李利華，郭豫梅

(陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723000)

白豆蔻，為芭蕉目姜科豆蔻屬植物白豆蔻的果實(shí)，可藥食兼用。中醫(yī)認(rèn)為，白豆蔻性溫、味辛，歸肺、脾胃經(jīng)，有溫中止嘔、化濕行氣的功效，常用來(lái)治療濕阻所滯、脾胃不和、脘腹脹滿、不思飲食等[1,2]?，F(xiàn)代研究表明，白豆蔻中含有揮發(fā)油、精油、萜烯類化合物等物質(zhì)，具有抑菌、平喘、芳香健胃、驅(qū)風(fēng)等多種藥理作用[3,4]。

黃酮類化合物是指以C6—C3—C6為基本碳架的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮[5]。黃酮類化合物廣泛存在于自然界植物體中，因其有較多的藥用功效[6,7]，已成為天然藥物的研究熱點(diǎn)之一。目前對(duì)白豆蔻的研究主要集中在白豆蔻揮發(fā)油[8,9]，對(duì)于白豆蔻黃酮類化合物的研究較少，僅有朱云霞等利用高速逆流色譜從白豆蔻中分離出5-羥基-3，7，4′-三甲氧基黃酮[10]，而對(duì)于白豆蔻總黃酮的提取尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮類化合物，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化總黃酮的提取工藝條件，并通過(guò)對(duì)羥基自由基(·OH)的清除及超氧陰離子自由基(O2-·)的清除，考察白豆蔻總黃酮的抗氧化活性，為白豆蔻總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白豆蔻：購(gòu)于當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng)；將白豆蔻洗凈，低溫烘干，粉碎備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：優(yōu)級(jí)純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚等：以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

UV型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津儀器公司；TDL-9001型光電分析天平 北京梅特勒精密儀器公司；PHS-3C 酸度計(jì) 北京賽多利斯儀器有限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵 開(kāi)封宏興科教儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法[11]。配制一系列不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別顯色后于510 nm處測(cè)定吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=5.342C-0.208，R=0.9979，其中C為蘆丁濃度(mg/mL)，A為對(duì)應(yīng)的吸光度值。

1.2.2 白豆蔻總黃酮的提取及總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取白豆蔻粉末3.00 g，按照一定的料液比(g/mL)加入提取劑乙醇，設(shè)定一定的提取溫度和提取時(shí)間浸提白豆蔻總黃酮，抽濾，即得白豆蔻總黃酮提取液。

精密吸取定容好的溶液提取2.00 mL于25 mL容量瓶中，按照1.2.1的方法顯色后，在510 nm處測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算白豆蔻總黃酮提取率。

白豆蔻總黃酮提取率(%)=(測(cè)得總黃酮濃度×溶液體積×稀釋倍數(shù))/干樣品質(zhì)量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以提取率為衡量指標(biāo)，分別考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、提取時(shí)間(20，40，60，80，100 min)對(duì)白豆蔻總黃酮提取率的影響效果，篩選出各因素的最優(yōu)水平區(qū)間，每個(gè)處理做3份平行。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)各單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)選結(jié)果，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，利用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表優(yōu)化白豆蔻總黃酮提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 白豆寇總黃酮抗氧化性能實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[12,13]的方法并略有改動(dòng)。以Vc為陽(yáng)性對(duì)照品，考察白豆蔻總黃酮對(duì)羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果

圖1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction rate

由圖1可知，乙醇濃度在40%～60%內(nèi)，白豆蔻總黃酮提取率隨乙醇濃度的增加呈上升趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)提取率最高，為2.41%，而當(dāng)乙醇濃度高于60%后，白豆蔻總黃酮提取率逐漸下降，這可能是因?yàn)橐掖紳舛仍礁?，醇溶性雜質(zhì)、色素及親脂性強(qiáng)的組分浸出量會(huì)增加，導(dǎo)致黃酮類化合物提取率下降。因此，乙醇濃度選擇60%左右最佳。

2.1.2 料液比對(duì)白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on the extraction rate

