趙 蕊,姚鑫淼,周 野,管立軍,張英蕾,李哲濱,沈卉芳,崔怡娟,盧淑雯*
(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院食品加工研究所,黑龍江 哈爾濱 150086)
糖尿病是一種危害性很大的代謝類疾病,其特征是由于體內(nèi)無法分泌胰島素(I型糖尿?。┗虺霈F(xiàn)胰島素抗性(II型糖尿?。┒斐裳钦{(diào)節(jié)異常。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會在2015年估測,世界范圍內(nèi)約有8.8%的成人(20~79 歲)患有糖尿病,預計到2050年,世界人口的10.4%將罹患糖尿病[1]。II型糖尿病是發(fā)病率最高的糖尿病類型,約占發(fā)病人數(shù)的91%[1]。治療II型糖尿病需要提高體內(nèi)胰島素的水平,直接注射胰島素或通過藥劑提高胰島素的分泌、改善胰島素敏感性、延緩腸道對碳水化合物的吸收和/或提高對葡萄糖的排除等方式都可以達到有效治療II型糖尿病的目的[2]。DPP-IV抑制劑是一種胰島素分泌促進劑,通過抑制DPP-IV對腸促胰島素胰高血糖素樣肽-1和葡萄糖抑制多肽的降解,從而提高餐后胰島素的水平[3]。然而,人工合成的DPP-IV抑制劑常會引發(fā)比較嚴重的副反應,如頭疼、腹瀉、尿路感染、上呼吸道感染、蕁麻疹等,還會增加腎臟的負擔[4]。
有研究報道攝食特定的食物或食物成分與糖尿病發(fā)病率之間存在一定的相關性[5-6],膳食可對II型糖尿病的防治起到重要的作用,機制之一就是食物組分具備抑制DPP-IV的能力。食物蛋白經(jīng)過胃腸道消化、體外酶解或特定的食品加工可釋放出肽片段,研究證實某些肽片段具有抑制DPP-IV的功能。與傳統(tǒng)的藥物相比,由食源蛋白制備的DPP-IV抑制劑的毒性和副作用都很小[7]。膳食組分可能用作功能食品的配料以輔助調(diào)節(jié)血糖,這一發(fā)現(xiàn)在學術界備受關注,食源DPP-IV抑制肽的制備和鑒定成為研究熱點。
本綜述首先探討食源DPP-IV抑制肽的獲得方式、研究流程、分子描述和抑制機制;然后評定生物信息學方法在DPP-IV抑制肽領域的應用及其局限性;最后,針對DPP-IV抑制肽最終要應用于人體所需要的進一步研究提出展望。
酶解、發(fā)酵和特定的食品加工都可以產(chǎn)生DPP-IV抑制肽。盡管有報道稱完整的蛋白經(jīng)消化道消化后可能有DPP-IV抑制肽生成[8],但由于食物組分的復雜性使蛋白在消化過程中不能按照最優(yōu)方式釋放出DPP-IV抑制肽,且消化得到的DPP-IV抑制肽可能在胃腸道條件下不穩(wěn)定或無法穿越消化道屏障,導致其生物可利用性低[9]。因此,有必要針對性地水解食物蛋白制備DPP-IV抑制肽,以便于其更好地在體內(nèi)發(fā)揮作用。酶解是制備DPP-IV抑制肽的最常用方法,目前大多數(shù)DPP-IV抑制肽都是用特定的蛋白酶水解食物蛋白制備而成的[10]。與其他的方法相比,酶解有環(huán)保、高效、可控的優(yōu)勢,通過控制酶解的條件,可以使DPP-IV抑制肽的制備達到最優(yōu)效果。
