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(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118 2.長春科技學(xué)院,吉林長春 130600)

黑曲霉(Aspergillusniger)[1]是一類重要的發(fā)酵菌種,最適生長條件一般為33 ℃、相對濕度88%,一般在各類的糧食作物、植物及其相關(guān)產(chǎn)品中分布較廣[2-3],其重要性體現(xiàn)在黑曲霉所產(chǎn)生的酶類及酸類產(chǎn)物,可用于發(fā)酵工業(yè)及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)[4]。糖化酶是黑曲霉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種重要酶,糖化酶也叫做葡萄糖淀粉酶[5],其系統(tǒng)命名法為淀粉α-1,4-葡萄聚糖水解酶[6],由甘露糖、葡萄糖胺、半乳糖等物質(zhì)構(gòu)成的糖蛋白[7],不僅是酸性糖苷酶且具備外切酶活性,水解產(chǎn)物為葡萄糖[8]。糖化酶的最佳酶活力條件一般在50～65 ℃,pH4.0～5.0之間[9]。糖化酶在食品、釀造、輕工紡織業(yè)等都有重要的用途[10]。糖化酶是將麥芽糖糊精水解生成D-葡萄糖,其最大反應(yīng)速度呈線性變化，隨反應(yīng)物的碳鏈結(jié)構(gòu)的不同而改變[11],可作為產(chǎn)淀粉的原料用于谷氨酸、檸檬酸的生產(chǎn)[12]。

各類糖化酶的結(jié)構(gòu)和功能對淀粉水解程度有所不同[13],真菌是各類微生物中水解淀粉能力最強(qiáng)的[14]。目前報道的能夠產(chǎn)糖化酶的菌株主要有[15]:臺灣根霉、雪白根霉、黑曲霉、泡盛曲霉等共26個屬38個種[16]。但目前大多酶制劑來源于被食品藥品管理中心鑒定可安全使用的根霉和曲霉,在我國運用較廣泛的是根霉、黑曲霉及其突變菌[17]。采用電子束輻照誘變黑曲霉菌株產(chǎn)糖化酶具有較強(qiáng)的安全性、成本低、儀器操作簡便、可控性強(qiáng)等特點[18]。

本文以電子束誘變黑曲霉突變菌株為研究對象,通過最適pH、作用溫度、熱穩(wěn)定性試驗、酸堿穩(wěn)定性試驗和金屬離子影響等方面的研究,探明黑曲霉低能電子束誘變突變菌株產(chǎn)糖化酶的酶學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉原始菌株 編號CICC-40099,CICC工業(yè)微生物菌種保藏中心;黑曲霉突變菌株 編號為1712,食品微生物研究室保藏;磷酸、氫二鉀、硫代硫酸鈉、葡萄糖、可溶性淀粉 隴西化工股份有限公司;磷酸氫二鈉、乙酸鈉、3,5-二硝基水楊酸 北京化工廠;氯化鈉、磷酸二氫鉀 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；黑曲霉斜面保藏培養(yǎng)基:可溶性淀粉0.1 g、酵母粉0.3 g、KH2PO40.1 g、瓊脂2 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、豆汁100 mL;察氏液體培養(yǎng)基:NaNO33.0 g、K2HPO4·3H2O 1.0 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.01 g、蔗糖30 g、蒸餾水1000 mL；種子培養(yǎng)基[19]:葡萄糖16 g、胰蛋白胨5 g、KH2PO40.4 g、MgSO4·7H2O 0.04 g、蒸餾水200 mL;發(fā)酵培養(yǎng)基[20]:葡萄糖10 g、玉米淀粉20 g、豆粉6 g、玉米糖漿6 g、K2HPO40.2 g、蒸餾水200 mL。

FE20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CY-1CG離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;752N紫外可見光分光度計 上海儀電分析儀器有限公司;HNY-2102C恒溫培養(yǎng)震蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;Fuhua78-1磁力加熱攪拌器 金壇市富華儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體活化 用接種環(huán)從4 ℃冰箱保藏的一株黑曲霉斜面培養(yǎng)基中刮取一環(huán)菌落于0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)生理鹽水,使菌落分布均勻,以10%培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)接種至察氏液體培養(yǎng)基,每代于32 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)36 h并測定酶活,傳代培養(yǎng)3～5代[21],選擇活力最高者進(jìn)行下步實驗。

1.2.2 菌體發(fā)酵培養(yǎng) 將活化菌液轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中,在32 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)72 h,再將上述菌液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。在250 mL的錐形瓶中,接種量為10%培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)、裝液量為100 mL、32 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min恒溫培養(yǎng)震蕩器中培養(yǎng)發(fā)酵7 d[22]。

