王蕊，胡輝帆，陳文蘭，張強，劉變芳

(西北農(nóng)林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 咸陽 712100)

真菌感染是導致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中農(nóng)作物減產(chǎn)和食品質(zhì)量安全問題的主要原因之一，每年由于真菌污染造成的食物損失接近30%[1]。真菌在自然界中分布廣、數(shù)量多，常見于食品及其原料中的污染真菌有疫霉屬、核盤菌屬、曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬等[2-4]。一些真菌分泌產(chǎn)生的毒素會引起急慢性食物中毒，食品中真菌及真菌毒素的污染已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題[5]。在農(nóng)作物和食品的生產(chǎn)加工過程中，更多以使用農(nóng)藥化肥、化學消毒劑、防腐劑為主要措施，但弊端日益顯現(xiàn)，這些化學物質(zhì)的殘留不僅影響食品安全，也會造成環(huán)境污染，影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[6]。

目前，通過植物源、動物源、微生物源有效活性成分抑制病原菌的生長與繁殖已經(jīng)成為研究熱點[7]。生物法有著高效、安全、無污染等特點，其中芽孢桿菌屬易繁殖，對環(huán)境適應能力強，具有很大的開發(fā)研究價值。有研究報道[8-10]，芽孢桿菌已廣泛應用于豆豉、面包等發(fā)酵食品中，一方面可產(chǎn)生食品級的酶制劑，如淀粉酶、蛋白酶、豆豉纖溶酶、納豆激酶；另一方面可代謝產(chǎn)生能用于食品加工與保鮮、農(nóng)業(yè)生物防治等領域的脂肽類抑菌物質(zhì)。滿麗莉等[11]分離到一株枯草芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液對青霉、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較強的抑制效果，具有開發(fā)為益生菌制劑的潛能。周濤等[12]從湖泥、土壤中分離篩選到具有廣譜抑菌作用的多粘類芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其有作為堿性食品保鮮劑的潛能。本研究基于從有機質(zhì)土壤中選育的一株產(chǎn)淀粉酶的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，研究了其對真菌的拮抗作用，并對該菌株代謝產(chǎn)物中可能的抑菌物質(zhì)進行分離和鑒定，為進一步開發(fā)天然食品防腐劑及生防菌劑提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BFWR11：本課題組分離并保存；黑曲霉菌：由西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院提供；灰霉菌、赤霉菌：由西北農(nóng)林科技大學植物保護學院提供。

1.1.2 試劑

BaCl2：天津市天力化學試劑有限公司；NaCl、苯甲酸鈉、Na2HPO4·12H2O、甲醇、正丁醇：廣東光華科技股份有限公司；KH2PO4：成都市科龍化工試劑廠；YA1080普通干型透析袋MD25(3500D)：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器

NRY-2102型搖床培養(yǎng)箱 上海南榮實驗室設備有限公司；LMQ.CE型立式滅菌鍋 山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；SmartSpecTMplus 分光光度計 美國 Bio-Rad儀器有限公司；CD-UPTL II型超純水制造系統(tǒng) 成都越純科技有限公司；Bioscreen全自動生長曲線分析儀 上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BFWR11菌株生長曲線測定

從甘油保藏管中取1環(huán)菌液劃線接種于LB平板，30 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落接種到5 mL新鮮LB肉湯中，130 r/min、30 ℃培養(yǎng)12 h。用新鮮的LB肉湯調(diào)整培養(yǎng)物OD600值為0.5，稀釋10倍后吸取250 μL接于蜂窩板中，使用Bioscreen全自動生長曲線分析儀測定菌株生長曲線，設定參數(shù)為30 ℃、中速，每組試驗3次重復。

1.2.2 BFWR11菌株對真菌的拮抗作用

選擇赤霉菌、灰霉菌、黑曲霉菌為測試真菌。分別制備孢子懸液，涂布接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d至菌絲長起，用直徑5 mm的打孔器取真菌菌塊，備用。采用平板對峙培養(yǎng)法測定BFWR11菌株對不同真菌的拮抗作用，在直徑90 mm的PDA平板中心輕輕放置真菌菌塊，菌絲面朝下，試驗組將BFWR11菌株點接種到距離真菌菌塊20 mm位置，平板上對稱取4點接種，3個重復平板。對照組只接入測試真菌菌塊。28 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察、測量菌塊大小，計算抑菌率。

