梁搏納

(吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

阿爾茨海默病(AD)是一種較為常見(jiàn)的腦變性疾病，其確切的病理?yè)p傷機(jī)制仍尚未清楚。目前，已明確AD患者的學(xué)習(xí)記憶功能減退可能是由于腦內(nèi)的膽堿能神經(jīng)元功能受損而造成的〔1〕?；诖?，有學(xué)者認(rèn)為〔2〕：鹽酸多奈哌齊治療AD具有較好的療效，但對(duì)于其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。另外也有研究〔3〕證實(shí)了：淀粉樣β蛋白(Aβ)沉積，破壞了突觸完整性，影響了其功能和可塑性。突觸致密區(qū)蛋白95蛋白是突觸后致密區(qū)內(nèi)含量最多的一種蛋白，在突觸可塑性中發(fā)揮著重要作用。但對(duì)于鹽酸多奈哌齊是否會(huì)影響突觸可塑性尚無(wú)學(xué)者進(jìn)行研究。本研究以動(dòng)物模型為研究對(duì)象，探討了鹽酸多奈哌齊對(duì)AD大鼠上述因子的影響，以便為AD的治療提供一種較為有效的治療藥物。

1 材料與方法

1.1材料及分組 以18只正常老年雄性Wistar大鼠〔匯智泰康生物技術(shù)(北京)有限公司提供，許可證編號(hào)：SYXK(京)2014-0022〕為研究對(duì)象，均為19～24月齡，體重450～550 g，平均(502.3±12.5)g。將18只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組及治療組，每組6只。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物可自由攝食及飲水。

1.2試劑與儀器 上海北諾生物科技有限公司的Aβ25～35，上海寶曼生物科技有限公司的碘化丙啶(PI)染色液，賽默飛公司的核糖核酸酶(RNase)、兔抗大鼠Aβ1～40、 丙二醛(MDA)試劑盒、羊抗兔的二抗，索萊寶公司的乙酰膽堿酯酶(AchE)、丁酰膽堿酯酶(BchE)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，檸檬酸三鈉還原硝酸銀(AgNO3)，北京諾博萊德科技有限公司提供的中杉金橋PV9000通用型二步法檢測(cè)試劑盒，北京梅科萬(wàn)德生物科技有限公司提供的DAB顯色劑，香港西夏公司提供的圖像分析儀(軟件系統(tǒng)Visilog5.0)，沈陽(yáng)譽(yù)德電子儀器有限公司提供的SYD-K4080型全自動(dòng)恒溫冷凍切片機(jī)；先儀譜科技提供腦立體定位儀，江蘇賽昂斯公司提供的Morris水迷宮。

1.3建立模型 制備聚集態(tài)的Aβ后，模型組和治療組建立AD模型：適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，100 g/L的水合氯醛腹腔注射麻醉，固定于腦立體定向儀，減去頭頂部毛發(fā)，碘酊消毒，75%酒精脫碘，頭頂部正中切口，暴露前囟，依據(jù)定位圖譜，鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器穿刺，注入5 μl聚集態(tài)的Aβ25～35，留針10 min，局部撒復(fù)方新諾明，縫合切口，碘伏消毒。大鼠術(shù)后愈合后，給予3%氯化鋁100 mg/kg灌胃，持續(xù)1個(gè)月。

對(duì)照組同上步驟，不同的是注射器注入等容積的生理鹽水。

1.4方法 3組大鼠在造模后3 d開(kāi)始灌胃給藥，1次/d，治療組給予鹽酸多奈哌齊(商品名：阿瑞斯，廠家：陜西方舟制藥有限公司；批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030583)0.525 g/kg，對(duì)照組及模型組給予等量的生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃4 w。

1.5觀察指標(biāo)

1.5.1學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力 在灌胃結(jié)束后，以大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試分析〔4〕，包括學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力，空間探索實(shí)驗(yàn)。

1.5.2血清AchE、BchE活性 麻醉，腹主動(dòng)脈取血3 ml，離心，取血清測(cè)定AchE、BchE活性。

1.5.3腦組織中SOD、MDA含量及細(xì)胞凋亡情況 麻醉取血，快速斷頭，取出全腦，分離大鼠大腦右側(cè)后1/4皮質(zhì)，稱(chēng)重，生理鹽水制成腦組織勻漿(10%)，按照試劑盒測(cè)定SOD、MDA含量。

取出全腦，分離大鼠大腦右側(cè)前1/4皮質(zhì)，浸泡冰乙醇(70%)中，制成單細(xì)胞懸液，PI染色，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.5.4不同腦組織區(qū)域的Aβ表達(dá) 取出全腦，將左側(cè)額葉、顳葉和海馬組織浸泡至甲醛溶液(10%)中，石蠟包埋、切片，Aβ免疫組化和銀染色。

1.5.5大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)變化 觀察所有大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95陽(yáng)性細(xì)胞：免疫組化切片，10×10顯微鏡觀察，Visilog5.0 by Noesis軟件采集并分析圖像，記錄陽(yáng)性細(xì)胞平均面積及平均吸光度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

2.13組學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力比較 在第1～4天，治療組、對(duì)照組逃避潛伏期均明顯短于模型組，而治療組、對(duì)照組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果明顯低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.23組血清AchE、BchE活性比較 對(duì)照組、治療組血清AchE活性均顯著低于模型組(P<0.05)，對(duì)照組BchE活性顯著低于模型組(P<0.05)，治療組、模型組BchE活性無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.33組腦組織中SOD、MDA含量及細(xì)胞凋亡情況比較 治療組、對(duì)照組腦組織中SOD含量顯著高于模型組，MDA含量及細(xì)胞凋亡情況顯著低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 3組學(xué)習(xí)能力及空間記憶能力比較

