張曉慷，蔣愛忠，王海利，王瀅秀，張新剛

(山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院 山東省化學(xué)農(nóng)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250033)

脂肽類化合物是由芽孢桿菌、假單胞菌等細(xì)菌微生物代謝產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于芽孢桿菌微生物農(nóng)藥的生產(chǎn)過程中[1]。由于近年來化學(xué)農(nóng)藥的濫用導(dǎo)致的殘留、毒性和污染問題日益凸顯，脂肽類化合物具有的環(huán)境友好、易降解、抗細(xì)菌[2-3]、抗真菌[4-5]等優(yōu)點(diǎn)日益得到人們的關(guān)注，并在食品工業(yè)[6]、環(huán)境保護(hù)[7]、化妝品行業(yè)[8]與生物制藥領(lǐng)域得到了不斷的研究與開發(fā)。

目前，脂肽類化合物的應(yīng)用前景較為廣泛，具有較大的開發(fā)價(jià)值。但是，脂肽類化合物的分離工藝一直沒有大的突破，現(xiàn)在常采用的分離手段，如制備液相色譜、分子篩排阻層析、ODS反向分配層析等精致工藝大多適用于實(shí)驗(yàn)室少量制備高純度樣品，難以進(jìn)行工業(yè)化放大，無法滿足應(yīng)用化研究的需要，所以急需要開發(fā)一種規(guī)?；闹苽涔に?。

本課題組從前期的工作中篩選出一株對黃瓜灰霉病[9]有防效的貝萊斯芽孢桿菌，通過對其有效成分的分析與鑒定，確認(rèn)了其有效成分中存在脂肽類化合物。本文對F170062菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，并對脂肽的分離純化工藝進(jìn)行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

生產(chǎn)菌株：前期篩選出的生產(chǎn)脂肽的菌株F170062，系貝萊斯芽孢桿菌，由山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

C4發(fā)酵培養(yǎng)基：10g可溶性淀粉、20g葡萄糖、25g花生粉、1g牛肉膏、4g酵母浸粉、2gNaCl、0.05gK2HPO4，水1000mL，調(diào)節(jié)pH值=7.2，分裝于250mL三角瓶中，每瓶約100mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

Landy發(fā)酵培養(yǎng)基：20g葡萄糖、5g L-谷氨酸鈉、0.5gMgSO4、0.5gKCl、1g KH2PO4、0.15mg FeSO4、5mg MnSO4、0.16 mgCuSO4，水1000mL，調(diào)節(jié)pH值=7.2，分裝于250mL三角瓶中，每瓶約100mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

1.2 方法

1.2.1 脂肽含量的測定

取生長有F170062菌的斜面接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，轉(zhuǎn)速180r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)數(shù)天。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液4000r/min離心30min，收集上清液，并用6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)其pH值到2.0，4℃冷藏過夜，產(chǎn)生沉淀。離心收集沉淀，經(jīng)甲醇浸提兩次，過濾、濃縮溶液，獲得脂肽粗提物。將脂肽粗提物定量配成甲醇溶液，采用高效液相色譜法定量測定其中脂肽含量(g/g)，或折算為脂肽在發(fā)酵液中的含量(mg/L)。

1.2.2 不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液中的脂肽含量測定

取生長有F170062菌的斜面接種于C4培養(yǎng)基中，在28℃，轉(zhuǎn)速180r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)48h，作為種子液，而后按5%的種子液量接入到新發(fā)酵培養(yǎng)基中，在相同條件下，繼續(xù)發(fā)酵，在第3，4，5，6，7天，每天取2L發(fā)酵液，按照1.2.1的方法測定發(fā)酵液中的脂肽含量。

1.2.3 溶劑沉淀試驗(yàn)

將脂肽粗提物按照100mg/L的濃度配成甲醇溶液，待其溶解完全后，向溶液中瞬間加入4，6，8，10倍體積的的乙酸乙酯，而后磁力攪拌溶液30min，過濾沉淀，40℃烘干，對溶劑相進(jìn)行脫溶處理，后將沉淀相與溶劑相分別定量溶解在甲醇溶液中，測定其中的脂肽含量。

1.2.4 水洗工藝試驗(yàn)

1.2.4.1 沉淀溶解性試驗(yàn)

將經(jīng)溶劑沉淀試驗(yàn)處理后的沉淀物溶解在甲醇溶液中，靜置過夜，將其中的不溶物過濾，40℃的烘箱中烘干，后取10mg分別溶解在3mL的正己烷、二氯甲烷、甲醇、乙醇、正丁醇、水、乙酸乙酯等7種溶劑中，觀察其溶解情況。

1.2.4.2 水洗處理試驗(yàn)

將經(jīng)溶劑沉淀試驗(yàn)處理后的沉淀物放在40℃的烘箱中烘干，然后定量向其中加入蒸餾水，攪洗30min，過濾不溶物，40℃烘干，將水相脫溶，后將不溶物相與水相分別定量溶解在甲醇溶液中，測定其中的脂肽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽含量的影響