此外,微生物發(fā)酵或特定的食品加工也可以獲得DPP-IV抑制肽。發(fā)酵制品納豆具有明顯的DPP-IV抑制活性,納豆中分離到的Lys-Leu有很強的抑制DPP-IV活性的潛能(半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)值達(41.40±2.68)μg/mL)[11]。某些乳桿菌在生長過程中會分泌出抑制DPP-IV活性的物質,將分泌性上清液經(jīng)過胰蛋白酶處理后,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示某些蛋白發(fā)生降解,其DPP-IV抑制能力也顯著增強,說明乳桿菌分泌的DPP-IV抑制組分是肽[12]。西班牙干腌火腿在制作過程中沒有使用蛋白酶,但在其水溶性提取物中也檢測到DPP-IV抑制活性,IC50值達0.69 mg/mL,這可能是內(nèi)源蛋白酶作用的結果[13]。
有關DPP-IV抑制肽的研究一般按照以下流程進行[9-10]:1)選擇合適的蛋白底物和酶;2)對蛋白進行酶解;3)體外活性分析;4)富集/分離;5)DPP-IV抑制肽的鑒定;6)用合成的肽驗證其DPP-IV抑制效能;7)闡述其抑制機制;8)細胞及動物實驗的驗證。
多種食物都可以作為制備DPP-IV抑制肽的原料來源。乳是研究最為廣泛的蛋白質來源,體外研究表明,牛乳酪蛋白、牛乳乳清蛋白、牦牛乳、駱駝乳等經(jīng)酶解后的水解物具有抑制DPP-IV的活性[1,3,9,15-16]。魚和哺乳動物皮膚中的明膠富含脯氨酸(Pro),其水解物有DPP-IV抑制活性[17-19]。此外,豆類、藜麥、燕麥、莧菜、麻等植物也是很好的制備DPP-IV抑制肽的蛋白質來源[20-23]。
多種蛋白酶都可用來從膳食蛋白中制備DPP-IV抑制肽,包括動物來源(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)、植物來源(如木瓜蛋白酶)及微生物來源的酶(如堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味酶、嗜熱菌蛋白酶)。選擇蛋白酶時需要考慮到酶的主要活性或文獻中關于該酶釋放出特定生物活性肽潛能的報道。通常情況下,使用一種蛋白酶即可有效地釋放出DPP-IV抑制肽,然而單一種類蛋白酶的水解程度通常比較低。由于肽的生物活性依賴于肽的大小、氨基酸組成,因此水解度與水解物的功能性密切相關[24]。使用雙酶解會一定程度上提高水解度,但要避免過度水解導致釋放出不具備生物活性的肽[7]。在確定水解底物和蛋白酶后,需要考慮影響酶解的條件(pH值、溫度、時間、酶的添加量、蛋白底物的含量等),應用實驗設計和響應面法對水解條件進行優(yōu)化。
體外評估DPP-IV抑制活性的方法主要有兩種,一是熒光法,其原理是DPP-IV從多肽的N端裂解釋放出有熒光性的X-Pro二肽,利用熒光酶標儀測定加入/不加入樣品體系的吸光度(λex=360 nm/λem=460 nm),可以計算出水解物對DPP-IV的抑制程度;另一種方法的原理是DPP-IV水解生色底物Gly-Pro-pNA,在405 nm波長處可以對產(chǎn)物進行定量。同樣,通過比較加入受試樣品之后體系吸光度的變化,計算出水解物對DPP-IV的抑制程度。DPP-IV抑制肽抑制活性如表1所示。
表1 有體外DPP-IV抑制活性的食源蛋白水解物的IC50Table 1 Half maximal inhibitory concentration (IC50) of food proteinderived hydrolysates with DPP-IV inhibitory activity
然而某些實驗條件可以影響到體外抑制活性的測定結果,如試劑的濃度——包括酶、底物、水解物的濃度等,都會對實驗結果帶來影響。此外,試劑的純度、來源、反應體系pH值以及溫度也對結果有影響[10]。因此不同實驗條件下測定的DPP-IV抑制活性之間缺少可比性,此外,表征抑制潛能的IC50值也依賴于測定條件。據(jù)報道,當反應體系中的血管緊張素轉化酶從155 U/L增加至221.15 U/L時,陽性對照物甲巰丙脯酸的表觀IC50值從9.10 nmol/L升至39.40 nmol/L,用乳清蛋白水解物進行的實驗也得到相似的結果[10]。因此有必要將測定方法進行標準化,以便于不同研究結果之間進行比較。