抑菌率=(對照組菌塊直徑-試驗組菌塊直徑)/對照組菌塊直徑×100%。

1.2.3 BFWR11菌株發(fā)酵上清液的制備

挑取單菌落接種到5 mL新鮮LB肉湯中，130 r/min、30 ℃培養(yǎng)12 h進行活化，作為種子液。按5%接種量將種子液接種到100 mL的LB肉湯中，130 r/min、30 ℃培養(yǎng)50 h，作為發(fā)酵液。發(fā)酵液于4 ℃、10000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜除菌，獲得發(fā)酵上清液，備用。

1.2.4 脂肽粗提物的制備

參考邵天蔚等[13]的研究方法，取200 mL發(fā)酵上清液，用6 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH為2.0，4 ℃靜置過夜。4 ℃，10000 r/min 離心20 min，倒掉上清，沉淀用50 mL甲醇溶解，真空抽濾后，將濾液進行旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑，濃縮后將樣品于45 ℃進行真空干燥，所得的干燥樣品用PBS緩沖液(0.02 mol/L，pH 7.2)定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜除菌，獲得脂肽粗提物。

1.2.5 正丁醇萃取物的制備

取200 mL發(fā)酵上清液，加入等體積正丁醇，萃取2次后合并有機相，于60 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮后進行真空干燥，所得的干燥樣品用PBS緩沖液定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜除菌，獲得正丁醇萃取物。

1.2.6 粗蛋白提取物的制備

取200 mL發(fā)酵上清液，稱取112.2 g硫酸銨顆粒，緩慢加入上清液中，使其飽和度達到80%，4 ℃靜置過夜。4 ℃，10000 r/min離心20 min，倒掉上清，沉淀用0.02 mol/L PBS緩沖溶液重懸后裝入透析袋(透析袋沸水浴10 min后于4 ℃保存在1%苯甲酸鈉溶液中備用，使用前用蒸餾水沖洗干凈)，透析袋放置于裝有2 L PBS緩沖液的燒杯中透析除鹽。在透析3，6，12 h后更換透析液，直至采用1% BaCl2溶液滴定檢測燒杯中透析液無沉淀生成。將透析袋內(nèi)溶液于45 ℃進行真空干燥，所得的干燥樣品用PBS緩沖液定容至5 mL，經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜除菌，獲得粗蛋白提取物。

1.2.7 不同提取物抑菌活性的測定

采用雙層平板牛津杯法對上述粗提液進行抑菌活性的測定。將10 mL 2%瓊脂倒入培養(yǎng)皿中待其凝固，用鑷子將無菌牛津杯輕輕置于其上，均勻倒PDA培養(yǎng)基，待其凝固后于平板中心位置放置真菌菌塊，每個牛津杯孔加入200 μL待檢測粗提液，3個重復平板，28 ℃培養(yǎng)5～7 d。

1.2.8 LC-MS非靶標代謝組學檢測

稱取10 mg凍干后的正丁醇萃取物，加入10 mL提取液(乙腈∶水為1∶1，V/V)，渦旋混勻30 s，冰水浴超聲10 min，將樣品于4 ℃，12000 r/min離心15 min，取100 μL上清液于進樣瓶中，采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF-MS)分析檢測。

通過Waters ACQUITY UPLC BEH Amide (2.1 mm×100 mm，1.7 μm)液相色譜柱對目標化合物進行色譜分離。液相色譜A相為水相，含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水，B相為乙腈。采用梯度洗脫：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，95%～65% B；7～8 min，65%～40% B；8～9 min，40% B；9～9.1 min，40%～95% B；9.1～12 min，95% B。流動相流速：0.5 mL/min，柱溫：25 ℃，樣品盤溫度：4 ℃，進樣體積：正離子1 μL，負離子1 μL。

使用Triple TOF 6600高分辨質(zhì)譜，通過IDA(information-dependent acquisition)模式進行高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。本部分檢測委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.2.9 發(fā)酵液蛋白提取物定性分析

蛋白提取物使用FASP(filter aided sample preparation)法進行酶解，獲得的肽段使用0.1%甲酸-水溶液復溶，進樣15 μL，78 min色譜梯度分離，采用Thermo Scientific Fusion超高分辨率質(zhì)譜儀檢測。本部分檢測委托北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用OriginPro 2016軟件作圖，Minitab 16.2.3軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，結果用平均值±標準差(x±SD)來表示。