1.2.3 粗酶液制備 發(fā)酵液進(jìn)行離心處理,8000 r/min處理15 min,使菌體沉淀后得到上層澄清液，用4層濾紙進(jìn)行過濾除去多余菌絲體,余留下棕色澄清粗酶液后測定其糖化酶活力。

1.2.4 粗酶液的分離純化

1.2.4.1 (NH4)2SO4鹽沉淀 將50 mL 1.2.3的粗酶液用80%(NH4)2SO4鹽沉淀,4 ℃靜置過夜后進(jìn)行12000 r/min,15 min高速離心處理,保留沉淀并用10 mL的0.05 mol/L中性Tris-HCl 緩沖液溶解，并在同條件下進(jìn)行12000 r/min,15 min離心處理,保留上清。

1.2.4.2 Sephadex-100層析 將1.2.4.1的清液注入凝膠色譜柱中,層析條件為上樣體積:5 mL,洗脫液:0.05 mol/L中性Tris-HCl,洗脫流速:0.25 mL/min,各管收集5 mL,752N紫外可見光分光度計測定每管酶活及280 nm下的OD值,OD值(280 nm)與蛋白質(zhì)濃度呈正相關(guān),可表示蛋白含量。并以酶活(kU/mL)、OD值(280 nm)為縱坐標(biāo),以試管編號為橫坐標(biāo),繪制洗脫曲線。

1.2.4.3 蛋白濃度測定及相對分子質(zhì)量檢測 以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn),采用Bradford法測蛋白濃度,進(jìn)一步結(jié)合SDS-PAGE電泳可測定相對分子量[23]。lgMr-m標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-1.109x+5.2239,R2=0.9955。計算公式:lgMr=K-bm。式中:Mr-蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量,1;b、K-常數(shù);m-相對遷移率,1。

1.2.5 糖化酶活力測定 酶活定義為在40 ℃、pH4.6條件下,1 h水解可溶性淀粉生成1 mg葡萄糖所需要的酶量,符號單位為U/mL[24]。測定方法采用DNS比色法[25],每組分別進(jìn)行5組平行試驗取均值。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.6465x+0.001,R2=0.9997。計算公式:X=(A1/A0)×N×b。式中:X-糖化酶活力單位,U/mL;A1-樣品OD值,1;A0-標(biāo)曲OD值,1;N-稀釋倍數(shù);b-(酶活定義用時×所得酶液)/(反應(yīng)用時×所用酶液),1。

1.2.6 突變菌株產(chǎn)糖化酶的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.2.6.1 糖化酶最適pH的確定 在40 ℃溫度下,將5 mL原始菌株及突變菌株酶液分別置于pH為2、2.5～8條件下,與5 mL的2%可溶性淀粉反應(yīng)10 min,測定酶活,確定最適pH區(qū)域，再對該區(qū)域進(jìn)行pH梯度為0.1的最佳pH確定試驗，測定酶活以確定糖化酶最適pH，每組進(jìn)行5組平行試驗取平均值。

1.2.6.2 糖化酶最適作用溫度 在pH4.6,將5 mL原始菌株及突變菌株酶液分別置于溫度為40、45～85 ℃的條件下,與5 mL的2%可溶性淀粉反應(yīng)10 min,測定酶活,確定最適溫度區(qū)域，再對該區(qū)域進(jìn)行溫度梯度為1 ℃的最適溫度確定試驗，測定酶活以確定糖化酶最適作用溫度，每組進(jìn)行5組平行試驗取均值。

1.2.6.3 糖化酶熱穩(wěn)定性試驗 取原始菌株及突變菌株酶液各100 mL,置于溫度為50、55、60、65、70、75、80 ℃的恒溫水浴鍋中進(jìn)行保溫,每10 min取10 mL反應(yīng)液于0 ℃冰浴中冷卻,在40 ℃、pH4.6下測定糖化酶的酶活,每組進(jìn)行5組平行試驗取均值。

1.2.6.4 糖化酶對pH穩(wěn)定性試驗 取原始菌株酶液及突變菌株酶液各50 mL，分別置于pH2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8的緩沖溶液中,40 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h,以殘余糖化酶酶活為指標(biāo)用來研究糖化酶熱穩(wěn)定性。測定糖化酶的酶活力,每組進(jìn)行5組平行試驗取均值[26]。

1.2.6.5 不同金屬離子對糖化酶活力的影響 取原始菌株酶液及突變菌株酶液各50 mL，分別置于50 mL各含K+、Ca2+、Ag+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+及EDTA 的2%可溶性淀粉溶液中,金屬離子濃度梯度為0.5、1.0、1.5 mol/L。每組進(jìn)行5組平行試驗取均值,測定酶活力[27]。對照組不添加金屬鹽并設(shè)該組所測酶活力為100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文圖表數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007及SPSS Statistics 20.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的分離純化