選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽的生產(chǎn)與分離純化至關(guān)重要。營養(yǎng)成分豐富的培養(yǎng)基能夠提高芽孢桿菌的發(fā)酵效率，增加脂肽在發(fā)酵液中的含量，但是發(fā)酵液中較多的外源性雜質(zhì)會增大脂肽的分離難度；而有利于脂肽分離的培養(yǎng)基往往成分比較單一，有利于脂肽的分離卻不利于其發(fā)酵生產(chǎn)。

選擇脂肽發(fā)酵常用的Landy發(fā)酵培養(yǎng)基[10]與本實(shí)驗(yàn)室自用的C4培養(yǎng)基，按照

1.2.1 脂肽含量的測定方法對比兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽發(fā)酵的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基對脂肽發(fā)酵的影響Table 1 Effects of fermentation medium on lipopeptide fermentation

如表1所示，F(xiàn)170062菌在兩種培養(yǎng)基中均能發(fā)酵生產(chǎn)脂肽。但是通過對比發(fā)現(xiàn)，C4培養(yǎng)基的脂肽發(fā)酵效率要明顯高于文獻(xiàn)中常使用的Landy培養(yǎng)基，脂肽在C4發(fā)酵液中的含量大約是Landy發(fā)酵液的5.6倍。但是分析脂肽在脂肽粗提物中的含量，兩次甲醇浸取，Landy培養(yǎng)基分別高C4培養(yǎng)基50%及67%。通過分析兩種培養(yǎng)基的主要營養(yǎng)成分可以得知，C4培養(yǎng)基有豐富的碳源、氮源以及其他營養(yǎng)成分，能夠?yàn)榫晏峁┏渥愕臓I養(yǎng)物質(zhì)，而Landy培養(yǎng)基的碳源較為單一，且有機(jī)氮源缺失，這使得菌株發(fā)酵很不充分，造成發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽總量較低。然而，Landy培養(yǎng)基的成分以單糖及各種無機(jī)鹽為主，成分簡單，有利于脂肽的分離，所以，兩次甲醇浸取操作脂肽在其粗提物中的的含量，Landy培養(yǎng)基均高于C4培養(yǎng)基。綜上所述，考慮到脂肽總量較高會有利于其后續(xù)的分離操作，決定選擇C4培養(yǎng)基為其發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.2 發(fā)酵時(shí)間對脂肽含量的影響

脂肽一般在芽孢桿菌生長的對數(shù)期開始合成，含量增長速度穩(wěn)定，在穩(wěn)定期大量合成，含量增長速度加快，到了衰亡期脂肽總量基本穩(wěn)定，含量不再增長[11]。所以，為了達(dá)到最大的脂肽發(fā)酵量，又不過多的浪費(fèi)時(shí)間，需要確定菌株由穩(wěn)定期轉(zhuǎn)到衰亡期的時(shí)間點(diǎn)。圖1反映了發(fā)酵時(shí)間與脂肽含量之間的關(guān)系。

本試驗(yàn)考察的發(fā)酵時(shí)間為3天至7天。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在第3天時(shí)，測定發(fā)酵液中的脂肽含量僅為7.55mg/L，含量較低，到發(fā)酵第四天，脂肽含量也僅增長到9.62mg/L，增長速度十分緩慢，此時(shí)說明F170062菌正處于對數(shù)增長期，營養(yǎng)物質(zhì)主要用于芽孢桿菌的增長，發(fā)酵生產(chǎn)的脂肽的量較少。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到4～6天時(shí)，脂肽含量從9.62mg/L猛增到44.63mg/L，含量增長了近4倍，此時(shí)說明芽孢桿菌進(jìn)入了增長穩(wěn)定期，在此階段，芽孢桿菌分泌了大量的蛋白酶，促進(jìn)了營養(yǎng)成分的分解和吸收，合成了大量的脂肽[11]。當(dāng)發(fā)酵天數(shù)到達(dá)第7天時(shí)，發(fā)酵液中的脂肽含量趨于穩(wěn)定，說明此時(shí)芽孢桿菌處在穩(wěn)定期與衰亡期，脂肽的合成開始減弱。綜合以上分析，考慮到時(shí)間成本，發(fā)酵時(shí)間確定為6天。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對脂肽含量的影響Fig.1 Effects of fermentation time on lipopeptide content

2.3 溶劑沉淀工藝對脂肽含量的影響

高純度脂肽本身并沒有酸化沉淀的特性，但當(dāng)發(fā)酵液中可酸化的雜質(zhì)較多時(shí)，脂肽就會被吸附在其中跟隨雜質(zhì)一塊沉淀下來，表現(xiàn)出可以被酸化沉淀的特征[12]。根據(jù)“相似相溶”原理，利用雜質(zhì)與脂肽在溶液中溶解性差異，通過向脂肽粗提物的甲醇溶液中加入乙酸乙酯，瞬間降低溶液的極性，可以使脂肽從雜質(zhì)中沉淀出來，從而達(dá)到分離提純的效果。表2為乙酸乙酯與甲醇的體積比與脂肽含量之間的關(guān)系。