蛋白質經(jīng)酶解后,反應體系中含有大量不同長度、不同序列的肽及游離氨基酸,對水解物進行分離可以減少體系組成的復雜性,便于后續(xù)肽的鑒定。依據(jù)不同肽在分子質量、疏水性或電荷上的差異,可以對蛋白水解物進行分級分離,比如超濾、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)等。分級分離的過程可對有效成分進行富集,除去活性低的組分,同時降低復雜體系中由于肽-肽之間疏水/靜電相互作用對整體活性的不利影響[10,31]。
測定分級分離獲得的各個組分的DPP-IV抑制活性,選取抑制活性最高的組分進行肽的鑒定。一般采用前端分離技術與質譜聯(lián)合的方法,如HPLC-質譜(mass spectrometry,MS)、HPLC-串聯(lián)質譜(tandem mass spectrometry,MS/MS)、基質輔助激光解吸電離飛行時間(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight,MALDI-TOF)MS、帶有電噴霧電離(electrospray ionization,ESI)的四極桿-飛行時間(quadrupole time-of-flight,QTOF)-MS[9,32]。大多數(shù)MS對含5 個氨基酸以上的肽可進行精確鑒定,但對含2~4 個氨基酸的小肽的鑒定卻精度不足[10]。要精確測定分離鑒定肽的DPP-IV抑制能力,需要按照肽的氨基酸序列進行人工合成,并利用體外實驗評估其生物學特性。表2列舉了部分已得到鑒定的肽的DPP-IV抑制潛能。這些DPP-IV抑制肽由2~11 個氨基酸組成,值得注意的是,氨基酸位點較多的肽在通過消化道時有被降解的可能[28]。雖然這些DPP-IV抑制肽的DPP-IV抑制能力明顯高于未經(jīng)富集/純化的水解物,但相比于化學合成的DPP-IV抑制劑明顯要差許多,如西他列汀的IC50值僅為0.000 036 mg/mL(約為88 nmol/L)[16]。
表2 已鑒定的DPP-IV抑制肽序列的抑制潛能Table 2 Inhibitory potential of identififi ed DPP-IV inhibitory peptides
肽在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝、分泌等過程可能導致其在人體內(nèi)的生物利用性及穩(wěn)定性差,因此生物活性肽的體外分析結果與體內(nèi)活性之間的相關性存有爭論[40]。此外,體外分析中使用的酶濃度可能與體內(nèi)不符,這對評定肽的生物活性也有影響[39]。因此,在食源肽正式用于人體之前有必要進行體內(nèi)實驗,以驗證其在人體內(nèi)的作用效果。
很多研究都報道了DPP-IV抑制肽在體外實驗條件下的抑制效能(IC50),有些研究進一步通過模擬消化來考察DPP-IV抑制肽通過消化道的穩(wěn)定性[20-22,38]。相比之下,只有少數(shù)關乎DPP-IV抑制肽在動物或細胞實驗中的效果(表3)。典型的體內(nèi)實驗采用糖尿病模型鼠,即在實驗鼠服用受試蛋白水解物以后,進行葡萄糖耐受實驗或測定鼠血漿中的DPP-IV活性。研究結果表明,在體外具有DPP-IV抑制活性的食源肽有助于調(diào)節(jié)血液葡萄糖水平,在某些條件下這些動物中DPP-IV活性更低。然而,有關DPP-IV抑制肽在人體中的作用鮮有相關報道。