酶的洗脫結(jié)果如圖1。

圖1 Sephadex-100洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Sephadex-100

經(jīng)處理得到兩個明顯的洗脫峰,峰Ⅰ及峰Ⅱ均有糖化酶酶活檢出,最高酶活分別為38.1、45.5 kU/mL。峰Ⅱ有較高的酶活,將該部分真空凍干后可進(jìn)行蛋白濃度測定及相對分子質(zhì)量檢測。

電子束誘變菌株產(chǎn)糖化酶的粗酶液經(jīng)(NH4)2SO4鹽沉淀及Sephadex-100層析,糖化酶蛋純化效果明顯,結(jié)果如表1。

表1 糖化酶純化結(jié)果Table 1 Glucoamylase purification results

經(jīng)SDS-PAGE電泳有一條清晰蛋白帶出現(xiàn)在66.4～97.2 kDa間,如圖2。計算得到其分子質(zhì)量為:69.2 kDa。

圖2 突變菌株糖化酶電泳圖Fig.2 Mutant strains glucoamylase electrophoresis注:1：純化酶液；2：粗酶液；M：Marker。

2.2 糖化酶最適pH

pH對糖化酶活力的影響如圖3所示:pH在4.0～5.0之間糖化酶具有較高酶活力,初步確定最佳酶活力pH在該區(qū)域之間。

圖3 pH對糖化酶酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the glucoamylase activity

糖化酶最適pH的確定,結(jié)果如圖4所示,在pH為4.6時糖化酶活力最佳,確定糖化酶最佳反應(yīng)pH為4.6,較原始菌株提高24%,所測最高酶活為46.6 kU/mL。

圖4 pH對糖化酶酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the glucoamylase activity

2.3 糖化酶最適溫度的確定

在不同溫度下測定原始菌株與突變菌株糖化酶作用于底物的能力,結(jié)果如圖5所示,隨著溫度的上升糖化酶活力也逐步提高,當(dāng)溫度為65 ℃時酶活最佳,且誘變菌株相對原始菌株酶活提高28%,而超過65 ℃后酶活力大幅度下降。原始菌株的最適溫度為60 ℃,而突變菌株的最適溫度有所上升,原因可能與其氨基酸組成有關(guān)。Krohn等[28]的研究表明,酶分子中甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及亮氨酸等疏水性氨基酸數(shù)量的增加有助于提高其熱穩(wěn)定性,并隨酶分子中疏水氨基酸成分改變而不同。關(guān)于突變菌株的氨基酸組成對其糖化酶熱穩(wěn)定性的影響有待進(jìn)行下一步實驗。

糖化酶最適作用溫度的確定,結(jié)果如圖6所示,突變菌株糖化酶最高酶活力出現(xiàn)在作用溫度為63 ℃時,因此確定突變菌株糖化酶最佳作用溫度為63 ℃。原始菌株最佳作用溫度為60 ℃,突變菌株糖化酶最高酶活較原始菌株提高26%,所測突變菌株糖化酶最高酶活為48.2 kU/mL。

圖6 溫度對糖化酶酶活力的影響Fig.6 Effect of temperature on the glucoamylase activity

2.4 糖化酶熱穩(wěn)定性

糖化酶熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示,原始菌株產(chǎn)糖化酶在50～60 ℃條件下保溫30 min后出現(xiàn)不同程度的損失,突變菌株糖化酶在50～60 ℃條件下保溫1 h后酶活基本沒有損失,穩(wěn)定性很好;65 ℃條件下反應(yīng)1 h,原始菌株產(chǎn)糖化酶活力為22.1 kU/mL,在同條件下突變菌株糖化酶酶活力仍可達(dá)到35.7 kU/mL,酶活保持穩(wěn)定;70 ℃條件下反應(yīng)30 min后,原始菌株產(chǎn)糖化酶活力為24.8 kU/mL,突變菌株產(chǎn)糖化酶活力仍有32 kU/mL保留;但溫度超過75 ℃后兩種酶液酶活力大量損失;在80 ℃條件下保溫1 h原始菌株所產(chǎn)糖化酶失活,突變菌株產(chǎn)糖化酶仍有8.4 kU/mL酶活剩余。由試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)電子束誘變的突變菌株所產(chǎn)糖化酶具備較好的熱穩(wěn)定性。

圖7 不同溫度下糖化酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of glucoamylase at different temperatures

