楊坤，劉桂瓊，吳凱儀

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556012)

鎮(zhèn)遠(yuǎn)陳年道菜是貴州省黔東南苗族侗族自治州地方特色名腌菜，距今已有500多年的歷史，被評(píng)為貴州省優(yōu)秀產(chǎn)品和省級(jí)傳統(tǒng)食品。道菜呈棕褐色，儲(chǔ)藏年久，質(zhì)佳美味，芳香濃郁，常用于炒肉、蒸肉和煮湯，其味十分鮮美。道菜中含有豐富的氨基酸、粗蛋白、脂肪及鈣、磷、鐵等營(yíng)養(yǎng)成分，有報(bào)道稱(chēng)用道菜加姜和紅糖熬成湯，可以治療感冒和腹瀉等病癥[1,2]。

為了延長(zhǎng)陳年道菜的保質(zhì)期，常常加入苯甲酸鈉、山梨酸鉀等食品添加劑延長(zhǎng)其保質(zhì)期，但超限量值對(duì)人體有一定的毒害作用[3]。對(duì)于食品添加劑的使用，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定腌漬的蔬菜中苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸的使用限量值為1.0 g/kg，糖精鈉和安賽蜜的使用限量值各為0.15 g/kg和0.3 g/kg。目前，對(duì)醬腌菜中防腐劑和甜味劑的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法和離子色譜法等[4-11]。而本文通過(guò)使用亞鐵氰化鉀-乙酸鋅沉淀劑除去蛋白質(zhì)，用1%的氨水溶液提取樣品，優(yōu)化了樣品前處理方法，建立了UPLC法同時(shí)測(cè)定陳年道菜中3種防腐劑和2種甜味劑的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

安賽蜜質(zhì)量濃度為1.00 g/L，苯甲酸質(zhì)量濃度為1.00 g/L，山梨酸質(zhì)量濃度為1.00 g/L，糖精鈉質(zhì)量濃度為1.00 g/L，脫氫乙酸質(zhì)量濃度為1.00 g/L：均購(gòu)于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇：霍尼韋爾(中國(guó))有限公司，色譜級(jí)；乙酸銨：科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜級(jí)；冰乙酸：天大化學(xué)試劑廠，分析純；氨水：天大化學(xué)試劑廠，分析純；亞鐵氰化鉀：天大化學(xué)試劑廠，分析純；乙酸鋅：科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純；無(wú)水乙醇：科密歐化學(xué)試劑有限公司，優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)室用水為密理博超純水系統(tǒng)制備的三級(jí)水。

1.1.2 乙酸銨溶液

稱(chēng)取1.54 g乙酸銨，加950 mL水溶解，用冰乙酸溶液調(diào)pH值為5.28，用水定容至1000 mL。

1.1.3 亞鐵氰化鉀溶液

稱(chēng)取106 g亞鐵氰化鉀，加入適量水溶解，用水定容至1000 mL。

1.1.4 乙酸鋅溶液

稱(chēng)取220 g乙酸鋅溶于少量水中，加入30 mL冰乙酸，用水定容至1000 mL。

1.1.5 儀器

Agilent 1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色譜儀(配有二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器DAD、柱溫箱)、梅特勒S210-K型pH計(jì)、梅特勒PL2002型電子天平、西格瑪3-18K高速冷凍離心機(jī)、KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器、密理博Milli-Q純水機(jī)、長(zhǎng)風(fēng)HW.SY11-KP4型電熱恒溫水浴鍋。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液工作的配制

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別吸取質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液4.00 mL于200 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取20.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液2.50，5.0，10.0，25.0，50.0 mL至100 mL容量瓶中，用水定容，配制成0.50，1.00，2.00，5.00，10.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用工作溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Ecilpse Plus C18(50 mm×2.1 mm,1.8 μm)；流速：0.30 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；參比波長(zhǎng)360 nm；峰寬：40 Hz；進(jìn)樣量為2 μL；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02 mol/L乙酸銨-乙酸溶液(pH值為5.28)。流動(dòng)相洗脫程序：0～0.5 min，10% B；0.5～1.8 min，10%～40% B；1.8～3.0 min，40% B；3.0～3.1 min，40%～10% B；3.1～5.0 min，10% B。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取約0.50 g試樣于50 mL具塞離心管中，加氨水溶液(1+99) 25 mL，于60 ℃水浴加熱約5 min，然后加乙醇1 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后，加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8000 r/min離心10 min，水相轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，殘?jiān)鼧悠吩偬崛?次后定容。取適量上清液過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

對(duì)5種食品添加劑在波長(zhǎng)190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。由二極管陣列檢測(cè)器采集的光譜圖可知，5種食品添加劑的最大吸收波長(zhǎng)在220～250 nm之間，為兼顧各化合物的靈敏度以及檢測(cè)的抗干擾性，本試驗(yàn)選擇230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)選擇360 nm作為參比波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相

