汪 濤，周新群，孫君社，2，張志民，2，王民敬，2，胡雪芳，2，李旭瑞，2，裴海生，2

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)劃設(shè)計研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工工程研究所，北京 100121；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100121；3.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

黃精（Polygonatum sibiricum）又名雞頭黃精，我國首批進(jìn)入食藥同源的品種，中醫(yī)以根莖入藥是一種重要的中草藥，已經(jīng)使用了數(shù)千年。黃精富含活性多糖、皂苷、黃酮、蒽醌、生物堿和多種人體有用氨基酸[1]。經(jīng)研究，黃精在治療疲勞、降血糖、提高免疫和緩解性功能障礙等方面均有很好的療效[2-4]。黃精富含的黃酮、多酚和皂苷等活性成分均易溶于乙醇類有機(jī)溶劑，可提高酒精類產(chǎn)品的營養(yǎng)價值[5]。

目前，國內(nèi)專家學(xué)者很重視原料水解的研究，對水解方法、技術(shù)做了大量的工作。研究發(fā)現(xiàn)將固體原料水解后，便于其營養(yǎng)物質(zhì)充分利用、保留以及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)[6]。黃精作為一種常用的道地藥材，富含大量的功效物質(zhì)。據(jù)調(diào)查目前市面上黃精產(chǎn)品幾乎都用固體原料加工生產(chǎn)的，沒有做任何處理，這樣不僅使黃精營養(yǎng)物質(zhì)流失，而且不便于人體吸收[7]。通過高速剪切、超聲酶解兩步對黃精進(jìn)行水解，二者循序漸進(jìn)、相輔相成使其盡可能全水解，大部分功能性物質(zhì)溶于水解液中，為后期產(chǎn)品開發(fā)提供易加工、高價值的原料。

原料水解釀造是一種新型釀酒工藝，用黃精水解液釀制黃酒，一方面可以免去黃精蒸煮環(huán)節(jié)，另一方面可以保證黃精營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用。本研究通過單因素和正交試驗(yàn)，以黃精多糖溶出率為指標(biāo)，采用高速剪切和超聲酶解法兩步水解黃精，然后用黃精水解液和糯米釀制新型黃精黃酒，釀造出營養(yǎng)豐富、風(fēng)格獨(dú)特的新型黃酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精（Polygonatum sibiricum）：遼寧澳地森生物工程有限公司；圓江糯米：盤錦大米集團(tuán)；釀酒酵母（Saccharomyces cervisae）：中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院；酒曲：雅大科技實(shí)業(yè)有限公司；傳統(tǒng)黃酒、傳統(tǒng)黃精黃酒：均為實(shí)驗(yàn)室自制。

麥芽汁培養(yǎng)基：青島海博覽生物技術(shù)有限公司；亞鐵氰化鉀、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉：北京化工廠有限責(zé)任公司；苯酚、纖維素酶（10 000 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZQ-C空氣浴振蕩器：東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)技術(shù)有限公司；HS-250A恒溫恒濕培養(yǎng)箱：南京恒裕電子儀器廠；LDZX-50KBS立體式高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：西安喬普生物科技有限公司；VMA-cc高速剪切分散乳化機(jī)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；KQ-700TDV聲波清洗器：北京林子大科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃精水解工藝流程

1.3.2 黃精原料高速剪切水解工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)設(shè)計：分別選取剪切時間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），剪切速率（10 000 r/min、11 000 r/min、12 000 r/min、13 000 r/min、14 000 r/min、15 000 r/min），pH（2、3、4、5、6、7、8），料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，g∶mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別測定黃精多糖溶出率，考察剪切時間、剪切速率、pH值、料液比對黃精原料水解的影響。

正交試驗(yàn)設(shè)計：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定剪切速率為14 000 r/min，選料剪切時間（A）、剪切pH（B）、料液比（C）為自變量，黃精多糖溶出率為因變量進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 黃精原料高速剪切條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for high-speed shear conditions optimization of Polygonatum sibiricum

