□ 徐萬麗 深圳市通量檢測(cè)科技有限公司

1 礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌能力驗(yàn)證遇到的問題和解決方法

2019 年9 月份參加礦泉水中產(chǎn)氣莢膜梭菌能力驗(yàn)證中遇到的問題：濾膜無黑色菌落產(chǎn)生，只有少量灰色和大量白色雜菌生長(zhǎng)。由于大量雜菌存在，導(dǎo)致確證試驗(yàn)中生化現(xiàn)象不明顯，最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有通過。

2019 年12 月份再次參加產(chǎn)氣莢膜梭菌測(cè)量審核，綜合研究GB 4789.13—2012 和GB 8538—2016 及 各方資料[1—2]，制定以下實(shí)驗(yàn)方案。

按照測(cè)量審核作業(yè)指導(dǎo)書，先把凍干粉水化得到的原液，然后進(jìn)行10倍和100 倍稀釋，得到稀釋液，對(duì)原液、稀釋液進(jìn)行檢測(cè)。

方法1，取50 mL 樣液用0.45 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS 平板上，抽濾，做1 個(gè)平板。

方法2，取50 mL 樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS 平板上，抽濾，共2 個(gè)平板。

方法3，取50 mL 樣液用0.22 μm濾膜抽濾，然后將濾膜正貼在SPS 平板上，再覆蓋一層SPS 培養(yǎng)基，抽濾，做1 個(gè)平板。

方法4，取50 mL 樣液用0.22 μm膜抽濾，然后將濾膜反貼在SPS 平板上，即抽濾面朝下，抽濾，做1 個(gè)平板。

方法5，取50mL 樣液用0.22μm膜抽濾，然后將濾膜正貼在TSC 平板上，抽濾，做1 個(gè)平板。

同時(shí)做陰陽性對(duì)照，將以上平板在（36±1）℃下厭氧培養(yǎng)24 h，結(jié)果如表1 所示。

驗(yàn)證試驗(yàn)，挑取各種形態(tài)不同的菌落做生化檢驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：

所有菌落都可以在FTG 旺盛生長(zhǎng)；透明白色的菌落生化指標(biāo)都不符合；灰色和黑色菌落中有部分菌的生化指標(biāo)全部符合，也有部分菌的生化指標(biāo)部分符合，可能是雜菌太多，挑取菌落時(shí)帶有雜菌。

表1 不同實(shí)驗(yàn)方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果報(bào)告：參考實(shí)驗(yàn)中方法2 的灰色菌落（136、146 灰）和方法5 的黑色菌落數(shù)（173 黑）的數(shù)據(jù)，報(bào)了140 CFU/50 mL，通過了驗(yàn)證。

2 結(jié)果分析

從方法1 和方法5 對(duì)比看，用TSC平板貼濾膜更容易長(zhǎng)出黑色菌落，更容易識(shí)別目標(biāo)菌。這是因?yàn)門SC 培養(yǎng)基中檸檬酸鐵銨和亞硫酸鈉的含量比SPS 高，產(chǎn)氣莢膜梭菌可以還原亞硫酸鹽為硫醚，硫醚可以與檸檬酸鐵銨反應(yīng)呈黑色。增加亞硫酸鹽的量和檸檬酸鐵銨的量，可以增強(qiáng)黑色[3]。

方法5 中黑色菌落在空氣中暴露一段時(shí)間，顏色變淺，是因?yàn)楫a(chǎn)氣莢膜梭菌能將亞硫酸鹽還原為硫化物，在含亞硫酸鹽和鐵鹽的瓊脂中形成黑色菌落，遇空氣后被氧化，黑色漸漸變成灰色，所以培養(yǎng)后要盡快計(jì)數(shù)和驗(yàn)證。

從10 倍稀釋液的結(jié)果看，方法1的結(jié)果是16 個(gè)灰色菌落，方法2 平均為18 灰色菌落，結(jié)果相差不大，因此，0.45 μm 的濾膜和022 μm 的濾膜都可以用。

方法3 和方法4 中，覆蓋一層SPS 培養(yǎng)基和濾膜反貼也能長(zhǎng)出黑色菌落。覆蓋一層長(zhǎng)出菌落較少，反貼濾膜不利于后續(xù)挑取菌落。

SPS 和TSC 上都易有較多雜菌生長(zhǎng)（TSC 相對(duì)少點(diǎn)），且FTG 是非選擇性增菌肉湯。所以，雜菌較多時(shí)，可先把可疑菌分離純化到TSC 平板上，再將單菌落接到FTG 中，最后進(jìn)行生化試驗(yàn)。