表2 乙酸乙酯加入體積對脂肽含量的影響Table 2 Effects of ethyl acetate volume on lipopeptide content

當(dāng)乙酸乙酯與甲醇的體積比由4增加到8時(shí)，沉淀相中脂肽含量由5.70%增加到7.91%，而溶劑相中的脂肽含量由2.85%降低到了0.85%。這說明向脂肽粗提物溶液中加入乙酸乙酯，確實(shí)起到了脂肽與雜質(zhì)有效分離的作用，符合前期的理論推測，脂肽粗提物中大量低極性雜質(zhì)被溶解在混合溶液中，而脂肽和一部分高極性雜質(zhì)則從溶液體系中沉淀出來，脂肽在沉淀相中的含量明顯得到了提升。但當(dāng)加入的乙酸乙酯與甲醇的體積比由8增加到10時(shí)，沉淀樣品中脂肽的含量反而有所下降，這可能是由于脂肽粗提物中的一部分低極性雜質(zhì)與脂肽的親和力較強(qiáng)，將脂肽包裹在其中一起溶解在了溶液相，妨礙了兩者的分離。所以，經(jīng)過上述分析，最佳的乙酸乙酯與甲醇的體積比為8。

為了驗(yàn)證溶劑沉淀工藝對脂肽分離的有效性，試驗(yàn)中增大了脂肽粗提物的質(zhì)量，并進(jìn)行了三批次的重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果如下表所示。

表3 溶劑沉淀工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 3 The validation test of solvent precipition

由表可知，通過對溶劑沉淀工藝進(jìn)行了3次重復(fù)試驗(yàn)，增加了脂肽粗提物的質(zhì)量，脂肽的分離效果與前期的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。通過對重復(fù)試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，脂肽粗提物中低極性雜質(zhì)含量較高，分離出的雜質(zhì)質(zhì)量占脂肽粗提物的40%～60%。通過溶劑沉淀處理，可有效去除這部分雜質(zhì)，為后面的分離打下基礎(chǔ)。

2.4 水洗處理工藝對脂肽含量的影響

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，溶劑沉淀試驗(yàn)處理后的沉淀相，再重新用甲醇溶解后，會有沉淀析出，這與脂肽粗提物在甲醇中的溶解性有差異。將沉淀過濾后，按照1.2.4.1的方法對其進(jìn)行溶解性測試。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉淀物在正丁醇、甲醇、乙醇、正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯中溶解性較差，在水中能充分溶解。對此沉淀的脂肽含量進(jìn)行測定，沉淀中不含有脂肽。根據(jù)上述結(jié)果，對溶劑沉淀試驗(yàn)處理后的沉淀樣品進(jìn)行了水洗工藝探索，按照1.2.4.2方法進(jìn)行了試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表4所示：

表4 水洗處理工藝對脂肽含量的影響Table 4 Effects of water washing process on lipopeptide content

由表4可知，通過水洗工藝處理后，較沉淀相相比，未溶解相中的脂肽含量有了大幅提升，增長了100%，而在水相中幾乎沒有脂肽，雜質(zhì)質(zhì)量去除了近30%。對上述試驗(yàn)結(jié)果的分析推測，由于溶劑沉淀試驗(yàn)分離掉了脂肽粗提物中的大部分的低極性雜質(zhì)，使得雜質(zhì)中的高極性雜質(zhì)暴露了出來，這部分雜質(zhì)由于缺少了低極性雜質(zhì)的結(jié)合，其溶解性發(fā)生了改變，進(jìn)而從甲醇的溶液體系中沉淀出來。利用這部分高極性雜質(zhì)與脂肽溶解性之間的差異，可以非常方便的去除這部分雜質(zhì)，從而提升脂肽的含量。

3 結(jié)論與討論

脂肽類化合物由于存在產(chǎn)量低，難分離等問題，一直阻礙其進(jìn)行實(shí)用化開發(fā)。本文通過從發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、分離工藝等方面對脂肽類化合物的工業(yè)化進(jìn)行初步探索，著力解決其存在的問題。通過對比C4培養(yǎng)基與Landy培養(yǎng)基的脂肽發(fā)酵效率及脂肽的分離難度發(fā)現(xiàn)，文獻(xiàn)報(bào)道的Landy培養(yǎng)基雖然有助于脂肽分離，但是發(fā)酵效率低的缺點(diǎn)限制了其進(jìn)一步的工業(yè)化應(yīng)用，C4培養(yǎng)基成分復(fù)雜，難以分離，但也具有脂肽發(fā)酵效率高，產(chǎn)量大的優(yōu)勢，有利于其工業(yè)化的應(yīng)用。通過考察C4培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)間與脂肽含量之間的關(guān)系，確定了最佳的發(fā)酵時(shí)間，同時(shí)也從側(cè)面推測了菌株的生長與衰亡過程。探索了溶劑沉淀工藝及水洗工藝在脂肽分離上的應(yīng)用，大幅提升了脂肽的含量，而且在處理過程中盡量避免了使用柱層析、分子篩排阻層析或ODS反向分配層析等精致工藝，有利于其在工業(yè)化的應(yīng)用。