劉小改，馬美榮，周林艷，王小偉，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京 101400）

乙酸乙酯是清香型白酒中特征香氣成分，通常表現(xiàn)為水果香、花香和甜香，對(duì)增加白酒香氣、醇厚度、提升白酒品質(zhì)有重要作用[1]。二鍋頭白酒作為清香型白酒代表之一，其中乙酸乙酯的含量是衡量酒質(zhì)好壞的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[2]。清香型白酒釀造過(guò)程中，乙酸乙酯主要來(lái)自于產(chǎn)酯酵母。產(chǎn)酯酵母又稱(chēng)生香酵母，是一類(lèi)能夠代謝生成酯類(lèi)物質(zhì)的酵母菌總稱(chēng)，通常包括漢遜酵母屬（Hansenula）、畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）等[3-5]。該類(lèi)酵母能夠在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程利用葡萄糖代謝產(chǎn)生乙醛、乙酸，并在其自身酯化酶的催化作用下合成乙酸乙酯[6]。在我國(guó)，應(yīng)用生香酵母提高白酒質(zhì)量始于20世紀(jì)60年代初期，前沈陽(yáng)輕院與錦州酒廠就用生香酵母明顯地提高了麩曲白酒的酒質(zhì)，而真正商品化的生香酵母是于1995年由湖北宜昌安琪酵母基地開(kāi)始生產(chǎn)的，當(dāng)生香酵母被制成活性干酵母后，既充分發(fā)揮了增酯作用，又方便了運(yùn)輸、貯存及使用[7]。史雁飛[8]通過(guò)應(yīng)用酵母細(xì)胞固定化技術(shù)，增強(qiáng)了產(chǎn)酯酵母生長(zhǎng)繁殖能力，提高細(xì)胞活性和抗逆性，并達(dá)到反復(fù)利用的目的，極大地提升了產(chǎn)酯酵母的應(yīng)用效果。劉桂君等[9]在液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)白酒時(shí)用生香酵母與紅曲、釀酒酵母共同發(fā)酵，所獲白酒乙酸乙酯的含量有較大幅度提高，酒的口味和香氣均有改善。宋玉華等[10]在清香酒生產(chǎn)中添加固體產(chǎn)酯酵母入池發(fā)酵，乙酸乙酯含量明顯提高，且酒質(zhì)甘爽余味長(zhǎng)，清香風(fēng)格明顯。

產(chǎn)酯酵母菌代謝產(chǎn)酯受諸多因素影響，如發(fā)酵培養(yǎng)基、溫度、時(shí)間、pH值、供氧情況等。與兼性厭氧的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在無(wú)氧條件下繁殖代謝不同，大多數(shù)產(chǎn)酯酵母為需氧菌，必須在有氧條件下生長(zhǎng)代謝[11]，且白酒生產(chǎn)中酒醅酸度和發(fā)酵期是極為重要的發(fā)酵條件，直接影響白酒生產(chǎn)的質(zhì)量和產(chǎn)量，因此研究發(fā)酵酒醅酸度、酒醅中溶氧情況、發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酯酵母代謝的影響，可為產(chǎn)酯酵母在白酒釀造生產(chǎn)中應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)，這對(duì)于白酒生產(chǎn)的提質(zhì)保量是極為必要的。

本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的5株酵母菌的乙酸乙酯生產(chǎn)能力進(jìn)行研究，從中篩選出一株高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌，并對(duì)該菌株在白酒釀造過(guò)程中的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行研究，考察糧糟比例、酒醅疏松度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯效果的影響，其中，通過(guò)調(diào)整糧糟比例調(diào)節(jié)酒醅入池酸度，通過(guò)調(diào)整酒醅疏松程度調(diào)節(jié)入池酒醅中氧氣含量，確定最佳發(fā)酵條件。進(jìn)一步在釀造中試車(chē)間應(yīng)用產(chǎn)酯酵母J-4進(jìn)行發(fā)酵增酯實(shí)驗(yàn)，并以未添加產(chǎn)酯酵母發(fā)酵的酒班為對(duì)照，對(duì)兩班所產(chǎn)原酒指標(biāo)進(jìn)行分析對(duì)比，并對(duì)酒樣進(jìn)行感官品評(píng)，以驗(yàn)證和評(píng)估該株產(chǎn)酯酵母在大生產(chǎn)中的應(yīng)用性能及效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5：北京紅星股份有限公司從清香型酒曲中分離并保存；安琪釀酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 試劑