1.3.3 黃精濾渣超聲酶解工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)設(shè)計：分別選取纖維素酶添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%），超聲功率（100 W、150 W、200 W、250 W、300 W、350 W），料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL），超聲時間（30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別測定黃精多糖溶出率，考察纖維素酶添加量、超聲功率、料液比、超聲時間對黃精濾渣水解的影響。

正交試驗(yàn)設(shè)計：根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶添加量（A）、超聲功率（B）、料液比（C）、超聲時間（D）為自變量，黃精多糖溶出率為因變量進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素與水平見表2。

表2 黃精濾渣超聲酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for ultrasonic hydrolysis condition optimization of Polygonatum sibiricum filter residue

1.3.4 新型黃精黃酒釀制工藝流程及操作要點(diǎn)

（1）在傳統(tǒng)黃精黃酒工藝技術(shù)的基礎(chǔ)上，僅對黃精水解液發(fā)酵比例進(jìn)行研究；糯米蒸煮后冷卻至常溫，添加0.6%酒曲30 ℃糖化24 h后，接種2%釀酒酵母，28 ℃進(jìn)行主發(fā)酵6 d，結(jié)束后溫度降至15 ℃進(jìn)入后發(fā)酵。

（2）將黃精水解液蒸發(fā)濃縮，調(diào)節(jié)pH近中性，備用。分別選擇黃精水解液占釀造水比例為15%、30%、45%、60%、75%、90%、100%，探究其對發(fā)酵的影響并確定最佳比例。

1.3.5 測定方法

感官評價：參照GB/T 13662—2018《黃酒》中感官指標(biāo)要求，制定感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 黃精黃酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of Polygonatum sibiricum Huangjiu

續(xù)表

由經(jīng)過訓(xùn)練的5人組成的產(chǎn)品感官評定小組，按感官評分標(biāo)準(zhǔn)對酒體的外觀、香氣、口感、風(fēng)格分別進(jìn)行綜合評分，滿分100分，取平均分作為感官評分。

黃精多糖溶出率：采用苯酚硫酸法測定黃精多糖含量[8]，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.008 2x+0.028 3，R2=0.999 1。將水解液真空抽濾，收集濾液，蒸發(fā)濃縮，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%，醇沉2 h，7 000 r/min離心8 min得到粗多糖。按下列公式計算黃精多糖溶出率。

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖含量，μg/mL；V為黃精多糖水溶液體積，mL；d為稀釋倍數(shù)；M為樣品干質(zhì)量，g。

黃精水解率的計算公式如下：

式中：M為黃精原料質(zhì)量，g；Mt為兩步水解后黃精濾渣質(zhì)量，g。

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮、多糖：參照GB/T 13662—2018《黃酒》。

酒體中多糖含量計算公式：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的葡萄糖含量，mg/mL；v為多糖水溶液體積，mL；d為稀釋倍數(shù)；V為酒樣體積，mL。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010、SPSS 19.0、Origin 8.5對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精原料高速剪切水解單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 剪切時間對黃精原料水解的影響

由圖1可知，黃精多糖溶出率隨剪切時間的延長呈先增加后降低的趨勢。剪切時間為50 min時，黃精多糖溶出率達(dá)到最高，為19.97%。高速剪切使黃精顆粒在定、轉(zhuǎn)子狹窄的間隙中受到強(qiáng)烈的機(jī)械剪切、離心擠壓、撞擊撕裂和湍流等作用，在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)破壁，延長剪切時間破壁效果會更好，黃精多糖溶出率更高，但剪切時間過長會使溶劑溫度升高，多糖因高溫而分解[9]。因此，選擇剪切時間50 min為宜。

圖1 剪切時間對黃精原料水解的影響Fig.1 Effect of shear time on hydrolysis of Polygonatum sibiricum

2.1.2 剪切速率對黃精原料水解的影響

圖2 剪切速率對黃精原料水解的影響Fig.2 Effect of shear rate on hydrolysis of Polygonatum sibiricum

