龔舒蓓，范文來，徐巖

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122)

白酒獨特的生產(chǎn)工藝是決定白酒獨特風(fēng)味的重要因素[1]。傳統(tǒng)白酒以手工生產(chǎn)為主，近年來生產(chǎn)方式逐步往機械化方向轉(zhuǎn)變，基本實現(xiàn)了原輔料加工、入窖和出糟等環(huán)節(jié)機械化或自動化。目前，芝麻香型白酒生產(chǎn)機械化程度較高[2]。眾所周知，機械化裝置難以模擬人工操作，因此造成機械化白酒與手工工藝酒存在風(fēng)味與質(zhì)量差異[3-4]。

然而對傳統(tǒng)法白酒和機械化白酒差異研究的報道甚少，主要是從酒體感官特征、出入池糟醅理化指標、出酒率和優(yōu)級率等方面對比兩種工藝生產(chǎn)的白酒[5-6]，鮮見對白酒中整體的揮發(fā)性及難揮發(fā)性物質(zhì)的比較研究。鑒于此，本研究對芝麻香型手工原酒與機械化原酒的揮發(fā)性和難揮發(fā)性成分分別進行檢測，并通過對兩工藝原酒微量成分的定量比較，找到其中差別較大的化合物，為在傳承傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上提高白酒機械化水平提供指導(dǎo)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

樣品：20個當天生產(chǎn)的芝麻香型原酒(優(yōu)級手工原酒，4個樣品，編號T1～T4；一級手工原酒，4個樣品，編號T5～T8；優(yōu)級機械原酒，6個樣品，編號M1～M6；一級機械原酒，6個樣品，編號M7～M12，酒精度64%～69%vol)，均由山東景芝酒廠提供。

試劑：NaCl和磷酸(分析純)，上海國藥集團；乙醇、NaH2PO4、苯基-β-D-葡萄糖苷、六甲基二硅胺(hexamethyldisitazane, HMDS)、己酸甲酯、乙酸正戊酯、三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、吡啶、鹽酸羥胺和表 1中鑒定出的94種化合物標準品(色譜純)，Sigma-Aldrich公司；超純水(Milli-Q)，均為煮沸并冷卻至室溫的超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC 6890N-MSD 5975)，Agilent 公司； 氣相色譜儀(GC 6890N)，Agilent 公司； 三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC Trace1310-MS TSQ8000)，Thermo Scientific；氮吹儀，Organomation公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Buchi 公司；超高效液相色譜儀，Waters UPLC H-Class。

1.3 實驗方法

1.3.1 難揮發(fā)化合物HMDS衍生化定量

取10 mL稀釋至酒精度60%vol酒樣于100 mL旋蒸瓶中，加入6 μL質(zhì)量濃度為256 mg/L的內(nèi)標苯基-β-D-葡萄糖苷，40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至500 μL，然后將其轉(zhuǎn)移到2 mL樣品瓶中，緩慢氮吹至干，再參照文獻[7]改進后方法處理，先往吹干樣品中加入70 μL吡啶(含質(zhì)量濃度為25 g/L的鹽酸羥胺)，搖勻，75 ℃反應(yīng)30 min，再依次加入70 μL HMDS和7 μL TFA，搖勻，45 ℃反應(yīng)30 min，最后12 000 r/min離心3 min，取1 μL進行GC-MS分析。

GC條件：載氣為高純氦氣，流速1 mL/min，5∶1分流進樣模式；色譜柱：TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口和檢測器溫度均為250 ℃。升溫程序：65 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至280 ℃保持8 min。MS條件：電子電離源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度300 ℃，SCAN模式掃描范圍：50～650 amu。

標準曲線：以60%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度待測物標準液，按照酒樣處理方法進行GC-MS分析。采用選擇離子法(SIM)計算各化合物的峰面積，以待測物與內(nèi)標峰面積之比為橫坐標，質(zhì)量濃度之比為縱坐標，分別繪制標準曲線。

1.3.2 超高效液相色譜(ultra high performance liquid chromatography，UPLC)定量乳酸方法

參考文獻[8]方法，用超純水將白酒樣品稀釋至10%vol左右，取1 mL過0.22 μm有機針頭式濾器。

UPLC色譜條件：T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)，流動相：100% NaH2PO4(質(zhì)量濃度3.12 g/L，pH 2.7)，檢測波長210 nm，柱溫40 ℃，流動相流速0.25 mL/min，進樣量1 μL。

標準曲線：以10%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度乳酸標準液，各梯度液處理方法與樣品一致。以乳酸峰面積為橫坐標，質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 液液微萃取(liquid-liquid microextraction, LLME)結(jié)合GC-MS定量易揮發(fā)化合物