玉米粉：市售；白酒蒸餾酒尾、麩曲、高粱粉、酒糟、稻殼：北京紅星股份有限公司釀造車(chē)間；酚酞（分析純）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：北京化工廠有限責(zé)任公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、異丁醇、乳酸乙酯（純度均≥99.0%）：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源庫(kù)；乙酸正戊酯（純度≥99.0%）：西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[12]：8～10 °Bx玉米糖化液，pH 4.0～5.5，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。玉米糖化液[13]：在糊化鍋內(nèi)加入原料質(zhì)量6倍的水，打開(kāi)蒸汽加熱，同時(shí)均勻撒入原料玉米粉，要求玉米粉不得結(jié)塊，蒸煮2 h糊化，糊化結(jié)束后料液降溫冷卻至60 ℃，加入原料質(zhì)量20%的麩曲攪拌均勻，保持溫度55～60 ℃，糖化3～4 h，糖化完畢后離心過(guò)濾，加水稀釋至8～10°Bx糖度。

酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：酒糟與水按質(zhì)量比1∶4混合均勻后過(guò)濾，在浸出液中加入10%白酒蒸餾酒尾，酒尾酒精度為25%vol，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器及設(shè)備

GC-2010 plus氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：日本島津公司；CJ-2DFS凈化工作臺(tái)：天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JJ6000型電子天平：常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 釀酒高活性干酵母活化

將安琪釀酒高活性干酵母接種于玉米糖化液，混勻后于38 ℃活化30 min，備用[15]。

1.3.2 產(chǎn)酯酵母種子培養(yǎng)

自保藏斜面培養(yǎng)基挑取1環(huán)產(chǎn)酯酵母接種于裝有種子培養(yǎng)基的試管中，28 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后按照10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，裝液量100 mL/500 mL，28 ℃培養(yǎng)24 h[16-17]，作為種子液備用。

1.3.3 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌的篩選

將酵母種子液按4%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，每天取發(fā)酵液檢測(cè)乙酸乙酯含量。

1.3.4 白酒釀造工藝

操作要點(diǎn)：將高粱粉碎成粉狀，酒糟、高粱粉按照不同配比混合均勻，加入稻殼、水，稻殼添加量為高粱粉質(zhì)量的25%，適當(dāng)加水調(diào)節(jié)醅料水分至55%左右，拌勻后100 ℃蒸料40 min，蒸料完成后物料經(jīng)攤涼、降溫至30 ℃左右，將高產(chǎn)乙酸乙酯酵母種子液按高粱粉質(zhì)量的4%接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)按高粱粉質(zhì)量加入8%麩曲、0.03%活化后的安琪釀酒高活性干酵母，并再次翻拌均勻后入池發(fā)酵。發(fā)酵完成后，將酒醅從發(fā)酵池中取出，裝入甑鍋中蒸餾取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作為丟糟棄用，剩余80%酒糟作為回糟再次配糧后進(jìn)行發(fā)酵應(yīng)用。

1.3.5 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將醅料拌勻后裝入不銹鋼發(fā)酵桶（滿(mǎn)桶容積0.014 m3）內(nèi)，以不同力度壓實(shí)醅料至與桶沿齊平，測(cè)量發(fā)酵桶內(nèi)所裝醅料質(zhì)量，以帶硅膠密封圈及排汽管的發(fā)酵桶蓋封口，發(fā)酵桶置于室溫狀態(tài)下，待醅料發(fā)酵不同時(shí)間后蒸餾取酒，檢測(cè)原酒中乙酸乙酯含量及出酒率?？疾旒Z糟質(zhì)量比（1.0∶3.5、1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0、1.0∶5.5）、入池酒醅疏松度（不施壓力、輕微壓力、正常壓力、加重壓力）及發(fā)酵時(shí)間（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對(duì)菌株JT-4產(chǎn)乙酸乙酯的影響。