由圖2可知，黃精多糖溶出率隨剪切速率的增加呈增加并緩慢穩(wěn)定的趨勢，即在剪切速率達(dá)到14 000 r/min時，黃精多糖溶出率為20.13%，之后增加緩慢并趨于穩(wěn)定，是因?yàn)榧羟兴俾试黾拥绞刮锪祥g相互作用力達(dá)到某種平衡對多糖溶出影響不明顯[10]。因此選擇剪切速率14 000 r/min為宜。

2.1.3 剪切pH對黃精原料水解的影響

圖3 剪切pH對黃精原料水解的影響Fig.3 Effect of shear pH on hydrolysis of Polygonatum sibiricum

由圖3可知，黃精多糖溶出率隨剪切pH的升高呈先增加后降低的趨勢，剪切pH為3時達(dá)到最高，為25.74%。酸性溶劑有輔助分解植物細(xì)胞壁木質(zhì)素及纖維素的作用，使黃精多糖溶出率增加，但pH太低的環(huán)境會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使其降低；當(dāng)pH＞3之后，溶劑中OH-增多，使細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素的屈服強(qiáng)度增加、斷裂鍵能增強(qiáng)，水解程度降低[11-12]。因此選擇剪切pH3為宜。

2.1.4 料液比對黃精原料水解的影響

圖4 料液比對黃精原料水解的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on hydrolysis of Polygonatum sibiricum

由圖4可知，黃精多糖溶出率隨料液比變化呈先增加后減少的趨勢。料液比為1∶50時黃精多糖溶出率達(dá)到最高，為25.55%。增加溶劑體積能使黃精顆粒擴(kuò)散空間增加，與溶劑的有效接觸面積增大，浸潤破裂效果則更好，增加了黃精多糖在溶劑中的溶解量；但料液比過小時物料間相互的作用力太小使多糖溶出率降低，且過多的溶劑體積會對后續(xù)的處理造成困難，增加水解工藝成本[13]。因此選擇料液比1∶50（g∶mL）為宜。

2.2 黃精原料高速剪切水解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表4 黃精原料高速剪切水解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments results for high-speed shear conditions optimization of Polygonatum sibiricum raw material

由表4可知，影響黃精原料水解效果的強(qiáng)弱順序?yàn)榧羟衟H＞剪切時間＞料液比，最優(yōu)方案為A2B1C2，即剪切時間50 min、剪切pH為2、料液比1∶50（g∶mL）。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，對最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)進(jìn)行3組平行，測得黃精多糖溶出率均值25.47%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性，對其進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。由表5可知，剪切時間、剪切pH、料液比對試驗(yàn)結(jié)果影響均顯著（P＜0.05）。

表5 黃精原料高速剪切水解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results for high-speed shear conditions optimization of Polygonatum sibiricum raw material

2.3 黃精濾渣超聲酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 纖維素酶添加量對黃精濾渣水解的影響

圖5 纖維素酶添加量對黃精濾渣水解的影響Fig.5 Effect of cellulase content on hydrolysis of Polygonatum sibiricum filter residue

由圖5可知，黃精濾渣多糖溶出率隨纖維素酶添加量的增加呈增加并緩慢穩(wěn)定的趨勢。纖維素酶通過破壞細(xì)胞壁使黃精多糖溶出。隨著酶添加量的增加，酶促反應(yīng)速度加快，細(xì)胞壁破壞程度變嚴(yán)重，黃精多糖溶出增加[14]；當(dāng)纖維素酶添加量為3%時，黃精多糖溶出率為22.41%，繼續(xù)增加酶添加量，酶促反應(yīng)達(dá)飽和狀態(tài)，黃精多糖不再增加，趨于穩(wěn)定。其次，酶過量不僅影響酒體口感，而且增加工藝成本。因此，選擇纖維素酶添加量3%為宜。

