張俊奇，佟 毅，袁敬偉，劉 輝

（1.中糧生化能源（肇東）有限公司，黑龍江肇東 151100；2.吉林中糧生化有限公司，吉林長春 130033）

我國生物燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展于“十五”初期，經(jīng)歷了初期試點(diǎn)、穩(wěn)步發(fā)展和非糧乙醇發(fā)展階段。截至2018 年，我國生物燃料乙醇年消費(fèi)量近260 萬噸，隨著酒精需求量增加以及國家政策的實施，發(fā)展非糧乙醇成為行業(yè)大趨勢[1]。

據(jù)有關(guān)部門統(tǒng)計，截至2016 年年末，我國水稻年庫存在1.25億噸[2]，水稻庫存量大但不易保存，極易產(chǎn)生米質(zhì)“陳化”和發(fā)霉變質(zhì)[3]。水稻陳化后，不能作為口糧，也不能用于畜牧養(yǎng)殖，必須經(jīng)過特殊加工后方可進(jìn)入動物食物鏈環(huán)節(jié)中[4]。生產(chǎn)燃料乙醇是世界各國處理陳化糧的一個常用的途徑[5-6]，應(yīng)用陳水稻生產(chǎn)燃料乙醇，既能加快庫存水稻流通，減少陳水稻庫存積壓，避免陳化糧產(chǎn)生，從根源上降低陳化水稻流入糧食加工市場風(fēng)險，又能夠緩解燃料乙醇行業(yè)原料緊缺的情況，降低企業(yè)生產(chǎn)成本，提升經(jīng)濟(jì)效益[7-8]。

響應(yīng)面分析法包括試驗設(shè)計、模型建立、模型合理性分析和尋求最優(yōu)解等眾多試驗與統(tǒng)計技術(shù)[9]。能夠有效的優(yōu)化試驗條件，降低實驗頻次，提升效率。因此，本研究采用Minitab 軟件中的Plackett-Burman 設(shè)計法[10]、最陡爬坡路徑法[11]、以及響應(yīng)面分析法（RSM）[12]相結(jié)合，對玉米水稻原料混合發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化研究，為復(fù)合原料或非糧原料生產(chǎn)燃料乙醇提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

試驗材料：糖化酶、淀粉酶（諾維信公司）；安琪超級釀酒高活性酵母（安琪公司）；尿素（取自生產(chǎn)車間）；玉米粉（取自生產(chǎn)車間）；糙米粉（某糧庫提供水稻，脫殼后粉碎，80%過20目篩）。

試劑：濃硫酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、乙醇等色譜標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA公司）。

儀器設(shè)備：50 L 全自動發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備有限公司)；搖床（ZHWY-2112F）；液相色譜（Agilent 1200）；離心機(jī)（3-18K）；分析天平（Mettler,AL204,ML204）；黏度計（NDJ-5S）；水浴鍋（HWS-28）；pH 計（PHSJ-3F）；離心機(jī)（3-18k）；顯微鏡（尼康50I）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶實驗

液化條件：1 L 液化罐，液化體系為800 g，干物質(zhì)濃度為30%，液化溫度85 ℃，加入實驗對應(yīng)的淀粉酶，攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min，液化時間2.5 h。

發(fā)酵條件：1 L 三角瓶，發(fā)酵體系為350 g，酵母添加量為0.1%，溫度32 ℃，加入對應(yīng)輔料，發(fā)酵時間72 h。

1.2.2 發(fā)酵罐中試試驗

發(fā)酵罐體積為50 L,發(fā)酵體系為35 kg；液化攪拌轉(zhuǎn)速140 r/min；發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min；其他條件同1.2.1 中所述。

1.2.3 檢測方法

還原糖的檢測：按GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；干物質(zhì)的檢測：按GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；淀粉、酒精度檢測按照文獻(xiàn)方法操作[13]。

1.3 實驗設(shè)計

（1）Plackett-Burman 設(shè)計法篩選影響淀粉出酒率的顯著性影響因素：Plackett-Burman 設(shè)計法基于非完全平衡塊原理，能夠通過最少實驗次數(shù)評估因素的主效應(yīng)，快速從眾多因素中篩選出最關(guān)鍵的因素以供進(jìn)一步研究[14-15]。本研究將酒精發(fā)酵過程中涉及到的原輔料作為影響因素進(jìn)行全面考察，選擇9 因子及實驗次數(shù)N=12 的實驗設(shè)計，每個因子取高低2 個水平，以C/F/I 作為空項以評估實驗誤差（表1）。

表1 Plackett-Burman 設(shè)計各因素與水平

（2）最陡爬坡路徑法確定重要因子最適范圍：建立有效的響應(yīng)面方程需找出因子最佳值區(qū)域，以最陡爬坡法進(jìn)行實驗，根據(jù)各因素的效應(yīng)值的大小確定步長，能夠快速的逼近最佳區(qū)域[16]。

（3）響應(yīng)面分析法確定最佳工藝配方：以爬坡實驗得出的結(jié)果作為依據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面實驗，進(jìn)行回歸分析與誤差分析，進(jìn)而根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面分析圖，確定最佳工藝條件。