1.3.6 麩曲白酒釀造生產(chǎn)

采用1.3.4發(fā)酵工藝，將醅料拌勻后轉(zhuǎn)移至水泥發(fā)酵池（滿(mǎn)池容積45 m3）內(nèi)，以塑料薄膜覆蓋，進(jìn)行人工踩窖，室溫狀態(tài)下進(jìn)行發(fā)酵。測(cè)定原酒出酒率及理化指標(biāo)，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.7 檢測(cè)方法

揮發(fā)性成分的測(cè)定：采用氣相色譜法檢測(cè)原酒中揮發(fā)性成分的含量。色譜條件參照楊強(qiáng)等[18]的方法，并略作修改：LZP-930石英毛細(xì)管色譜柱（50 m×0.32 mm×1.00 μm）柱；氫火焰離子化檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度230 ℃；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，再以20 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；載氣為氮?dú)猓∟2）；吹掃流量為3 mL/min；分流比為1∶30。根據(jù)保留時(shí)間定性[19]，采用內(nèi)標(biāo)法定量，內(nèi)標(biāo)物為乙酸正戊酯（質(zhì)量濃度0.117 g/L）。

酸度的測(cè)定：根據(jù)T/CBJ 004—2018《固態(tài)發(fā)酵酒醅通用分析方法》進(jìn)行測(cè)定[20]。

發(fā)酵醅料質(zhì)量的測(cè)定：稱(chēng)量空發(fā)酵桶及封蓋質(zhì)量，向桶中裝入醅料并封蓋后再次稱(chēng)量總質(zhì)量，用總質(zhì)量減去空桶及蓋的質(zhì)量，即為所裝發(fā)酵醅料質(zhì)量。

發(fā)酵醅料密度的測(cè)定：發(fā)酵醅料密度=發(fā)酵桶所裝發(fā)酵醅料質(zhì)量/發(fā)酵桶滿(mǎn)桶容積。其中，發(fā)酵桶滿(mǎn)桶容積為0.014 m3。

原料出酒率的測(cè)定：原料出酒率=65%vol原酒產(chǎn)量/原料用量×100%[21]。

感官評(píng)價(jià)：根據(jù)GB/T 33405—2016《白酒感官品評(píng)術(shù)語(yǔ)》進(jìn)行品評(píng)描述[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌的篩選

以未接菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5在酒尾發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d、3 d、4 d和5 d后，乙酸乙酯含量見(jiàn)表1。

表1 不同酵母菌株培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量Table 1 Content of ethyl acetate in culture solution of different yeast strains

由表1可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4產(chǎn)乙酸乙酯能力明顯優(yōu)于其他4株酵母，當(dāng)培養(yǎng)4 d時(shí)，菌株J-4培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為1.38 g/L，酵母菌在生成乙酸乙酯的同時(shí)也在不斷代謝分解溶液中的乙酸乙酯，隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，菌體衰退，合成乙酸乙酯的能力降低，菌株J-4培養(yǎng)液中乙酸乙酯含量下降。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4具有較強(qiáng)的乙酸乙酯合成能力，故選擇該株酵母菌進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母J-4固態(tài)白酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 糧糟質(zhì)量比對(duì)酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響

應(yīng)用發(fā)酵桶為發(fā)酵容器，進(jìn)行初步固態(tài)白酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。以4.5 kg質(zhì)量酒醅入發(fā)酵桶，壓平至滿(mǎn)桶高度（正常壓力），加蓋密封后于室溫發(fā)酵6 d后，不同糧糟質(zhì)量比對(duì)酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵入池酒醅酸度、出酒率及原酒中乙酸乙酯產(chǎn)量的影響見(jiàn)表2。