2.3.2 超聲功率對黃精濾渣水解的影響

由圖6可知，黃精濾渣多糖溶出率隨超聲功率的增加呈先增加后降低的趨勢。超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，通過大分子的運(yùn)動速率，增大介質(zhì)的穿透力[15]。隨著超聲功率的增大，超聲波空化作用增強(qiáng)，對細(xì)胞的作用增強(qiáng)，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性增大，從而黃精多糖溶出率增加；當(dāng)超升功率為250 W時，黃精多糖溶出率達(dá)到最高，為24.75%；但隨著超聲功率的繼續(xù)增加，過大的超聲功率會破壞多糖結(jié)構(gòu)，使多糖降解[16]。因此，選擇超聲功率250 W為宜。

圖6 超聲功率對黃精濾渣水解的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the hydrolysis of Polygonatum sibiricum filter residue

2.3.3 料液比對黃精濾渣水解的影響

由圖7可知，黃精濾渣多糖溶出率隨料液比變化呈先增加后降低的趨勢。料液比較高時溶液黏稠度大，超聲波對細(xì)胞的空化作用較弱，加之細(xì)胞內(nèi)外溶質(zhì)的濃度差較小，不利于多糖的溶出；隨著溶劑的增加，溶液黏稠度降低，細(xì)胞內(nèi)外多糖的濃度差增大，有利于多糖向溶劑中擴(kuò)散[17]。當(dāng)料液比為1∶20時，黃精多糖溶出率最高，為24.82%；繼續(xù)增加料液比，超聲波所產(chǎn)生的能量被溶劑吸收，并且雜質(zhì)溶出較多，多糖溶出率反而下降[18]。因此，選擇料液比1∶20（g∶mL）為宜。

圖7 料液比對黃精濾渣水解的影響Fig.7 Effect of material-liquid ratio on hydrolysis of Polygonatum sibiricum filter residue

2.3.4 超聲時間對黃精濾渣水解的影響

由圖8可知，隨著超聲時間的延長，黃精濾渣多糖溶出率呈先增加后降低的趨勢。隨著超聲時間的推移，多糖溶出率不斷提高，60 min時達(dá)到最高，為25.43%；而60 min之后，多糖溶出率開始下降，這是因?yàn)殡S著超聲時間的延長，超聲波的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)使分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生改變，水溶性變差，多糖溶出率下降[19]。因此，選擇超聲時間60 min為宜。

圖8 超聲時間對黃精濾渣水解的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on hydrolysis of Polygonatum sibiricum filter residue

2.4 黃精濾渣超聲酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表6 黃精濾渣超聲酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Results and analysis of orthogonal experiments results for ultrasonic hydrolysis condition optimization of Polygonatum sibiricum filter residue

由表6可知，影響黃精濾渣水解效果的強(qiáng)弱順序?yàn)槔w維素酶添加量＞超聲時間＞超聲功率＞料液比；最優(yōu)方案為A1B1C2D2，即纖維素酶添加量2%，超聲功率200 W，料液比1∶20（g∶mL），超聲時間60 min。為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)的可靠性，對最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證，試驗(yàn)進(jìn)行3組平行，測得黃精濾渣多糖溶出率均值為27.63%。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果的準(zhǔn)確性，對其進(jìn)行方差分析。由表7可知，纖維素酶添加量、超聲功率、超聲時間對試驗(yàn)結(jié)果影響均顯著（P＜0.05），料液比對試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表7 黃精濾渣超聲酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiments results for hydrolysis conditions optimization of Polygonatum sibiricum filter residue

2.5 黃精多糖溶出率和水解率的結(jié)果與分析

圖9 黃精多糖溶出率及水解率Fig.9 Dissolution rate and hydrolysis rate of Polygonatum sibiricum

由圖9可知，黃精原料經(jīng)過高速剪切，其濾渣再經(jīng)超聲波酶解的處理后黃精多糖溶出率達(dá)52.5%。再者黃精水解率達(dá)到81.3%，很大程度上改變了黃精原料的物理狀態(tài)，這樣能使其充分的利用和高價值開發(fā)。通過高速剪切、超聲酶解兩步處理黃精，不僅能提高新型黃精黃酒的營養(yǎng)價值，而且解決了原料在不經(jīng)過蒸煮發(fā)酵時酸度高的情況，最大限度體現(xiàn)黃精應(yīng)有的價值。