參照文獻[9] 修改方法，準確吸取18 mL稀釋至10%vol酒樣于樣品瓶中，加6 g NaCl飽和，添加內(nèi)標己酸甲酯(終濃度1.02 mg/L)，搖勻后加入1 mL重蒸乙醚，振蕩萃取3 min，待靜置分層后，吸取上層有機相500 μL轉(zhuǎn)移至2 mL樣品瓶中，氮吹濃縮至250 μL，取1 μL進行GC-MS分析。

GC條件：載氣為高純氦氣，流速2 mL/min，不分流進樣模式；色譜柱：DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口和檢測器溫度均為250 ℃。升溫程序：50 ℃保持2 min，再以6 ℃ /min升至230 ℃保持15 min。MS條件：電子電離源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，SCAN模式掃描范圍：35～350 amu。

標準曲線：以10%vol酒精水溶液配制一定濃度梯度的待測物標準液，按照酒樣處理方法進行GC-MS分析。采用選擇離子法(SIM)計算各化合物峰面積，以待測物與內(nèi)標峰面積之比為橫坐標，質(zhì)量濃度之比為縱坐標，分別繪制標準曲線。

1.3.4 氣相色譜-火焰離子檢測器(gas chromatography flame ionization detector，GC-FID)法定量高含量揮發(fā)性化合物

參考國標GB/T 10345—2007法[10]，用超純水將酒樣稀釋至60%vol，加入內(nèi)標乙酸正戊酯(終質(zhì)量濃度176 mg/L)，取1 μL通過DB-Wax(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱進行分離、測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 手工原酒與機械原酒中的化合物

通過GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法在芝麻香型手工原酒和機械化原酒中一共定量94種化合物，包括酸類27種、醇類8種、酯類24種、芳香族15種、酚類3種、呋喃類6種、糖醇類5種、糖類4種、縮醛類1種以及內(nèi)酯類1種。手工原酒的化合物總量比機械化原酒高，分別為9.64～10.2 g/L和8.62～9.05 g/L。其中，一級手工原酒化合物總量比一級機械原酒高18.0%，而優(yōu)級手工原酒化合物總量比優(yōu)級機械原酒高6.5%。

2.2 手工原酒與機械原酒中的酯類化合物及其差異比較

酯類是芝麻香型原酒中含量最豐富的，其質(zhì)量濃度合計為6.29～7.68 g/L，分別占手工原酒和機械原酒物質(zhì)總量的75.5%～75.7%和73.0%～74.5%(表1)。檢測到的24種酯類物質(zhì)以乙酯類化合物居多，它們主要是由脂肪酸和乙醇酯化形成[11]。其中，乳酸乙酯和乙酸乙酯含量較高，分別達到2.96～4.14 g/L和2.84～3.48 g/L，與文獻報道的結(jié)果類似[9]，兩者含量占到酯類總含量的71.2%～72.0%；其次是丁酸乙酯和己酸乙酯含量，范圍分別為79.2～113 mg/L和29.9～86.6 mg/L。首次在芝麻香型白酒中定量到4-酮基戊酸乙酯，含量為395～586 μg/L，它曾在白蘭地香氣研究[12]中檢測到。另外，由于酒樣批次差異、生產(chǎn)不穩(wěn)定的原因，導(dǎo)致個別酯類化合物如庚酸乙酯的含量偏差過大，下述的原酒中某些醇類、酸類、芳香族化合物等也有類似情況。

相比手工原酒，機械化的優(yōu)級及一級原酒中酯類總量下降，分別下降7.6%(優(yōu)級)和18.1%(一級)。就芝麻香型優(yōu)級原酒而言，與手工原酒相比，4-酮基戊酸乙酯是機械原酒中上升最明顯的酯類，上升46.7%；己酸乙酯、丁酸異戊酯和乳酸丁酯在機械原酒中下降明顯，分別下降55.0%、43.6%和39.8%。就芝麻香型一級原酒而言，與手工原酒相比，庚酸乙酯是機械原酒中上升最明顯的酯類，上升123.0%；丁酸異戊酯和乳酸丁酯在機械原酒中下降明顯，分別下降38.3%和59.9%。另外，比較不同工藝原酒中乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯及乳酸乙酯這4種含量較高的酯發(fā)現(xiàn)，除了優(yōu)級機械原酒中乙酸乙酯的含量相比優(yōu)級手工原酒上升15.7%外，其他3種酯的含量在機械原酒中均下降。

表1 芝麻香型手工原酒與機械原酒中酯類物質(zhì)的平均含量Table 1 Average contents of the esters in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

注：a：V代表揮發(fā)性化合物并按出峰順序編號；b：N代表難揮發(fā)性化合物并按出峰順序編號；c：含量單位mg/L；d：采用GC-FID定量；e：帶TMS基團衍生物保留時間，采用衍生化方法定量；f：平均濃度±標準偏差；g：該類物質(zhì)占酒樣總含量的百分比；h：計算公式為(機械原酒物質(zhì)A的含量-手工原酒物質(zhì)A的含量)/手工原酒物質(zhì)A的含量×100%。下同。