2.5 糖化酶對pH穩(wěn)定性試驗

經(jīng)電子束誘變的突變菌株糖化酶的pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖8所示。該酶在pH4.5時，酶活出現(xiàn)最高值,且原始菌株最高酶活為突變菌株最高酶活的86%;當(dāng)pH>7.0時,酶活力嚴(yán)重降低(均小于其最高值的一半)，但突變菌株的酶活較高;當(dāng)pH=8時,原始菌株所產(chǎn)糖化酶失活,突變菌株所產(chǎn)糖化酶仍有6.9 kU/mL酶活檢出。說經(jīng)電子束誘變的突變菌株糖化酶pH穩(wěn)定性有著較明顯的提升。

圖8 pH對糖化酶穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of pH on the stability of thermophilum glucoamylase

2.6 不同金屬離子對糖化酶活力的影響

在反應(yīng)體系濃度分別為0.5、1、1.5 mol/L的K+、Ca2+、Ag+、Fe2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+及 EDTA 對糖化酶活力的影響結(jié)果如表2。

表2 金屬離子對糖化酶活力的影響Table 2 Effect of different metal ions on the glucoamylase activity

反應(yīng)體系中加入終濃度為0.5 mol/L的金屬離子后,K+、Ca2+對糖化酶活力的促進(jìn)效果均在7%以上,其中促進(jìn)效果最明顯的為Ca2+,此時原始菌株所產(chǎn)糖化酶相對糖化酶活為118%;Ag+、Fe2+、Cu2+對糖化酶活力的影響均表現(xiàn)為抑制作用,最明顯的是Ag+對原始菌株所產(chǎn)糖化酶的抑制效果,在該條件下糖化酶的相對酶活為55%;Mg2+、Zn2+、EDTA對糖化酶活力的影響不明顯。在終濃度為1.0 mol/L的金屬離子中,K+、Mg2+、Ca2+對糖化酶活力影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用,其中Ca2+對突變菌株所產(chǎn)糖化酶的影響最明顯,此時相對酶活為122%;Ag+、Fe2+、Zn2+、Cu2+則抑制糖化酶活力,Ag+抑制效果最明顯,此時原始菌株及突變菌株所產(chǎn)糖化酶相對酶活分別為42%和37%,EDTA對糖化酶的活力影響較小。在終濃度為1.5 mol/L的金屬離子中,K+、Mg2+、Ca2+對糖化酶活力影響表現(xiàn)為促進(jìn)作用,促進(jìn)效果最明顯的為Ca2+,此時原始菌株及突變菌株所產(chǎn)糖化酶相對酶活分別為112%和117%;抑制效果最明顯的是Ag+,此時原始菌株及突變菌株所產(chǎn)糖化酶相對酶活分別為47%和45%;Zn2+、EDTA對糖化酶的活力影響較小。

綜上實驗結(jié)果表明,在反應(yīng)體系中加入終濃度為0.5、1.0、1.5 mol/L的金屬離子后,K+、Mg2+、Ca2+在一定程度上促進(jìn)了糖化酶活力的表現(xiàn);Ag+、Fe2+、Cu2+則抑制糖化酶活力;Zn2+、EDTA對糖化酶的活力影響較小。

3 結(jié)論

電子束輻照黑曲霉突變菌株產(chǎn)糖化酶分離純化效果明顯,分子量為69.2 kDa。突變菌株糖化酶最適pH為4.6,且最高酶活為46.6 kU/mL,較原始菌株提高24%;在pH超過8.0后,原始菌株所產(chǎn)糖化酶失活時，突變菌株所產(chǎn)糖化酶仍有6.9 kU/mL酶活剩余,突變菌株糖化酶的pH穩(wěn)定性有著明顯提高。突變菌株產(chǎn)糖化酶最適作用溫度為63 ℃,原始菌株為60 ℃,突變菌株產(chǎn)糖化酶最高酶活為48.2 kU/mL,較原始菌株產(chǎn)糖化酶提高26%,在80 ℃條件下保溫1 h,原始菌株產(chǎn)糖化酶失活時突變菌株產(chǎn)糖化酶仍有8.4 kU/mL酶活剩余,突變菌株所產(chǎn)的糖化酶具有較高的熱穩(wěn)定性。不同金屬離子對經(jīng)電子束誘變的突變菌株糖化酶活力存在不同的影響,在各金屬離子濃度為0.5、1、1.5 mol/L時K+、Mg2+、Ca2+均在一定程度上增強(qiáng)其酶活力;Ag+、Fe2+、Cu2+則抑制了糖化酶活力;Zn2+、EDTA對其活力影響較小或無明顯現(xiàn)象。