由圖2可知，料液比在1∶20～1∶40內(nèi)，隨著料液比的增大，白豆蔻總黃酮提取率明顯上升，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)提取率最高，為2.26%，而當(dāng)料液比大于1∶40后，白豆蔻總黃酮提取率有所下降。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)增大提取劑用量有利于白豆蔻總黃酮的溶出，但提取劑用量過(guò)大，一方面總黃酮的溶出已達(dá)飽和，另一方面其他雜質(zhì)成分的溶出會(huì)增多，增加了后續(xù)濃縮、分離純化的負(fù)擔(dān)。因此，料液比選擇1∶40左右最佳。

2.1.3 提取溫度對(duì)白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果

圖3 提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction rate

由圖3可知，提取溫度在40～80 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高白豆蔻總黃酮提取率呈先上升后下降的趨勢(shì)，70 ℃時(shí)總黃酮提取率達(dá)最大值，為2.38%，當(dāng)提取溫度高于70 ℃時(shí)，白豆蔻總黃酮提取率有所下降；這可能是因?yàn)檫^(guò)高的溫度會(huì)引起黃酮分子發(fā)生裂解，使得提取率降低。因此，提取溫度選擇70 ℃左右最佳。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)白豆蔻總黃酮提取率的影響結(jié)果

由圖4可知，提取時(shí)間在20～60 min范圍內(nèi)，白豆蔻總黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，且在提取時(shí)間60 min時(shí)提取率最高，為2.32%，而當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)60 min后，白豆蔻總黃酮提取率有所下降?？赡艿脑蚴情L(zhǎng)時(shí)間受熱會(huì)使已溶出的黃酮類化合物鍵斷裂，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。因此，提取時(shí)間選擇60 min左右最佳。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on the extraction rate

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2可知，比較K值大小可得到白豆蔻總黃酮的最優(yōu)提取條件為A2B1C2D2，即：乙醇濃度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min；由極差R值可得出4個(gè)因素對(duì)總黃酮提取的影響主次順序?yàn)锳(乙醇濃度)>C(提取溫度)>D(提取時(shí)間)>B(料液比)。

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

表3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of verification experiment

由表3可知，在優(yōu)化得到的最佳工藝條件下，白豆蔻總黃酮平均提取率為2.82%，高于表2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表中的9組提取率結(jié)果，RSD<1.65%，表明該工藝條件穩(wěn)定，可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。

2.4 白豆蔻總黃酮抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 對(duì)·OH清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 白豆蔻總黃酮對(duì)·OH的清除作用Fig.5 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against·OH

由圖5可知，隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大，其對(duì)·OH的清除率逐漸升高，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)最大清除率為73.7%；與對(duì)照品Vc比較可知，Vc對(duì)·OH的最大清除率為90.1%，高于白豆蔻總黃酮，說(shuō)明白豆蔻總黃酮對(duì)·OH具有一定的清除能力，但清除能力低于Vc對(duì)照品。

2.4.2 對(duì)O2-·清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 白豆蔻總黃酮對(duì)O2-·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of total flavonoids from Amomum kravanh against O2-·

由圖6可知，隨著白豆蔻總黃酮提取液濃度的增大，其對(duì)O2-·的清除率逐漸升高，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)白豆蔻總黃酮對(duì)O2-·的最大清除率為87.8%，對(duì)照品Vc的最大清除率為90.3%；由此可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，白豆蔻總黃酮對(duì)O2-·的清除能力與Vc相當(dāng)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑提取白豆蔻中的總黃酮，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝；以羥基自由基清除率及超氧陰離子自由基清除率為指標(biāo)，考察白豆蔻總黃酮的抗氧化性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白豆蔻總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度60%，料液比1∶30 (g/mL)，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間60 min，在此工藝條件下，白豆蔻總黃酮提取率為2.82%，說(shuō)明該優(yōu)化工藝條件穩(wěn)定，可以作為白豆蔻總黃酮的提取工藝條件。白豆蔻對(duì)羥基自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除實(shí)驗(yàn)顯示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)·OH的最大清除率為73.7%，對(duì)O2-·的最大清除率為90.1%，與Vc對(duì)照品比較可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)白豆蔻總黃酮對(duì)·OH的清除能力略低于Vc，對(duì)O2-·的清除能力與Vc相當(dāng)，說(shuō)明白豆蔻總黃酮對(duì)·OH和O2-·均具有一定的清除能力。本研究結(jié)果可為白豆蔻總黃酮類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論參考。