表2 不同糧糟質(zhì)量比對(duì)菌株J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of different sorghum to vinasse ratio on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表2可知，酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，隨著糧糟質(zhì)量比減小，即入池酒醅酸度上升，所產(chǎn)原酒中乙酸乙酯含量逐漸升高，出酒率隨之降低，分析原因可能為產(chǎn)酯酵母利用發(fā)酵過(guò)程中生成的乙醇合成乙酸乙酯，導(dǎo)致出酒率下降。由此可見(jiàn)，在一定程度上提高酒醅入池酸度有利于酵母代謝生成乙酸乙酯。當(dāng)高粱粉與酒糟質(zhì)量比升高至1.0∶5.5時(shí)，雖然原酒中乙酸乙酯含量可達(dá)1.55 g/L，但出酒率僅為41.5%，損失較大，究其原因，除乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸乙酯造成出酒率下降外，較高的酒醅酸度在一定程度上對(duì)其他微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生抑制作用，使發(fā)酵速度減慢[23-24]，從而導(dǎo)致出酒率降低。

通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比可知，應(yīng)用高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌J-4進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，當(dāng)高粱粉與酒糟質(zhì)量比為1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0，即入池酒醅酸度為0.9～1.3 mmol/10 g時(shí)，所產(chǎn)原酒均可同時(shí)具有較高的乙酸乙酯含量和較高的出酒率。綜合考慮高乙酸乙酯含量原酒適用性較強(qiáng)及生產(chǎn)中對(duì)出酒率的要求，最終確定以高粱粉與酒糟質(zhì)量比例1.0∶4.5為最佳糧糟質(zhì)量比。

2.2.2 入池酒醅疏松度對(duì)酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響

釀酒酵母屬兼性厭氧菌，可在無(wú)氧條件下進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，而大多數(shù)生香酵母則需在有氧條件下生長(zhǎng)代謝[25-26]。王瑞明等[27]研究表明，氧氣對(duì)異常漢遜酵母（Hansenula anomala）酯類(lèi)代謝起著很重要的作用。因此，通過(guò)調(diào)整發(fā)酵酒醅疏松程度調(diào)節(jié)發(fā)酵體系中氧氣含量，考察其對(duì)酵母菌J-4發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，高粱粉與酒糟質(zhì)量比為1.0∶4.5，發(fā)酵時(shí)間為6 d，發(fā)酵結(jié)束后蒸餾取酒，計(jì)算出酒率并檢測(cè)原酒中乙酸乙酯含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同酒醅疏松度對(duì)菌株J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of different pressure on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表3可知，隨著醅料疏松程度降低，酒醅內(nèi)氧氣含量減少，原酒中乙酸乙酯含量降低，出酒率逐步升高，酵母菌J-4代謝合成乙酸乙酯需在有氧條件下進(jìn)行，降低發(fā)酵體系溶氧量對(duì)產(chǎn)酯酵母代謝產(chǎn)生影響，但對(duì)于無(wú)氧條件發(fā)酵產(chǎn)酒精的釀酒酵母來(lái)說(shuō)，酒醅低含氧量有助于其代謝合成酒精。應(yīng)用酵母菌J-4進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，當(dāng)采用正常壓醅及加壓壓醅時(shí)，可在保持較高出酒率的基礎(chǔ)上提高原酒中乙酸乙酯含量。由于正常生產(chǎn)中發(fā)酵池體積較大，投糧量較多（一般每池1～4 t投糧），很難實(shí)現(xiàn)前兩種醅料狀態(tài)，且低出酒率直接導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失，因此生產(chǎn)中醅料入池后采用正常踩窖即可。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母菌J-4固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響采用高粱粉與酒糟質(zhì)量比1.0∶4.5，醅料裝入發(fā)酵桶后以正常壓力壓實(shí)，于室溫下分別發(fā)酵不同時(shí)間，發(fā)酵結(jié)束后蒸餾取酒，考察不同發(fā)酵期對(duì)酵母菌J-4發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酵母J-4固態(tài)發(fā)酵出酒率及乙酸乙酯產(chǎn)量的影響Table 4 Effect of different fermentation time on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表4可知，當(dāng)酒醅發(fā)酵6～7 d時(shí)，主發(fā)酵期基本已經(jīng)到達(dá)終點(diǎn)，無(wú)論是釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精量還是產(chǎn)酯酵母代謝合成乙酸乙酯量，均已達(dá)到較高水平，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵期，出酒率、乙酸乙酯含量增長(zhǎng)幅度均有限，當(dāng)發(fā)酵期延長(zhǎng)至10 d時(shí)，原酒中乙酸乙酯含量明顯降低，酒醅中乙酸乙酯趨于分解，且延長(zhǎng)發(fā)酵周期會(huì)降低窖池使用效率，在一定程度上給原酒生產(chǎn)造成經(jīng)濟(jì)損失[28]，因此，確定7 d為原酒發(fā)酵周期。

