姜汶辰

摘 要：RNA干擾（RNAi）技術(shù)是體外敲除目標(biāo)基因最常用方法之一。該技術(shù)利用小干擾RNA，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的沉默。RNA干擾可能與植物的共抑制、抗病毒機(jī)制、基因調(diào)控和染色體修飾等調(diào)控過程有關(guān)。利用遺傳和生化分析方法，我們可以對(duì)RNA干擾技術(shù)的效果進(jìn)行更準(zhǔn)確的評(píng)估。RNA干擾技術(shù)的特異性極高，是基因組學(xué)的重要研究工具，并可以用于基因治療。本文簡(jiǎn)要介紹了RNA干擾技術(shù)的原理及其應(yīng)用，以期為相關(guān)人員提供參考。

關(guān)鍵詞：RNA干擾技術(shù);基因;mRNA;應(yīng)用

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2020）10-0203-02

0引言

RNA沉默是一種新型的基因調(diào)節(jié)機(jī)制，可通過抑制轉(zhuǎn)錄或激活序列特異性RNA降解過程來(lái)限制轉(zhuǎn)錄水平。在幾乎所有真核生物中，都存在與RNAi相關(guān)的事件，原生動(dòng)物、昆蟲、寄生蟲以及小鼠和人類細(xì)胞系中，都存在RNA干擾現(xiàn)象。此外，RNAi可能與異染色質(zhì)的形成有關(guān)。深入研究小RNA在細(xì)胞的代謝中發(fā)揮的作用，有助于我們更好地理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

隨著基因組學(xué)的發(fā)展，許多生物學(xué)家對(duì)RNAi在基因表達(dá)中的作用進(jìn)行了深入的研究。在對(duì)果蠅進(jìn)行分析的過程中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，RNAi可能與各種真核細(xì)胞對(duì)自身基因突變的反應(yīng)相關(guān)。RNAi機(jī)制可以抑制轉(zhuǎn)座子的動(dòng)員，避免重復(fù)性DNA的積累，從而維持基因組的完整性。RNAi機(jī)制還可以保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染的影響，并調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的表達(dá)。作為一種比較成熟的技術(shù)，RNA干擾技術(shù)成為了分子生物學(xué)家最常用的基因研究工具之一，其在基礎(chǔ)生物學(xué)研究、醫(yī)療、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有著十分廣泛的應(yīng)用。如果我們找到合適的遞送方式，確保小RNA在轉(zhuǎn)入人體后不被核酸酶降解，那么這些小RNA將高效地抑制靶基因表達(dá)。這將為傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療提供新策略[1]。

1 RNA干擾技術(shù)的簡(jiǎn)介

在動(dòng)物中，雙鏈RNA會(huì)引起相應(yīng)基因的沉默，這種現(xiàn)象被稱為RNA干擾。它是一種非常原始和保守的機(jī)制，可能與細(xì)胞和外來(lái)DNA的相互作用有關(guān)。在RNAi的過程中，核酸酶首先將較長(zhǎng)的RNA切割成較小片段的雙鏈RNA（dsRNA），這些小RNA將充當(dāng)誘導(dǎo)物或激活劑，破壞細(xì)胞或病毒的靶mRNA分子。在某些情況下，靶mRNA的DNA會(huì)發(fā)生甲基化，使基因的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。

然而，RNA干擾技術(shù)仍然存在一定的局限性。在利用siRNA治療疾病的過程中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，siRNA有時(shí)會(huì)導(dǎo)致非目的基因沉默，影響細(xì)胞的正常代謝過程。此外，一些siRNA可能會(huì)被體液中的核酸酶降解，影響治療效果。運(yùn)用分子生物學(xué)知識(shí)，科學(xué)家可以不斷改進(jìn)siRNA的合成技術(shù)，這將提高siRNA的穩(wěn)定性，提高其治療效力，并降低脫靶效應(yīng)。不斷改進(jìn)RNAi試劑，不斷改進(jìn)RNA干擾技術(shù)，可以提升基礎(chǔ)生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的可靠性，并為治療癌癥及遺傳性疾病提供新思路[2]。

2 RNA干擾的作用機(jī)制

RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟：首先，長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶切割降解成21個(gè)～23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈RNA，也就是小干擾性RNA（siRNA）。然后，siRNA可以與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），該復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，識(shí)別靶mRNA并介導(dǎo)其降解，從而導(dǎo)致特定基因沉默[3]。

