陳夢玲，藍(lán)蔚青*，李函笑，任智楚，蘆子萱，謝 晶*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

牛至（Origanum vulgare）為唇形科多年生草本植物，其在地中海地區(qū)、北非、北美與亞洲均有分布，全草可提精油[1]。牛至精油為一種淡黃色透明液體，其含有30多種化合物，主要活性成分為酚類物質(zhì)與萜烯類物質(zhì)[2]。這些活性成分的表面活性與脂溶性較強(qiáng)，使其易透過細(xì)胞膜對菌體造成損傷，從而抑制菌體生長或?qū)⑵錃⑺繹3]。近年來，關(guān)于牛至精油在水產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用研究也逐見報道。如杜云飛等[3]將牛至精油作為抗菌劑，分別加入至乙烯-乙烯醇共聚物和聚乙烯，通過擠出流延制備成2 種食品保鮮膜，發(fā)現(xiàn)使用添加過牛至精油的保鮮膜包裝黑魚片，其脂質(zhì)氧化速率降低，微生物生長受抑制。鄭宗林等[4]將牛至精油添加至紅羅非魚飼料中，經(jīng)過20 周的養(yǎng)殖發(fā)現(xiàn)，添加牛至精油飼料能使冷藏魚片中腸桿菌和大腸菌群數(shù)顯著降低，且貨架期較對照組延長2 d；van Haute等[5]也報道牛至精油處理可使三文魚的冷藏貨架期顯著延長，且能明顯抑制大腸桿菌與乳酸菌生長。

水產(chǎn)品在流通期間，其鮮度與品質(zhì)極易下降，微生物是導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主因?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在腐敗過程中，只有極少種類的特定腐敗菌參與這一過程并產(chǎn)生不可接受異味[6]。這些適合生存、繁殖并產(chǎn)生腐敗臭味代謝產(chǎn)物的菌群則為該產(chǎn)品的特定腐敗菌[7]。因此，如何延緩水產(chǎn)品品質(zhì)劣變、延長其貯藏貨架期、抑制由于微生物繁殖而引起的腐敗變質(zhì)，現(xiàn)已成為科研工作者普遍關(guān)注的熱點。腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）作為水產(chǎn)品的特定腐敗菌，為葡萄球菌屬非致病性革蘭氏陽性菌。本課題組前期通過生理生化鑒定腐敗鯧魚中的優(yōu)勢腐敗菌為腐生葡萄球菌[8]，其在肉制品貯藏過程中會分泌蛋白酶和脂酶，使脂肪分解、蛋白質(zhì)水解，產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，影響產(chǎn)品品質(zhì)[9]。傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑在使用過程中會產(chǎn)生一定副作用，甚至癌變，對人體造成不可逆損害，這也促使安全可靠的天然生物防腐劑得到更大程度利用[10]。牛至精油的廣譜抑菌性與不易產(chǎn)生耐藥性的特點，使其在食品工業(yè)領(lǐng)域具有很好的開發(fā)利用前景，而其對菌體作用機(jī)制的研究更會為牛至精油的后期應(yīng)用提供依據(jù)[11-12]。其中，王倩等[13]研究了銀杏葉提取液對腐生葡萄球菌的作用機(jī)制，結(jié)果表明腐生葡萄球菌經(jīng)銀杏葉提取液處理6 h后，菌體變形且胞間黏結(jié)，其主要通過對菌體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的破壞實現(xiàn)其抑菌效果。本實驗采用瓊脂平板打孔法通過抑菌圈直徑確定牛至精油對腐生葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），由微生物生長曲線、電導(dǎo)率、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、紫外物質(zhì)吸收與掃描電子顯微鏡觀察來綜合評價牛至精油對腐生葡萄球菌的抑制作用機(jī)制，以期為牛至精油作為生物保鮮劑應(yīng)用于水產(chǎn)品保鮮領(lǐng)域提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