2.3 高產(chǎn)乙酸乙酯酵母菌J-4的在麩曲白酒釀造生產(chǎn)中的應(yīng)用

采用1.3.4發(fā)酵工藝，以水泥池為發(fā)酵容器，確定糧糟質(zhì)量比為1.0∶4.5，發(fā)酵時(shí)間7 d，醅料入池后進(jìn)行正常踩窖，進(jìn)一步將酵母菌J-4應(yīng)用于釀造車(chē)間規(guī)模化麩曲白酒生產(chǎn)中，以不添加酵母菌J-4組為對(duì)照。發(fā)酵結(jié)束后分別計(jì)算出酒率并檢測(cè)所產(chǎn)原酒理化指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 原酒出酒率及理化指標(biāo)Table 5 Liquor yield and physicochemical indicators of base liquor

由表5可知，酵母菌J-4組出酒率（45.3%）略低于對(duì)照組出酒率（45.7%），比對(duì)照組出酒率降低0.87%；酵母菌J-4組乙酸乙酯含量（1.07 g/L）明顯高于對(duì)照組酒樣（0.71 g/L），比對(duì)照組酒樣增長(zhǎng)50.7%。酵母菌J-4組乳酸乙酯含量低于乙酸乙酯含量，符合清香型白酒風(fēng)格特點(diǎn)，乙醛、甲醇、正丙醇、異丁醇含量較低，有助于增加酒體風(fēng)味及協(xié)調(diào)性。

分別對(duì)兩組原酒酒樣進(jìn)行感官品評(píng)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 原酒感官品評(píng)結(jié)果Table 6 Results of sensory evaluation of base liquor

由表6可知，在清香型麩曲白酒釀造過(guò)程中，通過(guò)添加酵母菌J-4，可顯著提升原酒中乙酸乙酯含量，可明顯改善原酒口感，增加酒體綿柔度及豐滿(mǎn)度，提升原酒品質(zhì)。

3 結(jié)論

篩選出一株具有高產(chǎn)乙酸乙酯能力的酵母菌株J-4，乙酸乙酯產(chǎn)量為1.38 g/L，其最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵條件為高粱粉與酒糟質(zhì)量比1.0∶4.5，發(fā)酵時(shí)間7 d，酒醅入池發(fā)酵后，以正常壓力進(jìn)行壓醅。在此最優(yōu)條件下，所得原酒中乙酸乙酯含量為1.31 g/L，出酒率為46.3%，均達(dá)到較高水平。進(jìn)一步將酵母菌J-4應(yīng)用于麩曲白酒釀造生產(chǎn)，所產(chǎn)原酒中乙酸乙酯含量可達(dá)1.07 g/L，比對(duì)照組酒樣增長(zhǎng)50.7%；出酒率為45.3%，比對(duì)照組酒樣降低0.87%。經(jīng)品評(píng)，所得原酒口感、品質(zhì)亦得到明顯改善。因此，酵母J-4應(yīng)用于清香型麩曲白酒釀造中，具有良好的增酯效果。