3 RNA干擾技術(shù)的研究進(jìn)展

選擇合適的目標(biāo)序列是有效提高siRNA干擾效率的關(guān)鍵。目標(biāo)序列中特定核苷酸的含量及目標(biāo)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，都可能影響干擾效率。研究表明，通過計(jì)算機(jī)輔助RNA折疊程序（MFOLD），我們可以預(yù)測(cè)siRNA與目標(biāo)序列的配對(duì)情況。然而，這些預(yù)測(cè)并不總是正確的。在一些情況下，在MFOLD中評(píng)分很高的siRNA，不能很好地降低目標(biāo)基因的表達(dá)水平。利用相關(guān)實(shí)驗(yàn)判斷所選目標(biāo)序列是否合適，可能是更高效的。通過研究寡核苷酸與mRNA的體外結(jié)合情況，是一個(gè)較常用的確定目標(biāo)序列的方法。當(dāng)寡核苷酸與mRNA結(jié)合為復(fù)合物后，加入可切割RNA-DNA雜合體的RNase H，共同孵育一段時(shí)間，RNase H就可以將復(fù)合物裂解。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，就可以分析裂解產(chǎn)物，評(píng)估目標(biāo)序列。不過，這種方法有一定的局限性，與細(xì)胞內(nèi)的mRNA相比，人工合成的mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)更簡(jiǎn)單。研究人員發(fā)現(xiàn)了一種更可靠的方法。他們從細(xì)胞中提取天然狀態(tài)的RNA蛋白復(fù)合物，將提取物與寡核苷酸一起孵育，待它們結(jié)合成復(fù)合物后，用內(nèi)源性的RNAse H切割復(fù)合物，并驗(yàn)證產(chǎn)物。這種方法可以最大程度地模擬寡核苷酸與mRNA的結(jié)合情況，得到更可靠的結(jié)果。

4 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

RNA干擾技術(shù)是一種以序列特異性方式抑制基因表達(dá)的強(qiáng)大工具。利用RNA干擾技術(shù)，我們可以高效地研究基因的功能。siRNA誘導(dǎo)的基因沉默在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及農(nóng)業(yè)中有著十分廣泛的應(yīng)用。下面我們簡(jiǎn)要介紹RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用。

4.1 RNA干擾技術(shù)在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，我們可以應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，增強(qiáng)作物的抗寒抗旱能力或者降低害蟲的繁殖能力，從而增加作物的產(chǎn)量。靶向與生殖相關(guān)基因的siRNA，可能會(huì)導(dǎo)致雄性害蟲不育，這可能是控制害蟲的新方法。轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的RNA沉默還可以用于抑制植物特定基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)病毒或細(xì)菌的抗性。不過，科學(xué)家還不清楚，RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用是否會(huì)改變植物其他方面的性質(zhì)。也就是說(shuō)，含dsRNA的植物，是否會(huì)對(duì)人類和環(huán)境產(chǎn)生潛在的影響，目前還是未知數(shù)[4]。我們需要深入研究RNA干擾技術(shù)對(duì)環(huán)境造成的可能影響，避免轉(zhuǎn)基因植物破壞生態(tài)平衡。此外，我們還需要深入研究攝入含dsRNA的食物對(duì)消費(fèi)者的影響，從而更全面、更準(zhǔn)確地評(píng)估這類轉(zhuǎn)基因食物的安全性。

4.2 RNA干擾技術(shù)在基礎(chǔ)生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

我們可以利用RNA干擾技術(shù)，高效地研究基因的功能。當(dāng)我們確定目的基因的序列后，可以設(shè)計(jì)相應(yīng)的dsRNA，并將其導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物模型，從而改變基因的表達(dá)水平。如果在基因表達(dá)下降后，細(xì)胞內(nèi)其他基因的表達(dá)水平也隨之發(fā)生變化，就說(shuō)明這些基因可能存在相互作用。相比于其他基因編輯技術(shù)，RNA干擾技術(shù)的操作十分簡(jiǎn)便，且編輯效率高是研究基因功能的首選技術(shù)。

許多研究表明，利用RNA干擾技術(shù)，我們可以高效地分析基因與表型之間的關(guān)系，確定基因的功能。然而，對(duì)于序列未知的基因，我們無(wú)法設(shè)計(jì)合適的dsRNA，也無(wú)法利用RNA干擾技術(shù)研究其功能[5]。測(cè)序技術(shù)的發(fā)展可能有助于解決這一問題，在得到研究對(duì)象的基因組序列后，我們可以高效地利用RNA干擾技術(shù)研究對(duì)應(yīng)基因的功能，從而理解不同基因在疾病發(fā)生中的作用。