3 具有體外DPP-IV抑制活性的食源組分的細胞及體內(nèi)研究Table 3 Cellular and in vivo studies of food-derived constituents with in vitro DPP-IV inhibitory activity
針對DPP-IV抑制肽進行的定量結構-活性關系的研究表明,特定的氨基酸序列是決定DPP-IV抑制活性大小的首要因素。而肽的不同生化特性,包括鏈長、等電點、疏水性、凈電荷與其DPP-IV抑制活性相關性不顯著[46]。IC50小于100 μmol/L的DPP-IV抑制二肽通常在其N端有Trp/Thr/Met,在C端有Ala/Leu/His。盡管N端位點似乎對二肽抑制DPP-IV能力影響最大,但C端氨基酸對其潛能也有影響,這可能由于兩個位點都參與到肽與酶的相互作用[33]。三肽的情況有所不同,在第1、2、3個位點的氨基酸通常分別是Ile/Gln/Leu/Ser/Val、Pro和Gln/Ala/Ile/Leu/Gly/Met/Phe。含有4 個以上氨基酸的肽通常在第1、2、3個氨基酸位置是Leu/Gly/Ile、Pro/Leu/Lys和Ala/Val/Gly/Pro,在C端是Pro/Leu/Arg[1,33,47-48]。DPP-IV抑制肽通常具有高比例的疏水性氨基酸,這些疏水性氨基酸可能會加強與DPP-IV活性位點的相互作用[1]。實際上在DPP-IV的S1亞基有疏水口袋,在肽對DPP-IV抑制上起到關鍵作用[1]。
體外動力學分析及分子對接模型用來研究肽與DPP-IV之間的相互作用。DPP-IV抑制肽對DPP-IV的抑制方式包括競爭性、非競爭性、反競爭性及混合型,因此,DPP-IV抑制肽可能在酶的活性位點和/或催化中心以外發(fā)揮其性能[49]。大多數(shù)第一個氨基酸位點是Pro的食源DPP-IV抑制肽是通過競爭性方式作用的。已知DPP-IV優(yōu)先作用于倒數(shù)第二個氨基酸位點是Pro的底物或其他小的不帶電荷的氨基酸,如Ser和Ala。DiprotinA是DPP-IV的競爭性抑制劑,但實際上是轉換率很低的DPP-IV底物,因而有研究人員推測,第一個氨基酸位點是Pro的食源肽,其可能與DPP-IV底物有相似的結構,表現(xiàn)出競爭性抑制作用。另一方面,大多數(shù)N端含有Trp的肽表現(xiàn)出非競爭性或反競爭性抑制作用。Trp-Arg-Xaa三肽文庫的計算機模型 表明N端Trp側鏈與酶疏水性S2口袋內(nèi)部的Phe357位點相互作用。相似地,含有Trp的二肽Trp-Val結合到酶活性位點附近的次級位點上。值得注意的是,對特定序列的肽的抑制模式,不同的研究團隊給出的結果存在分歧,這可能由于酶動力學分析中實驗條件的不同,如底物和酶的類型及數(shù)據(jù)的分析方法不同,如線性與非線性回歸模型[49]。
以常規(guī)的方法研發(fā)DPP-IV抑制肽是一個耗時的過程,隨著越來越多的蛋白質及生物活性肽的序列已經(jīng)鑒定,肽組學及蛋白質組的工具不斷完善,以計算機為工具的生物信息學被更為廣泛地用于評估蛋白質中生物活性肽的釋放[7,9,50]。