2.3 手工原酒與機械原酒中的醇類化合物及其差異比較

醇類是芝麻香型原酒中含量第二高的，在手工原酒和機械原酒中的含量分別為1.34～1.42 g/L和1.20～1.26 g/L，占化合物總量的13.2%～14.7%(表2)。手工原酒和機械原酒中均檢測到揮發(fā)性醇類7種和難揮發(fā)醇類1種，它們一般來源于糖和氨基酸的降解[13]。其中，異戊醇含量最高，達到731～885 mg/L，異丁醇次之，達到226～259 mg/L。A/B值是指異戊醇與異丁醇的比值，兩工藝原酒的A/B值均為3.4，與文獻報道一致[9]。僅在原酒中檢測到丙三醇(即甘油)，這是一種難揮發(fā)醇類物質(zhì)，它可能是酵母菌酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物[14]，含量為328～372 μg/L。

相比手工原酒，機械化的優(yōu)級及一級原酒中醇類總量下降，分別下降10.5%(優(yōu)級)和10.7%(一級)。另外，從單個化合物來看，機械化的優(yōu)級酒及一級酒中正丙醇都上升，此外機械一級原酒的正戊醇也有所上升，其余醇類在機械化的優(yōu)級及一級原酒中下降，其中下降最多的是正丁醇，分別下降36.4%(優(yōu)級)及52.8%(一級)。醇類是白酒中重要的骨架成分，機械化白酒中醇類含量普遍降低，這可能是導(dǎo)致手工酒與機械化酒存在風(fēng)味差異的一大原因。

表2 芝麻香型手工原酒與機械原酒中醇類物質(zhì)的平均含量Table 2 Average contents of the alcohols in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

2.4 手工原酒與機械原酒中的酸類化合物及其差異比較

兩工藝原酒中酸類物質(zhì)的含量居第3且種類最多，包括了8種羥基酸、1種酮酸、1種二元酸、17種直鏈脂肪酸共27種，含量合計達到868～997 mg/L，占化合物總量的9.0%(手工原酒)～11.0%(機械原酒)，見表 3。其中，乙酸是含量最高的直鏈脂肪酸(705～849 mg/L)，乳酸是含量最豐富的羥基酸(73.6～96.6 mg/L)，兩者含量占到酸類總含量的92.3%～94.0%。直鏈脂肪酸中除棕櫚油酸、十二烷酸、十四烷酸和十八烷酸外含量均在1 mg/L以上，其中大部分短鏈脂肪酸由發(fā)酵過程中的細菌產(chǎn)生[13]；丁二酸(又叫琥珀酸)和丙酮酸是三羧酸循環(huán)中重要的有機酸，它們在酒中的含量低，其平均含量分別為40.7 μg/L和157 μg/L；原酒中的羥基酸除乳酸外，含量較低，一般在3～300 μg/L之間。

表3 芝麻香型手工原酒與機械原酒中酸類物質(zhì)的平均含量Table 3 Average contents of the acids in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

續(xù)表3

編號化合物RI手工原酒含量f/ (μg·L-1)機械原酒含量f/(μg·L-1)機械原酒相比手工原酒增減/%h優(yōu)級一級優(yōu)級一級優(yōu)級一級N32油酸2 224e6 130±56.36 200±87.75 970±1765 810±172-2.7-6.3酸類 小計c868(9.0%)g934(9.2%)997(11.0%)944(11.0%)14.91.1

注：i：采用UPLC定量。

相比手工原酒，機械化的優(yōu)級及一級原酒中酸類總量上升，分別上升14.9%(優(yōu)級)和1.1%(一級)。就芝麻香型優(yōu)級原酒而言，與手工原酒相比，機械原酒含量明顯上升的酸是2-羥基丁酸，上升128.4%， 而含量明顯下降的酸有異丁酸、3-羥基丙酸和3-羥基丁酸，分別下降36.7%、33.7%和36.3%。就芝麻香型一級原酒而言，與手工原酒相比，機械原酒中含量明顯上升的酸有2-羥基丁酸和己酸，分別上升153.9%和122.4%， 而含量明顯下降的酸有3-羥基丙酸和3-羥基丁酸，分別下降43.1%和55.4%。

2.5 手工原酒與機械原酒中的呋喃類和芳香族化合物及其差異比較

手工原酒和機械原酒里檢測到的6種呋喃類化合物總量都在70 mg/L以上(表4)。其中，糠醛是最主要的呋喃類化合物(≥28.1 mg/L)，主要產(chǎn)生于蒸餾過程[11]。

