凌蕾 張季 向麗萍 王蘭蘭 駱書(shū)娜 王奧

摘 要：目的：建立一種同時(shí)測(cè)定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的高效液相色譜法。方法：食醋樣品經(jīng)處理后，采用HPLC-ELSD，以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖為對(duì)照品，固定相為Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水（70∶30）。結(jié)果：5種還原糖在色譜柱上得到有效的分離，在0.5～10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率在97.19%～104.03%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.12%～3.27%。對(duì)兩個(gè)不同企業(yè)赤水曬醋進(jìn)行測(cè)定分析，結(jié)果顯示不同企業(yè)以及不同年份的赤水曬醋中糖含量有較大的差異。結(jié)論：該方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于食醋中糖含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;食醋;糖

Abstract：Objective： To establish a determination HPLC-ELSD method for the simultaneous analysis of fructose，glucose，sucrose， maltose and lactose in vinegar. Methods： Vinegar sample was pretreated and then determined by HPLC-ELSD. Fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose as the standard substance， Agilent ZORBAX NH2 （250 mm×

4.6 mm， 5 μm） was adopted， the mobile phase was composed of acetonitrile-water （70∶30）. Results： Five sugars could be well separated， and have good linearity relationship in 0.5～10.0 mg·mL-1， the average recoveries were 97.19%～104.03%， and the RSD were 2.12%～3.27%. By measuring and analyzing of chishui sun vinegar samples from two different enterprises，the result showed that the content of sugar in chishui sun vinegar were different between different enterprises and years. Conclusion： The results showed that the method is simple，accurate and repeatable and it is suitable for the analysis of fructose， glucose， sucrose， maltose and lactose in vinegar.

Key words：HPLC; ELSD; Vinegar; Sugar

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.72

食醋作為一種大眾化的酸性調(diào)味品，具有助消化、抗衰老和潤(rùn)膚美容、抑制血糖升高、減少結(jié)石發(fā)生、抗癌等作用[1]。食醋有著悠久的制作工藝歷史，傳統(tǒng)食醋制作工藝主要以大米、糯米、高粱、玉米、小米和水果等為原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵釀制而成。在釀造發(fā)酵過(guò)程中因有大量微生物參與，能夠產(chǎn)生各種有機(jī)酸、還原糖、氨基酸、黃酮、多酚等多種營(yíng)養(yǎng)成分，賦予食醋獨(dú)特的保健功能并且影響食醋的風(fēng)味、品質(zhì)以及出醋率等[2]。食醋中糖主要來(lái)源于在生產(chǎn)過(guò)程中添加的蔗糖和生產(chǎn)原料的糖化。糖作為影響食醋風(fēng)味重要的因素之一，是醋中甜味的重要來(lái)源，不僅能減輕酸帶來(lái)的刺激，還能增加食醋的色澤和稠厚度[3]。

食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖屬于還原糖，目前還原糖的測(cè)定方法主要包括高錳酸鉀滴定法、斐林試劑滴定法、比色法等化學(xué)法，以及近紅外吸收光譜快速測(cè)定法、高效液相色譜法等[4-5]。其中化學(xué)法不僅耗時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜，還無(wú)法對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確定性和定量分析。目前有文獻(xiàn)報(bào)道高效液相色譜串聯(lián)示差折光檢測(cè)器應(yīng)用于測(cè)定食醋中糖含量，但示差折光檢測(cè)器有靈敏度較低、系統(tǒng)平衡時(shí)間較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，同時(shí)溫度、流速、基線噪音等因素對(duì)目標(biāo)化合物的分離影響較大[6]。而蒸發(fā)散射檢測(cè)器（ELSD）測(cè)定食醋中糖含量的穩(wěn)定性好、靈敏度比示差折光法有更高的優(yōu)勢(shì)，并且高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)食醋中糖進(jìn)行定性和定量的檢測(cè)少有報(bào)道。因此，本文采用高效液相色譜串聯(lián)蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，建立一種對(duì)食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖同時(shí)測(cè)定的高效液相色譜法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260高效液相色譜儀、1260蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）、SEP-PARK C18固相萃取柱（美國(guó)沃特世公司）、Milli-Q超純水系統(tǒng)（密理博中國(guó)有限公司）。