腐生葡萄球菌（Saprophytic staphylococcus）為課題組前期從腐敗鯧魚中分離、篩選并鑒定后保存的菌株。

牛至精油（產(chǎn)地：摩洛哥；提取部位：植株；生產(chǎn)工藝：蒸餾法；主要成分為香芹酚（39.45%）、對傘花烴（21.05%）、百里香酚（14.55%））購于上海雅琪實業(yè)有限公司，使用前置于陰涼干燥處存放。

AKP測試盒、LDH測試盒 南京建成生物工程研究所；胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptic soy agar，TSA）培養(yǎng)基、氯化鈉、無水乙醇、戊二醛（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5810R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；BCD-256KF型冰箱 青島海爾股份有限公司；ZQZY-70B型振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；LS-3750型滅菌鍋 日本SANYO公司；Synergy2型自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；DDB-11A型電導(dǎo)率儀杭州齊威儀器有限公司； Mira 3型掃描電子顯微鏡捷克Tescan公司；M334712型全自動微生長曲線分析儀芬蘭Bioscreen公司；UV-2450型紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

將牛至精油以體積分?jǐn)?shù)25%乙醇溶液為溶劑混合配制成不同體積分?jǐn)?shù)備用。腐生葡萄球菌菌種在TSB液體培養(yǎng)基中活化2～3 代后，吸取100 μL菌液涂布在TSA固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)平板劃線。挑取活化后的腐生葡萄球菌單菌落在TSB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)8 h，用滅菌生理鹽水將其配制成含菌數(shù)106～107CFU/mL菌懸液備用。

1.3.2 MIC的測定

MIC的測定參考Dutra等[14]的方法，并稍作修改。采用打孔法測定抑菌圈直徑，從而得到牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC。吸取100 μL對數(shù)期菌懸液均勻的涂布于TSA固體培養(yǎng)基表面，并在平板中央進(jìn)行打孔，采用二倍稀釋法分別吸取8%（體積分?jǐn)?shù)，下同）、4%、2%、1%、0.5%、0.25%牛至精油100 μL加入孔內(nèi)；用不添加牛至精油菌液作為空白組，以25%乙醇溶液為對照組。將各組置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每個實驗做3 個平行，按抑菌直徑大小劃分相對敏感度[15]。參考蘇萌萌等[16]的方法測定牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC（其中MIC值為明顯抑制腐生葡萄球菌生長的最低體積分?jǐn)?shù)）。

1.3.3 微生物生長曲線的測定

采用Diao Mingming等[17]的方法，并稍作修改。取對數(shù)期菌液，按1%接種量分別加入MIC與2 MIC牛至精油至無菌TSB培養(yǎng)基中，置于37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，由全自動微生物生長曲線分析儀每隔1 h自動取樣測定OD600nm值，以不添加牛至精油的菌液作為空白組，以添加25%乙醇溶液的培養(yǎng)液為對照；以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制腐生葡萄球菌在不同條件下的微生物生長曲線。

1.3.4 電導(dǎo)率的測定

參考Yan Feilong等[18]的方法，并稍作修改，分別將MIC與2 MIC的牛至精油添加至1%接種量的TSB實驗菌液中，置于搖床37 ℃、150 r/min培養(yǎng)。分別于0、2、4、6、8、10、12 h取培養(yǎng)液測定其電導(dǎo)率，以此來確定菌體金屬離子的泄漏情況。以不添加精油的培養(yǎng)液作為空白組，以添加25%乙醇溶液作為對照組。每組樣品設(shè)3 個平行。

1.3.5 AKP活力的測定

腐生葡萄球菌按1%接種量在含有MIC與2 MIC牛至精油的TSB培養(yǎng)液中接種，置于搖床37 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h，分別于0、2、4、6、8、10、12 h取樣2 mL，置于離心機(jī)中4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液，按AKP測試盒說明書的方法測定胞外AKP活力。以不添加精油組作為空白，添加25%乙醇溶液作為對照組，每組實驗設(shè)3 個平行。