表4 芝麻香型手工原酒與機械原酒中呋喃類和芳香族化合物的平均含量Table 4 Average contents of the furans, and aromatic compounds in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

相比手工原酒，機械化的優(yōu)級及一級原酒中呋喃類總量下降，分別下降21.2%(優(yōu)級)和25.2%(一級)。與手工原酒相比，機械化的優(yōu)級和一級原酒中糠醛含量均下降，下降43%左右；優(yōu)級和一級機械原酒中2-糠醇、丁酸-2-糠酯、2-糠酸乙酯、乙酸-2-糠酯和2-糠酸的含量均上升，其中含量上升最多的是2-糠醇，分別上升95.3%(優(yōu)級)及64.4%(一級)。

9種易揮發(fā)和6種難揮發(fā)芳香族化合物在兩工藝原酒中被檢測到，含量合計為31.2～33.8 mg/L(表 4)。其中，以2-苯乙醇含量最高，達到19.4～21.9 mg/L。芝麻香型白酒中首次定量到4-羥基苯甲酸和4-羥基苯乙醇，它們可能是在制麥曲過程中由微生物生成[13]。

手工原酒與機械化原酒中芳香族類總量相差不大，但個別化合物含量存在較大差別。就芝麻香型優(yōu)級原酒而言，與手工原酒相比，機械原酒中3-苯丙酸含量上升最多，達31.5%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降明顯，下降42.3%。就芝麻香型一級原酒而言，與手工原酒相比，機械原酒中含量上升明顯的芳香族物質(zhì)有3-苯丙酸和4-羥基苯乙醇，它們分別上升73.0%和90.2%，而丁酸-2-苯乙酯含量下降最多，達38.0%。

2.6 手工原酒與機械原酒中的其他類化合物及其差異比較

兩工藝原酒中的其他類化合物總量為1.28～1.65 mg/L，在機械原酒中的含量按酚類、縮醛類、糖醇類、內(nèi)酯類和糖類物質(zhì)依次降低(表5)。其中，3種酚類物質(zhì)可能來自于發(fā)酵過程中木質(zhì)素的降解[15]；1,1,3-三乙氧基丙烷是唯一定量的縮醛類物質(zhì)，它是在低pH值下由丙烯醛和乙醇縮合產(chǎn)生[16]；還在酒中定量到的γ-壬內(nèi)酯、4種糖以及5種糖醇類，但含量較低，合計只有幾百μg/L。

表5 芝麻香型手工原酒與機械原酒中酚類、縮醛類、內(nèi)酯類、糖醇及糖類化合物的平均含量Table 5 Average contents of the phenols, acetal, lactone, sugar alcohols, and sugars in the two roasted sesame-like aroma type raw liquors

從各類物質(zhì)總量來看，兩工藝原酒中酚類總量差別最大，與手工原酒相比，機械化的優(yōu)級及一級原酒中酚類總量分別上升174.2%(優(yōu)級)和373.1%(一級)。從單個化合物來看，相比優(yōu)級手工原酒，優(yōu)級機械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量上升明顯，分別上升339.0%和163.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降最多，下降了57.3%。同樣地，一級機械原酒中4-乙基苯酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚含量相比一級手工原酒上升明顯，分別上升537.5%和408.1%，而1,1,3-三乙氧基丙烷含量下降67.1%。

雖然手工原酒與機械原酒中檢測到的化合物種類一致，但兩個工藝原酒中部分化合物含量存在明顯差別，這可能是由于白酒手工工藝與機械化釀造過程給釀酒微生物提供的環(huán)境存在差別，進而影響它們的生長代謝造成，但差異主要是在哪個工藝階段產(chǎn)生的，還有待進一步研究。

3 結(jié)論

本研究采用GC-FID、LLME-GC-MS、UPLC和HMDS衍生化方法，在芝麻香型手工原酒與機械原酒中均檢測到94種化合物。無論酒樣等級，手工原酒的化合物總量高于機械原酒；傳統(tǒng)手工釀造原酒中酯類、醇類、呋喃類、縮醛類、糖和糖醇物質(zhì)含量相對較高，而機械化釀造原酒中酸類、酚類和內(nèi)酯類物質(zhì)含量相對較高。對比兩個工藝酒的微量成分，發(fā)現(xiàn)白酒經(jīng)過機械化釀造后，4-乙基苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2-羥基丁酸和2-糠醇的含量明顯上升，1,1,3-三乙氧基丙烷、乳酸丁酯、3-羥基丁酸、正丁醇、糠醛、丁酸異戊酯、丁酸-2-苯乙酯和3-羥基丙酸的含量明顯下降。接下來研究將從白酒手工與機械化釀造工藝過程(如原料、制曲、發(fā)酵、蒸餾等)跟蹤分析這些差異物質(zhì)的含量，確定產(chǎn)生差異的原因或某個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。