2.6 新型黃精黃酒釀制研究及酒體質(zhì)量分析

表8 黃精水解液比例對新型黃精黃酒發(fā)酵的影響Table 8 Effect of Polygonatum sibiricum hydrolysate ratio on fermentation of new type Polygonatum sibiricum Huangjiu

在傳統(tǒng)黃精黃酒工藝條件的基礎(chǔ)上，以黃精水解液占釀造水比例進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)研究。由表8可知，在黃精水解液比例為75%，發(fā)酵7 d時，酒體感官評分為82.5分，酸甜適中，口感醇厚，具有濃郁的黃精獨(dú)有的香味。故黃精水解液占釀造水的75%時最為適宜。

通過15 d發(fā)酵，得到新型黃精黃酒為淡黃色、清亮透明、酸甜適中，具有黃精中藥原有的特殊香味，總糖11.15 g/L，總酸6.32 g/L，酒精度11.2%vol，pH值4.4，氨基酸肽氮含量0.39 g/L。感官評價、理化指標(biāo)均符合GB/T 13662—2008《黃酒》中對一級干黃酒的要求。

2.7 新型黃精黃酒多糖含量的測定結(jié)果與分析

多糖是黃精最主要的功能性成分，黃精產(chǎn)品獨(dú)特之處就是較傳統(tǒng)產(chǎn)品多糖含量更多。由圖10可知，傳統(tǒng)黃酒、傳統(tǒng)黃精黃酒、新型黃精黃酒中多糖含量分別為1.11 mg/mL、1.90 mg/mL、5.01 mg/mL。其中，新型黃精黃酒多糖含量是傳統(tǒng)黃酒的4.51倍，傳統(tǒng)黃酒中的多糖大部分是糯米發(fā)酵后殘余的糊精類物質(zhì)[20]，但黃精主要成分為多糖，而且其中還存在較多的非淀粉類中性多糖，在發(fā)酵過程中大部分被保留，從而使酒體中多糖含量增加；新型黃精黃酒多糖濃度遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)法釀造的黃精黃酒，是傳統(tǒng)黃精黃酒的2.64倍，其發(fā)酵過程中直接添加的是黃精水解液，水解液中原有的多糖含量遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)釀造過程中黃精浸出來的多糖。黃精含有多種功能性成分，其主要功能性成分為黃精多糖，酒體中多糖含量的增加不僅改善了黃酒的品質(zhì)，增加黃酒的種類，還提高了黃精的附加值。

圖10 新型黃精黃酒多糖含量測定結(jié)果Fig.10 Determination results of polysaccharide content in the new Polygonatum sibiricum Huangjiu

3 結(jié)論

運(yùn)用高速剪切、超聲酶解兩步對黃精進(jìn)行水解，通過正交試驗(yàn)得出黃精原料高速剪切工藝參數(shù)為剪切時間50 min、剪切pH為2、剪切速率14 000 r/min、料液比1∶50（g∶mL）；黃精濾渣水解工藝參數(shù)為纖維素酶添加量2%、超聲功率200 W、料液比1∶20（g∶mL）、超聲時間60 min，經(jīng)過這兩步對黃精的處理黃精多糖溶出率達(dá)52.5%，水解率為81.3%。

黃精水解液與糯米結(jié)合發(fā)酵新型黃精黃酒，感官評價、理化指標(biāo)符合GB/T 13662—2008《黃酒》中對一級干黃酒的要求；其中，經(jīng)檢測新型黃精黃酒多糖含量為5.01 mg/mL，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)黃精黃酒、傳統(tǒng)黃酒。說明新型黃酒即繼承了傳統(tǒng)黃酒的風(fēng)格特點(diǎn)，也突顯了自身的獨(dú)特性。