1.3.6 牛至精油對腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

1.3.6.1 紫外吸收物質(zhì)的泄漏情況測定

參考Chen等[19]的方法測定牛至精油對腐生葡萄球菌紫外吸收物質(zhì)的影響。將牛至精油分別加入待測菌株培養(yǎng)液中，使其終濃度為MIC與2 MIC，再將其置于37 ℃、150 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10 h取樣，再4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液通過紫外分光光度計測定菌體上清液在260 nm波長處的吸光度，每組實驗設(shè)3 個平行。

1.3.6.2 LDH活力的測定

LDH在細(xì)胞質(zhì)中存在并參與細(xì)胞的糖酵解途徑，在細(xì)胞膜受損時會泄漏至胞外[20]。將牛至精油分別加入待測菌株培養(yǎng)液中，使其終濃度為MIC與2 MIC。置于搖床37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、6 h取樣，4 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液并按照LDH測試盒的方法進(jìn)行測定。以未經(jīng)精油處理的菌株培養(yǎng)液為空白，25%乙醇溶液替代等體積的精油作為對照組，每組實驗設(shè)3 個平行。

1.3.7 菌體微觀結(jié)構(gòu)的測定

參考Xu Jianguo等[21]的方法測定牛至精油處理后菌體的微觀結(jié)構(gòu)。取對數(shù)期菌種按1%接種量接種于含MIC、2 MIC牛至精油TSB溶液中培養(yǎng)，以不添加牛至精油的TSB培養(yǎng)液作為空白組，于搖床37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6 h后，取一定量的菌液于4 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄去上清液，菌體用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，并用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液于4 ℃冰箱中固定4 h，將樣品分別用不同體積分?jǐn)?shù)（30%、50%、70%、90%、100%）乙醇梯度脫水后，置于－80 ℃冰箱冷凍保存4～8 h，冷凍干燥機(jī)干燥24 h后涂至金屬箔片并固定噴金，置于掃描電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

由SPSS 13.0軟件進(jìn)行平均值與方差分析，實驗數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Origin 8.5軟件繪制曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC

表1 牛至精油對腐生葡萄球菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of OEO on Saprophytic staphylococcus

由表1可知，隨著牛至精油體積分?jǐn)?shù)的增加，其對腐生葡萄球菌作用效果也愈明顯。當(dāng)牛至精油的體積分?jǐn)?shù)為8%時，表現(xiàn)為極敏感；牛至精油的體積分?jǐn)?shù)為0.25%時，表現(xiàn)為低敏感；而25%乙醇溶液對腐生葡萄球菌無抑制作用，表明25%乙醇溶液對牛至精油的抑菌效果不產(chǎn)生影響。低敏感時牛至精油的最小體積分?jǐn)?shù)為0.25%，因此，牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC為0.25%。

2.2 牛至精油對腐生葡萄球菌生長的影響

圖1 牛至精油處理對腐生葡萄球菌生長曲線的影響Fig. 1 Effect of OEO on the growth curve of Staphylococcus saprophyticus

由圖1可以看出，空白組與對照組菌株保持S型曲線正常生長，培養(yǎng)2 h后進(jìn)入對數(shù)期，在10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，可見25%乙醇溶液對腐生葡萄球菌的生長無抑制作用。而經(jīng)MIC牛至精油處理后，腐生葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)期生長時間延至4 h；2 MIC牛至精油處理后，菌體進(jìn)入對數(shù)期延至10 h，說明牛至精油處理可延緩腐生葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)期，達(dá)到其抑菌目的。Park等[22]研究發(fā)現(xiàn)，月桂酸處理能抑制金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)期；藍(lán)蔚青等[23]在研究復(fù)合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果時也得到類似結(jié)論。

2.3 牛至精油對腐生葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率的影響

圖2 牛至精油處理對腐生葡萄球菌電導(dǎo)率的影響Fig. 2 Effect of OEO on electric conductivity of Staphylococcus saprophyticus