5種食品添加劑的國(guó)家檢測(cè)方法，選擇甲醇和乙酸銨溶液作為淋洗液的有苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸，選擇甲醇和乙腈作為有機(jī)相、硫酸銨作為水相的有安賽蜜[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)測(cè)定安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉和脫氫乙酸中3種以上化合物時(shí)，采用甲醇作為有機(jī)相、20 mmol/L乙酸銨作為水相的組合能取得較好的檢測(cè)效果。因此，本試驗(yàn)采用甲醇和20 mmol/L乙酸銨混合溶液作為淋洗液。

2.1.3 梯度洗脫對(duì)分離效果的影響

首先，參照國(guó)標(biāo)用甲醇和20 mmol/L乙酸銨(5+95)混合溶液作為淋洗液[13]，等度洗脫對(duì)5種化合物進(jìn)行檢測(cè)，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定的5種化合物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 5 compounds determined by national standard method

由圖1可知，5種化合物的出峰順序分別為安賽蜜、山梨酸、苯甲酸、糖精鈉和脫氫乙酸。安賽蜜、苯甲酸可以很好地分離，苯甲酸和糖精鈉的分離度為1.84，不能很好地分離。

保持淋洗液的組合不變，通過(guò)改變洗脫方式，進(jìn)行梯度洗脫，5種化合物的色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 梯度洗脫時(shí)5種化合物的色譜圖Fig.2 Chromatogram of of 5 compounds at gradient elution

由圖2可知，淋洗液中甲醇和乙酸銨洗脫配比的變化導(dǎo)致5種化合物的出峰順序發(fā)生改變，并且出峰時(shí)間均向后推遲，其中苯甲酸、糖精鈉和脫氫乙酸基本可以完全分離。

2.1.4 水相酸度對(duì)分離效果的影響

在水相B中加入冰乙酸改變B相的pH值，將B相的pH值調(diào)節(jié)到5.93時(shí)，和A相進(jìn)行梯度洗脫，5種化合物的色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 B相pH值為5.93時(shí)5種化合物的色譜圖Fig.3 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.93 in phase B

由圖3可知，通過(guò)加入冰乙酸調(diào)節(jié)B相的pH值為5.93，5種化合物的出峰順序?yàn)榘操惷?、山梨酸、糖精鈉、苯甲酸和脫氫乙酸。出峰時(shí)間均向后推遲，山梨酸和糖精鈉不能很好地分離。

將B相繼續(xù)調(diào)節(jié)pH值為5.59時(shí)，5種添加劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 B相pH值為5.59時(shí)5種化合物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.59 in phase B

山梨酸和糖精鈉的分離度仍然不好。繼續(xù)加入冰乙酸調(diào)節(jié)B相的pH值為5.28時(shí)，5種化合物的色譜圖見(jiàn)圖5。

圖5 B相pH值為5.28時(shí)5種化合物的色譜圖Fig.5 Chromatogram of 5 compounds at pH value 5.28 in phase B

由圖5可知，采用冰乙酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相B的pH值到5.28時(shí)，5種化合物的出峰順序沒(méi)有變化，但出峰時(shí)間均靠前了，安賽蜜、苯甲酸、糖精鈉、山梨酸和脫氫乙酸峰形變得更窄，特別是脫氫乙酸基本不拖尾了，5種化合物相互間的分離度良好，可以完全分離。繼續(xù)加入冰乙酸，調(diào)節(jié)B相的pH值到5.17時(shí)，效果無(wú)太大變化，繼續(xù)加入冰乙酸，調(diào)節(jié)B相的pH值到4.96時(shí)，苯甲酸和脫氫乙酸的分離度變低，且信號(hào)開(kāi)始降低，直到調(diào)節(jié)B相的pH值到3.94時(shí)，得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 B相pH值為3.94時(shí)5種化合物的色譜圖Fig.6 Chromatogram of 5 compounds at pH value 3.94 in phase B

由圖6可知，苯甲酸完全沒(méi)有信號(hào)，基線也變差了，因此選擇調(diào)節(jié)B相的pH值到5.28時(shí)效果最好。

2.2 線性范圍和檢出限

按試驗(yàn)方法1.3測(cè)定一系列不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以相對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比為3倍(3 S/N)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，以信噪比為10倍(10 S/N)相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，得到各化合物的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限，見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Linear relationship, correlation coefficients, detection limits and quantitative limits

2.3 方法的回收率和精密度

按試驗(yàn)方法1.4制備加標(biāo)樣品，取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做低、中、高三水平加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定7次，計(jì)算5種化合物的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。5種化合物的平均回收率在66.43%～102.87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3.2%，這表明所建立的分析方法的精密度和準(zhǔn)確度均滿足檢測(cè)要求。

表2 回收率和精密度(n=7)Table 2 Recovery rates and precision(n=7)

續(xù) 表

3 結(jié)論

本文采用超高效液相色譜法可同時(shí)測(cè)定陳年道菜中的3種防腐劑和2種甜味劑，大大節(jié)約了試劑的消耗和縮短了分析時(shí)間。本方法操作簡(jiǎn)單，色譜分離效果和穩(wěn)定性好，并可獲得較高的精密度和準(zhǔn)確度，適合大批量樣品的快速測(cè)定，同時(shí)為其他醬腌菜樣品的快速測(cè)定提供了參考。