何震宇,顧取良,游娟

(廣東藥科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，廣東 廣州 510006)

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶，其編碼基因定位于1p36.3[1],全長2.2 kb，包含11個外顯子[2]。MTHFR基因錯義突變是引起酶活性缺乏和降低的主要機制，最常見的一個突變是DNA分子第677位堿基發(fā)生C→T 的突變(C677T)，它會導(dǎo)致編碼肽鏈第222位的丙氨酸被纈氨酸取代，從而降低MTHFR的熱穩(wěn)定性和活性,雜合子(TC)個體的MTHFR活性降低35%，突變純合子(TT)個體的MTHFR活性降低70%[3]。MTHFR活性下降可引起血漿同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平上升、一碳單位代謝障礙，與唐氏綜合征[4]、神經(jīng)管缺陷[5]、唇腭裂[6]、心腦血管疾病[7]、自閉癥[8]、反復(fù)自然性流產(chǎn)[9]、腫瘤[10]等多種疾病的發(fā)生相關(guān)。加強MTHFRC667T基因分型研究，對臨床疾病診斷、風(fēng)險性預(yù)測及指導(dǎo)醫(yī)生用藥等有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

口腔拭子基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×HS PCR Mix(廣州東盛生物科技有限公司)；上游引物FP：5′-CTGGGGTCAGAAGCATATCAGTCATG-3′及下游引物RP：5′-AAGCAACGCTGTGCAAGTTCTGG-3′(自行設(shè)計，北京六合華大基因科技股份有限公司合成)；HinfI(Thermo Fisher Scientific Inc)；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)low ladder(廣州東盛生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

5804R型低溫高速離心機(德國Eppendorf 公司)；DDY- 6c型電泳儀(北京市六一儀器廠)；凝膠成像分析儀(英國 Syngene 公司)；2720型PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 研究對象

正?？谇皇米訕?biāo)本100例，采自廣東藥科大學(xué)在讀本科生，其中男57例，女43例，平均年齡20.28歲，事先均簽署了知情同意書。

1.4 DNA制備

準(zhǔn)備消毒的醫(yī)用棉簽，志愿者先用清水漱口，然后手持棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)(腮幫子)上反復(fù)擦拭10次左右，取出棉簽，-20 ℃保存。按試劑盒說明書提取基因組DNA。

1.5 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI中MTHFR基因全序列(登錄號：NG_013351.1)及dbSNP數(shù)據(jù)庫的序列信息(編號：rs1801133)，采用primer premier 5.0軟件輔以人工修改設(shè)計引物，使用在線Primer-BLAST程序驗證引物的特異性。最終選定的引物與模板的對應(yīng)關(guān)系見圖1。

圖1PCR的模板序列及引物結(jié)合位置
Figure1Template sequence and primer binding location of PCR

上述序列中2個末端的大寫堿基為引物的對應(yīng)位置，以突變型等位基因為模板的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點附近含有GAGTC序列，它能被HinfI(G^ANTC)識別切割；相反，以野生型等位基因為模板的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點附近的相應(yīng)序列為GAGCC序列，它不能被HinfI識別切割。此外，野生型等位基因、突變型等位基因的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點上游均包含1個GACTC序列【104～108位】，其為HinfI識別位點。

1.6 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的電泳鑒定

PCR總體積25 μL，其中2×HS PCR Mix 12.5 μL、上下游引物各10 pmol、基因組DNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 35 s，共計30個循環(huán)，再于72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，得到預(yù)期大小的片斷后，再進(jìn)行下一步的酶切反應(yīng)。

1.7 PCR產(chǎn)物的酶切分型

酶切反應(yīng)體系30 μL，其中PCR產(chǎn)物10 μL、FastDigest Green Buffer 2 μL、FastDigestHinfI 1 μL、滅菌三蒸水17 μL，37 ℃水浴消化10 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，根椐限制性酶切圖譜確定每份樣品C677T位點的基因型。

1.8 測序驗證

隨機選取上述PCR-RFLP法檢出的3種基因型樣品各1例，PCR擴(kuò)增535 bp的靶序列測序，測序引物采用PCR上游引物FP。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

基因型和等位基因頻率采用直接計數(shù)法，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的吻合度檢驗采用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 改良PCR-RFLP法對MTHFR基因 C677T 位點的鑒定