細(xì)胞膜對菌體的正常生長具有保護(hù)作用，當(dāng)菌體在受到抑菌物質(zhì)的傷害或在不良環(huán)境下生長時，細(xì)胞膜滲透性會有所改變，且電解質(zhì)會滲漏到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率增加[24]。由圖2可知，經(jīng)過牛至精油處理的菌液的電導(dǎo)率顯著高于空白和對照組，且牛至精油的體積分?jǐn)?shù)與電導(dǎo)率呈正相關(guān)。由此可知，牛至精油對腐生葡萄球菌的作用呈劑量依賴性，這與生長曲線的結(jié)果一致，可能由于菌體經(jīng)牛至精油處理后，其細(xì)胞膜的通透性有所增加，使菌體內(nèi)電解質(zhì)如K+、Ca2+泄漏至胞外，這與李婷等[25]的研究結(jié)果相似。

2.4 牛至精油處理對腐生葡萄球菌胞外AKP活力的影響

細(xì)胞壁可有效防止外來物質(zhì)如抗生素、抑菌劑等進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，AKP存在于細(xì)胞膜與細(xì)胞壁間，對生物體內(nèi)物質(zhì)代謝起著重要作用，因此其活力是反映細(xì)胞壁完整度的重要指標(biāo)之一。當(dāng)菌體正常生長時，AKP活力無法在胞外檢出，反之亦然。因此，可通過檢測細(xì)胞外AKP的活力來判斷菌體細(xì)胞壁的完整性與通透性[26]。

如圖3所示，牛至精油處理后腐生葡萄球菌胞外的AKP活力明顯上升，且在2 h后對照組的AKP活力穩(wěn)定，而處理組樣品的AKP活力顯著高于對照組。在經(jīng)牛至精油處理4 h后，MIC與2 MIC牛至精油處理組的AKP活力分別為0.85 U/L與1.09 U/L，這同電導(dǎo)率、生長曲線的測定結(jié)果相一致，進(jìn)一步反映牛至精油可使菌體的細(xì)胞壁完整性遭到破壞。Hu Wei等[27]研究發(fā)現(xiàn)山蒼子精油對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁也起到破壞作用，可使菌液AKP活力顯著提升。

2.5 牛至精油對腐生葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響

2.5.1 紫外吸收物質(zhì)的泄漏情況

細(xì)菌細(xì)胞膜的功能包括滲透屏障、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量代謝，其正常的結(jié)構(gòu)與功能是細(xì)菌正常生長的基本前提[28]。菌體內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)類物質(zhì)在260 nm波長處有強(qiáng)吸收峰，通過培養(yǎng)液中此類物質(zhì)在260 nm波長處吸收峰的強(qiáng)弱可判定菌體細(xì)胞膜的通透性[29]。

圖4 牛至精油處理對腐生葡萄球菌膜通透性的影響Fig. 4 Effect of OEO on the membrance permeability of Staphylococcus saprophyticus

從圖4可看出，隨著處理時間的延長，處理組培養(yǎng)液在260 nm波長處的吸光度逐漸上升，且2 MIC牛至精油處理組的吸光度顯著高于MIC處理組，表明牛至精油體積分?jǐn)?shù)越高，其對細(xì)胞膜的破壞越嚴(yán)重；而未經(jīng)牛至精油處理的空白組與25%乙醇溶液處理組的吸光度無明顯變化?？赡苡捎诟咸亚蚓?jīng)精油處理后，其菌體的細(xì)胞膜完整性被破壞，核酸、蛋白質(zhì)等大分子由于菌體細(xì)胞膜通透性的增加而滲透到胞外。張赟彬等[30]研究肉桂精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的作用機(jī)制時也發(fā)現(xiàn)，隨著精油濃度的升高，菌體內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)類物質(zhì)的泄漏增加；Wang Yue等[31]研究肉桂皮精油對牙齦卟啉單胞菌的抑菌效果時也得到相似結(jié)論。