4.3 RNA干擾技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

隨著人類基因組計(jì)劃的完成，我們可以高效地選擇目的基因進(jìn)行基因治療。在確定目的基因的序列之后，我們可以借助一些軟件，高效地設(shè)計(jì)治療性siRNA，實(shí)現(xiàn)基因治療。

siRNA療法與傳統(tǒng)的基于小分子和抗體的療法有許多不同點(diǎn)。其主要優(yōu)勢(shì)在于利用siRNA，我們幾乎可以使任何一個(gè)基因沉默。而抗體類藥物只對(duì)一部分基因突變有效果。從治療機(jī)理角度來(lái)看，siRNA可以直接拮抗靶標(biāo)，而傳統(tǒng)藥物主要通過阻斷或激活其靶基因的功能來(lái)發(fā)揮作用。相對(duì)而言，siRNA是更高效的。此外，與傳統(tǒng)藥物相比，我們可以更快地發(fā)現(xiàn)和鑒定特異性的siRNA，縮短研發(fā)周期，節(jié)約研究資金，而且siRNA選擇性和效力要比傳統(tǒng)藥物高得多。

siRNA的性質(zhì)十分特殊，這可能會(huì)影響其在體內(nèi)的有效性。在靜脈內(nèi)給藥時(shí)，一些siRNA會(huì)因?yàn)榉肿恿枯^小被腎臟濾除;在血液循環(huán)中，一些siRNA會(huì)被內(nèi)源性酶降解。在細(xì)胞表面，一些siRNA因?yàn)榉肿恿窟^大和表面帶負(fù)電，無(wú)法穿過細(xì)胞膜。一系列研究表明，在靜脈給藥后，大多數(shù)裸siRNA分子在體內(nèi)的半衰期是30min。用化學(xué)方法修飾siRNA，有助于延長(zhǎng)siRNA在血液循環(huán)系統(tǒng)中的壽命。化學(xué)修飾和物理包裹，可能會(huì)改變siRNA在體內(nèi)的理化性質(zhì)，從而提高其治療效力。例如，放射性標(biāo)記的Chol-siRNA的消除半衰期為95min，而未偶聯(lián)的siRNA的半衰期僅為6min[6]。

此外，我們應(yīng)當(dāng)對(duì)siRNA的遞送策略進(jìn)行更深入的研究，從而保證siRNA在進(jìn)入人體后，不被核酸酶降解，正常發(fā)揮作用。自從第一種基于siRNA的藥物于2004年進(jìn)入臨床試驗(yàn)以來(lái)，各個(gè)國(guó)家的科學(xué)家對(duì)RNAi治療劑的性能進(jìn)行了深入的研究，他們比較應(yīng)用裸siRNA、化學(xué)修飾的siRNA及賦形劑介導(dǎo)的siRNA治療局部或全身性疾病的效果，通過分析這些信息，我們可以總結(jié)出有效和安全的遞送策略，助力基因治療的發(fā)展。

siRNA的特異性是另一個(gè)十分值得關(guān)注的問題。siRNA與其靶標(biāo)之間的單個(gè)錯(cuò)配就足以顯著降低siRNA的治療效果。然而，我們?nèi)圆磺宄e(cuò)配的數(shù)量和位置與siRNA的干擾效率之間的聯(lián)系。siRNA可能會(huì)靶向具有相似序列的多個(gè)基因產(chǎn)物，從而影響其他基因的表達(dá)。

研究表明，針對(duì)同一mRNA的不同序列的siRNA的干擾效率存在差異，這一現(xiàn)象可能與siRNA進(jìn)入靶mRNA互補(bǔ)區(qū)域的能力有關(guān)。在設(shè)計(jì)siRNA的過程中，我們應(yīng)當(dāng)將提高siRNA的干擾效率作為主要設(shè)計(jì)目標(biāo)，從而提升siRNA的治療效率。此外，如何鑒定所設(shè)計(jì)的siRNA的有效性是一個(gè)十分重要的問題。將siRNA測(cè)試與復(fù)雜的基因表達(dá)分析技術(shù)相結(jié)合，可能會(huì)幫助研究人員準(zhǔn)確評(píng)估所設(shè)計(jì)的siRNA的有效性及特異性，提升基因治療的效率[7]。

5結(jié)語(yǔ)

由于RNA干擾技術(shù)的特異性較強(qiáng)，可以強(qiáng)烈抑制靶基因的表達(dá)，RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用十分廣泛，在細(xì)胞培養(yǎng)、活體器官和疾病模型研究中，RNAi都扮演著重要的角色。然而，我們?nèi)匀徊淮_定。基于RNAi的策略是否可以用于治療與基因突變或基因異常表達(dá)相關(guān)的疾病。研究人員應(yīng)當(dāng)保持審慎的樂觀態(tài)度，對(duì)siRNA的性質(zhì)進(jìn)行更深入的研究，開展更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，從而助力基因治療的發(fā)展。

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