果糖（純度>99.7%）、葡萄糖（純度>99.4%）、蔗糖（純度>99.9%）、麥芽糖（純度>94.9%）、乳糖（純度>94.8%），均購(gòu)自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈：色譜純，購(gòu)自美國(guó)天地公司;高純氮?dú)猓杭兌却笥?9.99%;食醋樣品：市售。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確移取食醋樣品5 mL置于50 mL離心管中，加入20 mL去離子水，渦旋混合30 s，12 000 r·min-1離心5 min。取上清液5 mL，待凈化。

1.2.2 凈化

用5 mL甲醇和10 mL水活化C18固相萃取柱，取1.2.1項(xiàng)下5 mL上清液通過(guò)預(yù)先活化好的C18固相萃取柱凈化，棄去初始的2 mL凈化液，收集1.5 mL凈化液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶，待測(cè)。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX NH2（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈∶水=70∶30;流速：1.0 mL·min-1;進(jìn)樣體積10 μL;色譜柱溫度：35 ℃。

1.3.2 檢測(cè)器條件

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)漂移管溫度：40 ℃;載氣流速：1.2 mL·min-1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱(chēng)取果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg，用水溶解并定容至10 mL容量瓶中，配成濃度為10 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液。置于4 ℃保存，待用。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取不同體積的1.4項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液置于10 mL容量瓶，用水定容至刻度，搖勻，配制成一系列的混合對(duì)照品溶液。依次按照1.3項(xiàng)下的分析條件進(jìn)行測(cè)定，分別以果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的濃度（mg·mL-1）作為橫坐標(biāo)（X），測(cè)定的峰面積作為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的確定

以食醋樣品為考察對(duì)象，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行探討。由于食醋中含有蛋白質(zhì)、色素、有機(jī)酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，若采用直接稀釋測(cè)定糖類(lèi)成分有較大的干擾，并且容易對(duì)色譜柱造成損害[7]。因此，前期樣品處理將這些雜質(zhì)分離非常重要。

方法一，選擇常用的蛋白質(zhì)沉淀劑亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，根據(jù)文獻(xiàn)中報(bào)道測(cè)定食品中糖含量的前處理方法，先加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅沉降食醋中的蛋白質(zhì)后，再根據(jù)色素、有機(jī)酸物質(zhì)在C18柱上的保留時(shí)間長(zhǎng)，而糖的保留時(shí)間短。將沉淀蛋白后的樣品用SEP-PARK C18固相萃取柱分離[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖類(lèi)物質(zhì)通過(guò)該方法處理后受到抑制。

方法二，則根據(jù)1.2項(xiàng)下樣品前處理方法進(jìn)行，其中稀釋倍數(shù)為4倍，前處理方法考察中發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品用水稀釋2倍時(shí)雜質(zhì)干擾太大，當(dāng)稀釋10倍或50倍時(shí)多數(shù)樣品中糖的檢測(cè)低于檢出限。選擇用4倍稀釋后用SEP-PARK C18固相萃取柱凈化。進(jìn)樣測(cè)定后分析，根據(jù)對(duì)照品圖譜的保留時(shí)間確定食醋樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的組分，出峰時(shí)間分別為8.28、9.26、11.99、14.31 min和16.17 min。對(duì)照品及樣品色譜圖分別見(jiàn)圖1、圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法處理后樣品能較好地去掉干擾雜質(zhì)，并且操作過(guò)程簡(jiǎn)單。因此，該方法確定為本實(shí)驗(yàn)樣品的前處理方法。

2.2 流動(dòng)相的考察

本實(shí)驗(yàn)以乙腈和水為流動(dòng)相，通過(guò)改變乙腈和水的混合比例，確定能分離5種對(duì)照品以及食醋樣品中5種糖的最佳條件。分別考察了85∶15，80∶20，70∶30的等度洗脫條件以及初始流動(dòng)相為80∶20梯度洗脫條件，發(fā)現(xiàn)梯度洗脫條件80∶30時(shí)5種糖的出峰時(shí)間均靠后并且不能完全分開(kāi)。而等度洗脫條件中，以乙腈、水比例為70∶30時(shí)，出峰時(shí)間適合，且樣品中5種糖能與雜質(zhì)很好的分離。因此，最終選擇的最佳流動(dòng)相比例為乙腈∶水=70∶30的等度洗脫條件。