與模型組相比:1)P<0.05；下表同

表2 3組血清AchE、BchE活性比較

表3 3組腦組織中SOD、MDA含量及細(xì)胞凋亡情況比較

2.43組左側(cè)額葉、顳葉和海馬組織區(qū)域的Aβ表達(dá)量比較 治療組、對(duì)照組左側(cè)額葉、顳葉和海馬組織區(qū)域的Aβ表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.53組腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)比較 治療組、對(duì)照組腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)顯著高于模型組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表4 3組左側(cè)額葉、顳葉和海馬區(qū)域的Aβ表達(dá)量比較

表5 3組腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)比較

3 討 論

AD的流行病學(xué)顯示〔5〕：我國(guó)65歲以上老年人有3%～7%的人群患病。其病因尚未明確，但有研究發(fā)現(xiàn)〔6〕：AD的典型組織病理學(xué)改變?yōu)槟X內(nèi)的淀粉樣蛋白沉積，而中樞膽堿能神經(jīng)元功能受損可能會(huì)導(dǎo)致患者的學(xué)習(xí)、記憶受損。鹽酸多奈哌齊是一種AchE抑制劑，能夠改善AD的學(xué)習(xí)、記憶功能，但對(duì)于其作用機(jī)制尚未明確。

本研究建模及干預(yù)方式與何建明等〔7〕相一致。本研究結(jié)果表明，AD能夠?qū)е麓笫篌w內(nèi)的AchE活性升高，而治療組之所以和對(duì)照組差異不顯著，則是鹽酸多奈哌齊發(fā)揮了作用，推斷可能是這一藥物促使AchE活性降低。模型組和治療組的BchE活性均高于對(duì)照組，模型組和治療組的BchE活性無(wú)明顯差異，提示AD患者的BchE活性升高，而鹽酸多奈哌齊對(duì)于BchE活性，不會(huì)產(chǎn)生較為明顯的影響。乙酰膽堿是膽堿能系統(tǒng)中的主要遞質(zhì)，在突觸處，如發(fā)生水解，會(huì)同時(shí)活化AchE、BchE，終止神經(jīng)遞質(zhì)功能。AchE活化后能夠促進(jìn)Aβ沉積，且有研究證實(shí)〔8〕，AchE-Aβ復(fù)合物的神經(jīng)毒性明顯大于單獨(dú)的Aβ肽，同時(shí)Aβ能夠升高AchE的活性。SOD是一種抗氧化金屬酶，能夠平衡體內(nèi)的氧化與抗氧化，其含量能夠反映機(jī)體的抗氧化能力。MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的一種產(chǎn)物，能夠加劇膜的損傷，因此可將其作為反映氧自由基水平的指標(biāo)。本研究結(jié)果證實(shí)：AD可降低腦組織中SOD含量，升高Aβ表達(dá)量及MDA含量，而鹽酸多奈哌齊則能夠通過(guò)乙酰膽堿與Aβ之間的密切關(guān)系，有效降低腦內(nèi)組織的Aβ表達(dá)量，進(jìn)而減少腦內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生，降低MDA含量，升高SOD含量。此外，模型組的細(xì)胞凋亡比例明顯高于對(duì)照組及治療組，這一結(jié)果證實(shí)，鹽酸多奈哌齊可減少細(xì)胞凋亡比例，進(jìn)而增加患者的逃避潛伏期。經(jīng)空間探索實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與治療組空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果均明顯低于模型組，可見(jiàn)AD模型組大鼠的空間記憶能力降低，對(duì)照組與治療組空間探索結(jié)果差異不明顯，說(shuō)明鹽酸多奈哌齊能夠明顯改善大鼠的學(xué)習(xí)及空間記憶能力。目前主要將AD的學(xué)習(xí)、記憶障礙歸因于膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的缺乏。鹽酸多奈哌齊能夠降低AchE活性，使得乙酰膽堿濃度增加，進(jìn)而改善其學(xué)習(xí)記憶功能。有研究顯示〔9〕，淀粉樣蛋白的產(chǎn)生與聚集是導(dǎo)致AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，在發(fā)病早期，突觸的功能與結(jié)構(gòu)受損主要是由于Aβ導(dǎo)致的，導(dǎo)致突觸的可塑性(多種學(xué)習(xí)形式的基礎(chǔ))喪失，導(dǎo)致認(rèn)知損害。突觸后致密區(qū)主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的突觸后模，具有調(diào)節(jié)和聚合受體、穩(wěn)定突觸結(jié)果的作用，而突觸后致密區(qū)蛋白95是突觸后致密區(qū)最為豐富的一種蛋白，與突觸后膜相隔12 nm，與多種離子通道受體、因子、蛋白等聯(lián)系密切，還能夠與其他許多胞質(zhì)信號(hào)組成信號(hào)復(fù)合物，促進(jìn)信號(hào)耦合，影響突觸傳遞及可塑性。本研究中，模型組大鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)、皮質(zhì)突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)明顯低于對(duì)照組和治療組，提示AD大鼠的突觸可塑性降低，而鹽酸多奈哌齊能夠提高突觸后致密區(qū)蛋白95表達(dá)水平，進(jìn)而改善突觸的可塑性，改善認(rèn)知功能。上述研究數(shù)據(jù)均證實(shí)，鹽酸多奈哌齊能夠通過(guò)多種方式，改善AD的癥狀，進(jìn)而提高治療效果。