2 結果與分析

2.1 BFWR11菌株對真菌的拮抗作用

用平板對峙培養(yǎng)法檢測BFWR11菌株對真菌的拮抗作用，拮抗效果見圖1。

圖1 BFWR11菌株對真菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of BFWR11 strain on fungi

由圖1可知，BFWR11菌株對赤霉菌、灰霉菌、黑曲霉菌的生長均有明顯的拮抗作用，其中赤霉菌氣生菌絲發(fā)達，向培養(yǎng)基上空伸展，由于皿蓋阻擋，限制了氣生菌絲直生，使其疊生于皿蓋上，但在BFWR11菌落周圍的培養(yǎng)基中沒有生長，灰霉菌和黑曲霉菌試驗組真菌菌絲生長均受到明顯抑制。BFWR11菌株對赤霉菌、灰霉菌、黑曲霉菌的抑菌率分別為45.03%、30.60%和47.56%，結果見表1。

表1 BFWR11菌株對真菌的抑菌率Table 1 The antibacterial rates of BFWR11 strain against fungi

2.2 BFWR11菌株的生長曲線

采用全自動生長曲線分析儀測定BFWR11菌株在LB肉湯中的生長曲線，結果見圖2。

圖2 BFWR11菌株生長曲線Fig.2 Growth curve of BFWR11 strain

BFWR11菌株在3 h內(nèi)很快進入對數(shù)生長期，菌數(shù)快速增長，培養(yǎng)12 h后細菌密度達到最大值，OD600為0.54。對數(shù)期微生物是發(fā)酵工業(yè)中用作種子的最優(yōu)材料，后續(xù)試驗選擇12 h純培養(yǎng)物作為發(fā)酵種子液。12 h后細菌生長進入穩(wěn)定期，為積累代謝產(chǎn)物的發(fā)酵時期，此后OD600變化趨勢平緩，OD600為0.50～0.55，試驗選擇培養(yǎng)50 h即積累代謝產(chǎn)物較多的穩(wěn)定期的培養(yǎng)物作為發(fā)酵液，用其上清液提取不同代謝產(chǎn)物進行拮抗試驗。

2.3 BFWR11菌株代謝產(chǎn)物對真菌的抑制作用

BFWR11發(fā)酵上清液的不同粗提物對真菌的抑制效果見圖3。BFWR11菌株的發(fā)酵液和離心去除菌體后的上清液對赤霉菌有抑制作用。BFWR11發(fā)酵上清液經(jīng)酸沉淀、甲醇抽濾后得到的淡黃色脂肽類物質(zhì)對赤霉菌有抑制作用，和對照組比較，試驗組菌絲無法蔓延生長。正丁醇萃取物對赤霉菌菌絲的抑制效果明顯，揭示極性大的正丁醇可以萃取到較多的抑菌活性物質(zhì)。80%硫酸銨溶液鹽析提取的粗蛋白對赤霉菌菌絲生長也有抑制作用(見圖3中Ⅰ)。

BFWR11發(fā)酵液和上清液對灰霉菌菌絲都有抑制作用。發(fā)酵液比上清液的抑制作用強，推測發(fā)酵液中BFWR11菌株不僅分泌抑菌物質(zhì)在上清液中，而且還會通過生物競爭或其他途徑對灰霉菌進行抑制。脂肽粗提物、正丁醇萃取物、粗蛋白提取物對灰霉菌的抑制效果明顯，試驗組菌絲均無法正常蔓延生長，表明酸沉淀、正丁醇萃取、硫酸銨沉淀3種方法可提取到發(fā)酵上清液中不同類型抑菌活性物質(zhì)(見圖3中Ⅱ)。

BFWR11發(fā)酵液對黑曲霉菌有抑制作用，但上清液、脂肽粗提物、正丁醇萃取物、粗蛋白提取物對黑曲霉菌絲的生長均未表現(xiàn)出明顯的抑制作用，推測可能是因為黑曲霉繁殖力強，試驗采用的200 μL不足以抑制其菌絲生長，或是與赤霉菌、灰霉菌相比，BFWR11菌株和黑曲霉菌之間的拮抗作用機制不同(見圖3中Ⅲ)。

2.4 正丁醇萃取物UHPLC-QTOF-MS分析鑒定

采用UHPLC-QTOF-MS對正丁醇萃取物成分進行定性分析，非靶標代謝組學檢測到2535種物質(zhì)，包括酸類、酚類、堿類等。按相對含量由多到少列出部分抑菌相關物質(zhì)鑒定結果，見表2。其中棕櫚酸含量最高，其次為阿扎胞苷、3-羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、水楊酸等。祁超等[14]對枯草芽孢桿菌YN201490發(fā)酵上清液的正丁醇萃取物采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術鑒定到表面活性素和伊枯草菌素，與祁超等的研究結果不同可能是菌株差異或檢測技術不同造成的。