2.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件的考察

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中載氣流量和漂移管溫度是影響化合物的基線噪音和靈敏度的兩個(gè)重要因素。在乙腈∶水為70∶30，流速為1 mL·min-1的色譜條件下，對(duì)5種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)調(diào)整載氣流量分別為1.0、1.3、1.4 L·min-1和漂移管溫度分別為30、40、50、60、70、70 ℃和80 ℃，最終確定靈敏度達(dá)到最高，基線穩(wěn)定時(shí)的最佳條件載氣流速為1.2 mL·min-1，漂移管溫度為40 ℃。

2.4 線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)

在1.3的分析條件下，將配制好的系列對(duì)照品溶液分別測(cè)定并計(jì)算，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。由表1可以看出，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的濃度與峰面積之間的線性關(guān)系均良好，且標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均在0.999以上，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確可信，5種糖的檢測(cè)范圍在0.5～10.0 mg·mL-1。

2.5 方法檢出限

將果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的色譜峰高與基線信號(hào)之比接近3的濃度為最低檢測(cè)濃度。本實(shí)驗(yàn)果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的檢出限分別為15.00、7.00、8.00、10.00 mg·mL-1、和15.00 mg·mL-1。

2.6 精密度考察

將1.4項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋成濃度為10 mg·mL-1的溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，按照1.3項(xiàng)下的分析條件進(jìn)行測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次。計(jì)算果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.7%、2.8%、3.95%、2.9%和3.95%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性考察

取同一種食醋樣品，按照1.2項(xiàng)下前處理方法，儀器重復(fù)測(cè)定6次，記錄峰面積，蔗糖、麥芽糖和乳糖未檢出。計(jì)算果糖、葡萄糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、0.9%，表明該方法測(cè)定還原糖含量重復(fù)性良好。

2.8 回收率考察

取食醋樣品5 mL（在現(xiàn)有定量限下進(jìn)行測(cè)定，未檢出蔗糖、麥芽糖和乳糖）共12份，每6份一組，分別精密加入高、低兩種不同濃度的5種糖混合對(duì)照品溶液，按照1.2項(xiàng)下處理方法處理后，進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2，果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的平均回收率分別為104.03%、103.68%、97.19%、99.49%和99.48%。

注：ND表示含量低于方法檢出限，下同。

2.9 食醋樣品測(cè)定

赤水曬醋是一種受?chē)?guó)家地理標(biāo)志保護(hù)的產(chǎn)品，

1號(hào)和2～4號(hào)食醋樣品分別來(lái)自?xún)蓚€(gè)赤水曬醋企業(yè)，不同生產(chǎn)企業(yè)，生產(chǎn)工藝略有不同[10-11]。利用該方法分別對(duì)兩個(gè)不同企業(yè)的赤水曬醋糖含量進(jìn)行測(cè)定，樣品信息及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，食醋中含糖的成分主要是果糖和葡萄糖，蔗糖和麥芽糖含量較少，4個(gè)樣品中乳糖含量低于檢測(cè)限。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定食醋中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖含量，靈敏度高，基線穩(wěn)定，前處理方法簡(jiǎn)單，回收率大于90%，RSD小于5%，適用于食醋中5種糖類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。測(cè)定和分析兩個(gè)不同企業(yè)的赤水曬醋，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同企業(yè)赤水曬醋含量有較大的差異，且食醋中的糖主要為果糖和葡萄糖。該方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)好，為眾多企業(yè)生產(chǎn)和質(zhì)檢部門(mén)對(duì)食醋中糖含量的檢測(cè)、應(yīng)用和監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

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基金項(xiàng)目：貴州省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技計(jì)劃項(xiàng)目“貴州地理標(biāo)志產(chǎn)品赤水曬醋品質(zhì)特征研究”（編號(hào)：2017kj010）;遵義市優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目“貴州省特色食品質(zhì)量與安全研究及應(yīng)用”（編號(hào)：遵優(yōu)青科[2018]4號(hào)）;貴州省科技計(jì)劃課題“貴州匯川城郊現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)”（編號(hào)：黔科合平臺(tái)人才[2016]5243-02號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介：凌 蕾（1993—），女，碩士，工程師;研究方向?yàn)槭称窓z測(cè)技術(shù)。

通信作者：王 奧（1986—），男，博士，高級(jí)工程師;研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全風(fēng)險(xiǎn)。