2.5.2 胞外LDH活力

圖5 牛至精油處理對腐生葡萄球菌胞外LDH活力影響Fig. 5 Effect of OEO on extracellular LDH activity of Staphylococcus saprophyticus

LDH參與細(xì)胞的糖酵解途徑，其存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時會泄漏至胞外[32]。從圖5可以看出，當(dāng)腐生葡萄球菌經(jīng)過精油處理6 h后，MIC、2 MIC處理組培養(yǎng)液中的LDH活力分別從0 h的2.91、3.67 U/g升至6 h的17.59、18.67 U/g。而空白和對照組明顯低于牛至精油處理組，反映出牛至精油對菌體細(xì)胞膜的損傷作用，其能使菌體內(nèi)核酸等生物大分子外泄，營養(yǎng)物質(zhì)喪失，從而達(dá)到抑菌與殺菌的目的，本結(jié)果與紫外吸收結(jié)果一致。

2.6 微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

圖6 腐生葡萄球菌經(jīng)牛至精油處理6 h后掃描電子顯微鏡圖Fig. 6 SEM graphs of Staphylococcus saprophyticus after treatment with OEO for 6 h

由圖6可知，空白組的腐生葡萄球菌外觀光滑、平整飽滿。而經(jīng)牛至精油處理后，菌體外觀形態(tài)變粗糙，有凹痕存在，尤其在菌體兩端較為明顯；經(jīng)過MIC牛至精油處理后，菌體出現(xiàn)胞膜破裂、凹陷現(xiàn)象，部分菌體畸形，細(xì)胞壁膜褶皺，有裂紋，甚至剝落；而經(jīng)2 MIC牛至精油處理后，菌體大量胞膜剝落，且破裂畸形，細(xì)胞受損嚴(yán)重。說明牛至精油對菌體結(jié)構(gòu)的破壞程度與其體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)，可能由于牛至精油是一類脂溶性物質(zhì)，其通過結(jié)合細(xì)胞膜在膜內(nèi)形成孔道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時與胞內(nèi)活性物質(zhì)相互作用，而對菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，導(dǎo)致其死亡。Silva等[33]發(fā)現(xiàn)茶樹精油對單增李斯特菌的細(xì)胞形態(tài)也產(chǎn)生類似損害；Dutra等[34]得出牛至精油能對脂環(huán)酸芽孢桿菌造成破壞而達(dá)到抑菌目的；Bhargava等[35]發(fā)現(xiàn)牛至精油能對大腸桿菌與鼠傷寒桿菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成破壞，使其細(xì)胞膜破裂而達(dá)到抑菌目的。

3 結(jié) 論

綠色、健康、純天然的食品添加劑已成為當(dāng)今時代的主流，而牛至精油作為一種植物天然提取物，因其良好的抗氧化性、獨特風(fēng)味與較強(qiáng)抑菌性逐漸成為新型食品防腐劑的首選對象。本研究得出牛至精油對腐生葡萄球菌的MIC為0.25%，且經(jīng)牛至精油處理后的菌體細(xì)胞內(nèi)容物大量外泄至胞外，說明牛至精油會使菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的通透性與完整性遭到破壞，由于牛至精油的脂溶性特點，也使其更好地與菌體細(xì)胞膜表面結(jié)合，能在胞膜內(nèi)形成孔道，使其中的疏水性活性物質(zhì)與菌體內(nèi)的活性物質(zhì)相互結(jié)合，影響細(xì)胞的正常代謝，從而抑制其生長；牛至精油對菌體結(jié)構(gòu)的破壞程度與其體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。牛至精油對菌體遺傳物質(zhì)影響與菌體蛋白質(zhì)組學(xué)表達(dá)仍需深入研究。本研究為牛至精油作為食品工業(yè)新型抑菌劑提供了理論參考。