表2 正丁醇萃取物的UHPLC-QTOF-MS檢測分析結果Table 2 The analysis results of n-butanol extracts detected by UHPLC-QTOF-MS

2.5 蛋白提取物LC-MS/MS定性分析

每個蛋白經(jīng)酶解產(chǎn)生長短不一的肽段后應用LC-MS/MS對其進行鑒定，根據(jù)每個時間點質(zhì)譜信號強度最高的母離子繪制得到TIC圖(見圖4)。基于信號最強的肽段的強度值繪制得到Base Peak圖(見圖5)?；赨niProt-Bacillussubtilis序列庫進行蛋白樣品的序列庫搜索，比對獲得共計750個肽段，520個蛋白質(zhì)。抑菌活性相關蛋白信息見表3，鑒定到3種表面活性素合成酶亞基(基因名稱分別為srfAA、srfAB、srfAC)、聚酮合成酶(基因名稱分別為pksN、pksL)、鞭毛鉤相關蛋白(基因名稱分別為fliD、flgK)等。

圖4 總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram

圖5 基峰色譜圖Fig.5 Base peak chromatogram

表3 蛋白物質(zhì)LC-MS/MS定性分析結果Table 3 The qualitative analysis results of protein substances detected by LC-MS/MS

續(xù) 表

表面活性素由環(huán)7肽Glu-Leu-(D)-Leu-Val-Asp-(D)-Leu-Leu與β-羥基脂肪酸組成，是由非核糖體途徑合成的脂肽類抑菌物質(zhì)，srfA，srfB和srfP基因已被證明是負責表面活性素合成的基因簇，srfA基因編碼表面活性素合成酶的3個大亞基[15]。試驗使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術對BFWR11菌株發(fā)酵上清液的酸沉淀粗提物進行檢測，未鑒定到脂肽類相關物質(zhì)，但從粗蛋白中鑒定到表面活性素合成酶亞基，因此推測BFWR11菌株可產(chǎn)生表面活性素這一環(huán)狀脂肽類抑菌物質(zhì)。聚酮合成酶和非核糖體肽合成酶均可催化合成抑菌物質(zhì)，這兩類酶的基因常作為篩選產(chǎn)生新穎結構天然活性化合物的微生物指示基因[16]。鞭毛鉤蛋白由flgK基因編碼，fliD基因是鞭毛基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關鍵組分，促使鞭毛亞單位聚合成完整的鞭毛蛋白，而鞭毛蛋白是典型的毒力因子，幫助細菌感染定殖，對抑菌活性有著重要作用[17,18]。

3 結論

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的新成員，具有廣闊的應用前景。詹藝舒等[19]分離到一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其對食品腐敗真菌黑曲霉、康氏木霉、綠色木霉、少根根霉、易脆毛霉、赭綠青霉的生長具有較強的抑制作用。本試驗中選用的BFWR11菌株是本課題組前期分離到的一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，牛津杯法和平板對峙培養(yǎng)法試驗結果表明其對赤霉菌、灰霉菌及黑曲霉菌具有較強的拮抗作用，酸沉淀、正丁醇萃取、硫酸銨沉淀3種不同方法的發(fā)酵上清液粗提物對赤霉菌和灰霉菌有明顯的抑制作用，這表明不僅可以利用BFWR11菌株進行生物防治，也可對其上清液中的抑菌物質(zhì)進行提取濃縮和開發(fā)利用。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BFWR11可產(chǎn)生酸類、堿類、蛋白類等多種抑菌活性物質(zhì)協(xié)同抑菌，其中脂肽類物質(zhì)作為一種新型的生物表面活性劑，不僅具有良好的乳化性質(zhì)，還具有抑菌、增溶、潤濕等作用，目前主要應用于魚、蝦及其制品的保鮮[20]，這為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌BFWR11及其代謝產(chǎn)物進一步開發(fā)為生防菌劑及天然食品防腐劑奠定了理論基礎，后續(xù)可基于鑒定到的抑菌活性物質(zhì)從代謝和基因水平進行系統(tǒng)深入研究，闡明其作用機理。