NCBI、UniProt和BIOPEP[7,9]等蛋白質數(shù)據(jù)庫提供了不同蛋白質的氨基酸序列,可以用來分析前體蛋白質的氨基酸組成。在確定好蛋白底物和水解酶以后,利用ExPASy Cutter[7]和BIOPEP[9]等在線平臺的肽剪切工具,可以根據(jù)蛋白質的氨基酸序列及特異蛋白酶的裂解特異性在理論上預測出釋放的肽的組成及出現(xiàn)頻率[51],并將預測的結果與文獻上報道的序列或專門的生物信息學數(shù)據(jù)庫進行比較。如BIOPEP給出了48 種、總數(shù)達3 712 個生物活性肽(2019年1月評估)。許多肽序列可能沒有相關活性的報道,但可以利用Peptide Ranker賦予其功能并對肽的生物活性按從0(最不可能)到1(最可能)進行評分[7]。此外,還可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫或已鑒定DPP-IV抑制肽的序列,計算出DPP-IV抑制肽在特定蛋白質中的存在頻率,再結合已知DPP-IV抑制肽的抑制潛能(半最大效應濃度和/或IC50)[10]及蛋白質的氨基酸位點數(shù)或分子量,就可以從理論上預測出蛋白質經(jīng)水解后釋放DPP-IV抑制肽的情況[8]。
應用肽剪切工具時需要注意以下幾點[7,9]:1)肽剪切工具只考慮到酶的主要酶切位點,然而大多數(shù)商品化的酶都是不純的,在主要活性以外還混有其他酶活性;2)肽剪切工具預測蛋白質水解的一個前提假設就是酶能夠以相同的幾率斷開所有的酶切位點,并最終導致蛋白質完全消化掉,然而實際上,肽鍵的選擇性會受到諸多因素的影響;3)在加工、儲存期間仍然可能發(fā)生轉錄后修飾,而這在計算機消化中不會做考慮;4)蛋白的預處理對產(chǎn)生的水解物組成也有影響;5)對于氨基酸序列未知的蛋白質和/或裂解特異性未知的酶無法使用計算機消化工具。
綜上,肽剪切工具能夠以低廉、有效的方式在理論上進行預測,但其結果必須用實驗加以驗證。
分子對接通過研究肽與酶的活性位點之間的特異性相互作用(即氫鍵、靜電和疏水相互作用),預測出肽與受體的結合模式及其親和力[39,52]。該技術既可以用作對高效能新型生物活性肽進行虛擬篩選的工具,也可以很好地闡述目標肽與酶的相互作用[53]。
與DPP-IV活性位點結合的抑制劑屬于競爭性抑制劑。競爭性抑制劑與DPP-IV的結合涉及蛋白質的一些疏水性亞位點。S1亞位點有一個狹長的結構,可與小的疏水性組分結合。S2亞位點比S1大,通過形成鹽鍵與抑制劑相結合,可以容納更大的組分[54]。有關DPP-IV競爭性抑制肽的相關報道很多,小球藻經(jīng)酶解產(chǎn)生兩種有DPPIV抑制活性的三肽(VPW和IPR),與DPP-IV進行對接的結果表明VPW和IRP通過氫鍵、范德華力和疏水相互作用與DPP-IV結合,且VPW與DPP-IV的S1口袋能夠很好地匹配、相互作用更為牢靠[39]。菜豆經(jīng)發(fā)芽48 h、再用堿性蛋白酶水解1 h產(chǎn)生的一種DPP-IV抑制肽,分子對接表明其與DPP-IV活性位點的S1、S2和S3口袋相互作用,且結合的穩(wěn)定性要強于已發(fā)表的豌豆肽與DPP-IV的結合結果[21]。此外,也有肽與DPP-IV活性位點以外的位點相結合的報道。結合到DPP-IV活性位點以外的分子通過非競爭性、混合型或反競爭性的模式發(fā)揮抑制作用[1]。由莧蛋白制備的較大的肽(12 個以上的氨基酸位點)的分子對接研究表明,這些肽通過防止形成DPP-IV二聚體的活性形式起作用[53]。
盡管分子對接為闡述DPP-IV抑制肽的作用機制起到重要作用,但其應用范圍也有明顯的局限性[9,53]:1)分子對接只適于競爭性抑制劑的分析,因為分子對接的假設之一就是肽結合到酶或受體的活性位點,因此,在酶活性位點以外的地方與酶結合的肽就無法用分子對接的方法進行預測;2)有些肽雖然是酶的競爭性抑制劑,但與酶結合后可以發(fā)生降解,因此不適宜使用分子對接;3)分子對接沒有考慮到肽的不穩(wěn)定性,這對于廣泛地使用分子對接作為預測工具來說是一個限制。
