.7%、0.3%、0.3%、0.4%和0.6%,結(jié)果均不高于3.7%,表明該方法的重復性良好。

3.5 中間精密度實驗的測定結(jié)果

由不同分析員在不同時間,按2.4節(jié)方法制備6份樣品,上機檢測后,考察隨機變動因素對實驗數(shù)據(jù)的影響,要求每個元素濃度的RSD均不超過25%。結(jié)果發(fā)現(xiàn):As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分別為1.7%、1.4%、4.5%、2.9%、0.6%、0.4%、0.7%和0.6%,結(jié)果均不高于2.9%,表明該方法的中間精密度良好。

3.6 準確度實驗的測定結(jié)果

取9份富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒適量,精密稱定后,分為3組,每組分別準確加入0.075、0.250和0.375 mL混合元素的對照品,作為低、中和高濃度水平樣品,按2.4節(jié)方法制備樣品,按2.1節(jié)儀器參數(shù)測定樣品,要求每個元素的平均回收率均在70%～130%,每個元素濃度的RSD不超過15%,結(jié)果見表3。由表3可知:8個元素3個水平的平均回收率均在89.1%～100.4%,RSD均不高于4.8%,表明該方法的準確度良好。

表3 加樣回收率實驗測定結(jié)果(n=9)

3.7 耐用性實驗的測定結(jié)果

按2.1節(jié)儀器工作參數(shù)進樣,測定100%限度濃度水平的供試品,要求每個元素濃度RSD應不高于20%。結(jié)果發(fā)現(xiàn):As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti元素的RSD分別為1.1%、2.0%、0.5%、4.8%、0.3%、0.4%、0.4%和1.1%,表明該方法的耐用性良好。

3.8 穩(wěn)定性實驗的測定結(jié)果

按2.1節(jié)儀器工作參數(shù)進樣,測定100%限度濃度水平的加標供試品溶液,于室溫條件下分別在0、1、2、4、6和8 h時間點進樣測定,要求各元素CPS比率RSD應不高于20%。結(jié)果發(fā)現(xiàn):As、Cd、Pb、Hg、Co、V、Ni和Ti各元素CPS比率的RSD分別為1.9%、1.0%、0.9%、2.1%、0.4%、0.5%、0.4%和1.3%,表明供試品在室溫8 h下基本穩(wěn)定。

3.9 樣品的測定結(jié)果

按2.4節(jié)方法制備供試品,按2.1節(jié)儀器參數(shù)檢測6批次樣品中8種元素的雜質(zhì)含量,結(jié)果見表4。由表4可知:各批次樣品元素雜質(zhì)含量均低于樣品限度。

表4 樣品測定結(jié)果

表5 元素PDE和J的轉(zhuǎn)換

3.10 元素雜質(zhì)限度的測定結(jié)果

富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒每日最大攝入量為300 mg,1類元素雜質(zhì)(As、Cd、Pb和Hg)和2A類元素雜質(zhì)(V、Co和Ni)參考文獻[7]中元素限度要求,藥品的每日攝入量不超過10 g的以10 g計。按文獻[12]中的分類,并沒有將Ti元素歸類,因此,將其歸為第三類金屬,每日允許最大暴露量(PDE)按13 000 μg計,按式(3)計算各元素雜質(zhì)限度濃度。

(3)

3.11 內(nèi)標元素的選擇結(jié)果

內(nèi)標是添加到空白樣品和未知樣品中的一種或幾種元素,必須是一類容易測量的獨特元素,正確使用內(nèi)標可以校正信號的干擾[13]。內(nèi)標元素的選擇通常有2種標準:①通過質(zhì)量(最接近分析物的質(zhì)量);②基于元素電離勢能(IP)的匹配。本實驗結(jié)合上述2種標準,選擇45Sc作為Ti、V、Co和Ni的內(nèi)標,72Ge作為As的內(nèi)標,103Rh作為Cd的內(nèi)標,209Bi作為Hg、Pb的內(nèi)標,使用T型混合三通在線引入內(nèi)標。

3.12 前處理條件的選擇結(jié)果

對于非難溶樣品消解可以選擇濕法消解,而富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒在水中呈微溶狀態(tài),因此,選擇濕法消解并采用環(huán)繞加熱方式,在常壓狀態(tài)下可達到快速、穩(wěn)定的樣品處理效果。

對HNO3的用量、消解溫度和消解時長等條件進行考察,在考察每個單一條件時,固定其他條件不變。HNO3用量選擇2、3、4和5 mL,消解溫度選擇110、120、130和140 ℃,消解時長選擇20、25、30和35 min。結(jié)果表明:在使用HNO3為5 mL,消解溫度為130 ℃,消解時長為30 min時,樣品能夠完全消解,溶液呈現(xiàn)完全澄清狀態(tài)。

4 結(jié)論

建立了一種ICP-MS法測定富馬酸替諾福韋二吡呋酯顆粒中8種元素雜質(zhì)的檢測方法,該方法簡單快速、靈敏度高且專屬性好,具有良好的準確度,可用于對其進行質(zhì)量控制。該方法實驗結(jié)果均遠低于雜質(zhì)限度,滿足相關(guān)的限度要求,對藥品的質(zhì)量控制具有重要意義。