（4）驗證實驗：用所得的最佳工藝條件進(jìn)行3個平行實驗，以驗證模型可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗

Plackett-Burman 實驗設(shè)計見表2，分析結(jié)果見表3。由于原料間淀粉含量存在差異，因此采用淀粉出酒率（以95%vol乙醇計）衡量發(fā)酵效果。從分析結(jié)果可以看出，對混合發(fā)酵工藝淀粉出酒率具有顯著影響的因子依次是E＞H＞B＞A，即玉米粉比例＞糖化酶加量＞淀粉酶加量＞尿素加量，確定這4個因素為下一步實驗的關(guān)鍵因素。

表2 Plackett-Burman 實驗設(shè)計

表3 Plackett-Burman實驗分析結(jié)果

2.2 最陡爬坡實驗

通過表3 數(shù)據(jù)分析，淀粉酶加量、糖化酶加量、尿素加量為正效應(yīng)，應(yīng)依次增大，原料為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)依次減小。爬坡實驗結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，隨著尿素加量、淀粉酶加量、糖化酶加量的逐漸增加，玉米粉比例的逐漸減小，淀粉出酒率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。當(dāng)尿素加量為1.33 kg/t 糧，淀粉酶加量為0.3 kg/t 糧，玉米粉比例為40%，糖化酶加量為1.0 kg/t 糧時，淀粉出酒率達(dá)到最大，為4因子的最大響應(yīng)值區(qū)域，因此以表4中試驗號4 的各因素水平為中心值設(shè)計后續(xù)響應(yīng)面實驗。

表4 最陡爬坡路徑試驗結(jié)果

2.3 響應(yīng)面實驗

以爬坡實驗確定的因子最適濃度為中心點(diǎn)實施響應(yīng)面分析，各自變量見表5，Box-Behnken 實驗設(shè)計見表6，結(jié)果分析見表7。

表5 Box-Behnken 設(shè)計因子及水平

該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=0.9823，說明僅有1.77%的變異不能由此模型解釋；模型p 值=0.001，說明模型是顯著的；失擬項p 值=0.283，說明模型沒有失擬現(xiàn)象。經(jīng)回歸擬合后，得到二次多項式方程：

Y=16.2000+0.05583X1+0.03083X2-0.01500X3+0.09500X4-0.1558X1*X1-0.1433X2*X2-0.0396X3*X3-0.2021X4*X4-0.0075X1*X2-0.0175X1*X3-0.0125X1*X4 +0.0175X2*X3+0.0025X2*X4-0.0100X3*X4。

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面分析圖見圖1。由圖1 可見，當(dāng)固定兩個因子時，另外的兩個因子處在增大過程中，淀粉出酒率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，曲面的頂點(diǎn)即為淀粉出酒率的最大值。

2.4 模型驗證

由模型可得，玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 糧，糖化酶加量1.02 kg/t 糧，尿素加量1.36 kg/t糧時，預(yù)測的最大響應(yīng)值為55.58%。為驗證模型結(jié)果，以此工藝條件進(jìn)行50 L 中試驗證試驗，由于發(fā)酵體系放大后，發(fā)酵過程會出現(xiàn)醪液內(nèi)部壓力、物料流動性、溫度傳導(dǎo)等一系列變化，試驗結(jié)果可能與小試實驗存在一定差異，經(jīng)3 次重復(fù)實驗，結(jié)果分別為55.54%、55.59%、55.51%，平均值為55.55%，與預(yù)測值55.58%接近，證實了模型的有效性。優(yōu)化后的工藝條件為：玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 糧，液化pH5.6，糖化酶加量1.02 kg/t 糧，尿素加量1.36 kg/t 糧，發(fā)酵pH4.6，發(fā)酵時間72 h。

3 結(jié)論

本研究通過Plackett-Burman 實驗設(shè)計，快速有效的從影響酒精發(fā)酵的多個因素中篩選出4 個顯著影響因素：玉米粉比例、淀粉酶加量、糖化酶加量、尿素加量。然后利用最陡爬坡實驗法逼近最大響應(yīng)值區(qū)域并通過Box-Behnken 實驗設(shè)計得出最佳發(fā)酵組合：玉米粉比例38%，淀粉酶加量0.31 kg/t 糧，糖化酶加量1.02 kg/t 糧，尿素加量1.36 kg/t 糧。在最佳發(fā)酵組合條件下，淀粉出酒率可達(dá)55.55%，與由模型計算得出的最大響應(yīng)值55.58%接近，說明通過響應(yīng)面法優(yōu)化玉米水稻混合原料發(fā)酵工藝是合理可靠的。由于實際生產(chǎn)情況較為復(fù)雜，本實驗最佳發(fā)酵組合應(yīng)用于實際生產(chǎn)中還需作進(jìn)一步的生產(chǎn)試驗。

對于玉米水稻混合原料發(fā)酵過程中其他因素如液化溫度、液化時間、發(fā)酵溫度、酒母接種量等，后續(xù)會進(jìn)行深入研究，以進(jìn)一步提升整體發(fā)酵水平。