定量構效關系(quantative structual activity relationship,QSAR)建模就是通過數(shù)學模型表征分子的生理活性與其理化或結構參數(shù)的定量關系,然后將這些定量關系與分子的相應特性做出關聯(lián)。近來,QSAR建模也用于DPP-IV抑制肽的研究。一項針對乳源DPP-IV抑制肽的QSAR分析中,研究者將不同實驗條件下獲得的IC50數(shù)據(jù)及并非是競爭性的DPP-IV抑制劑納入到QSAR模型中,然后利用該模型對人體在攝食乳及乳制品后消化道內(nèi)存在的肽的DPP-IV抑制潛質進行預測[35]。結果表明DPP-IV抑制肽N端氨基酸的疏水性與肽DPP-IV抑制潛能呈正相關,這與早期的結構研究結果一致。盡管這種QSAR模型無法精確預測出DPP-IV抑制肽的IC50,然而用QSAR模型計算出的指數(shù)通常能夠根據(jù)DPP-IV抑制潛能對其分級。這項QSAR研究的目的不是要設計出DPP-IV抑制活性更強的肽,而是證實了QSAR可以作為一種工具預判出人體在攝食某種食物后消化道內(nèi)存在肽的DPP-IV抑制潛能。驗證性研究鑒定出與人體攝食乳制品后消化道內(nèi)存在的、體外DPP-IV抑制潛能較高的DPP-IV抑制肽,如Leu-Pro-Val-Pro-Gln其DPP-IV的IC50值達到(43.8±8.8)μmol/L[50]。將來把更多數(shù)量、更大多樣性(長度及氨基酸組成)的肽的數(shù)據(jù)納入到模型中,將有助于改進QSAR模型對DPP-IV抑制肽的預測能力[1,50]。
利用Q S A R預測肽的生物活性也存在一些局限性[9]:1)納入到QSAR模型中的數(shù)據(jù)可能不是在相同實驗條件下獲得的,如前所述,實驗條件對獲得的潛能值有非常大的影響;2)建立QSAR模型時應考慮到肽的作用模式,因為只有在相同作用機制的肽之間才能建立起生物學活性與結構之間的關系;3)在預測值與實驗值之間常有較大差異。
抑制DPP-IV的活性是防治II型糖尿病的有效途徑之一,近來的研究發(fā)現(xiàn)某些食源蛋白制備的肽具有DPP-IV抑制活性,因此開發(fā)有調(diào)控血糖之功效的食源肽制品備受關注。迄今為止,在DPP-IV肽的制備、鑒定、抑制模式及功效關系等方面已經(jīng)有了相當?shù)姆e累。然而,從科研以及最終要應用于人體的角度來說,還有許多問題有待解決。1)目前對于DPP-IV抑制肽只有定性的鑒定,而沒有定量的報道。要保證這些食源肽在體內(nèi)發(fā)揮功效,首先需要保證其達到一定的濃度,因此,有必要進行DPP-IV抑制肽的定量研究。2)有關DPP-IV抑制肽的研究多停留在體外研究的水平,部分做了模擬消化道消化的實驗,只有少數(shù)涉及到細胞及動物實驗,尚無相關的人體實驗的報道。下一步的研究方向就是要獲得DPP-IV抑制肽在人體內(nèi)的生物利用度及生物可給性的信息。3)已報道的DPP-IV抑制肽的抑制潛能都要明顯低于藥品,因此就目前來看,不適宜將DPP-IV抑制肽作為藥品的替代品用于糖尿病的治療。然而對于糖尿病高危人群,DPP-IV抑制肽有防控的潛力。此外,已有報道稱DPP-IV抑制肽對抗糖尿病的藥物有輔助治療的作用,有必要在DPP-IV抑制肽與藥物的相互作用方面開展更加深入的研究。4)現(xiàn)有研究側重于制備高潛能的DPP-IV抑制肽,而對其感官性能往往關注不夠。DPP-IV抑制肽若要應用于食品,產(chǎn)品的感官性狀就必須加以考慮。研究表明,疏水性氨基酸對DPP-IV抑制肽的抑制活性有重要影響,而疏水性氨基酸的暴露常常會導致苦味的產(chǎn)生。針對性地制備出高活性與低苦味并存的DPP-IV抑制肽也是今后的發(fā)展方向。