PCR產(chǎn)物理論大小為535 bp(見圖2中的P),用HinfI進(jìn)行酶切，野生型等位基因677C可得到429.5、105.5 bp 2種片段，突變型等位基因677T可得到264.5、165、105.5 bp 3種片段。故野生型純合子CC的條帶應(yīng)為429.5、105.5 bp；突變型純合子TT的條帶應(yīng)為264.5、165、105.5 bp；雜合子CT的條帶應(yīng)為429.5、264.5、165、105.5 bp，事實上，僅通過429.5、264.5 bp 2種特征片段就可從電泳圖譜上清晰地分辨出CC、CT、TT 3種基因型(圖2)。測序結(jié)果(圖3)表明，本研究建立的改良PCR-RFLP法對3種基因型樣品的分型結(jié)果完全正確。

MP123456789101112bp700500400300200150100535429.5264.5165105.5

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)； P. PCR產(chǎn)物；1、3、5、6、8、9、10、11.野生型純合子CC； 2、7、12. 雜合子CT； 4.突變型純合子TT。

圖2改良PCR-RFLP檢測MTHFR基因C677T位點基因型之電泳圖譜

Figure2Electrophoresis map for genotyping C677T locus ofMTHFRgene by improved PCR-RFLP

abcd

a.中框內(nèi)序列為內(nèi)對照酶切位點； b、c、d.中圓角矩形圈住的堿基為多態(tài)位點堿基， 相應(yīng)的基因型分別為野生型純合子CC，雜合子CT，突變型純合子TT。

圖3MTHFR基因C677T位點3種基因型樣品測序峰圖

Figure3Sequencing map of three genotypes of C677T locus ofMTHFRgene

2.2 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗

本研究檢測到CC、CT、TT 3種基因型的例數(shù)分別為：59、35、6，相應(yīng)的基因型頻率分別為0.59、0.35、0.06。等位基因C的頻率為0.765，等位基因T的頻率為0.235。經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，χ2=0.0723(P=0.965>0.05)，說明樣本具有群體代表性。

3 討論

由于MTHFR基因多態(tài)性與臨床上多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，故臨床開展MTHFR基因多態(tài)性檢測意義重大、前景廣闊。目前，國內(nèi)外用于MTHFR基因C677T位點(rs1801133)的分型方法有直接測序(Sanger 雙脫氧鏈終止法)[11]、焦磷酸測序[12]、微測序[13]、基于引物延伸反應(yīng)的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)基因分型技術(shù)[14]和熒光偏振光基因分型技術(shù)[15]、基因芯片[16]、Taqman探針法[17]、高分辨率熔解曲線(HRM)法[18-19]及PCR-RFLP[20-25]等，各有其優(yōu)點及局限性。

PCR-RFLP是一種經(jīng)典的基因分型方法，相較于大多數(shù)方法而言，不需要貴重儀器，技術(shù)簡單，容易實現(xiàn)，因而在MTHFR基因C677T位點的檢測中應(yīng)用廣泛。不過，通過分析(表1)，不難發(fā)現(xiàn)，既有方法在PCR產(chǎn)物酶切不完全時，殘留的PCR產(chǎn)物容易導(dǎo)致TT型(突變型純合子)樣品被誤判為CT型(雜合子)(圖4)。在薛麗等[15]的實驗中就出現(xiàn)過這種情形：他們用PCR-RFLP檢測了100例標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)了48例CT雜合子，用TDI-FP、Pyrosequencing測序2種方法均證實其中有2例所謂的“CT雜合子”屬于誤判，實質(zhì)上為TT純合子。

表1 采用PCR-RFLP法鑒定MTHFR基因C677T位點的引物及基因型判斷依據(jù)Table 1 Primers and genotype judgment basis for identification of MTHFR gene C677T locus by PCR-RFLP

完全酶切圖 不完全酶切圖

圖4既有PCR-RFLP法檢測MTHFR基因C677T位點之完全酶切及不完全酶切示意圖

Figure4Complete and incomplete digestion maps ofMTHFRgene C677T locus detected by existing PCR-RFLP method

本研究對既有PCR-RFLP分型法進(jìn)行了改良，通過巧妙的引物設(shè)計使得所有樣品的PCR產(chǎn)物在多態(tài)位點之外均包含一個HinfI識別位點作為酶切效果的內(nèi)對照，一旦在該位點發(fā)生切割，得到的所有真正反映樣品基因型的酶切片段的大小必然小于PCR產(chǎn)物的大小(即局部小于整體)，不會由于PCR產(chǎn)物的殘留干擾基因型判斷。如圖2所示，僅憑橙色框中的429.5、264.5 bp片段的組合情況就可清晰區(qū)分3種基因型樣品，它們的大小均小于PCR產(chǎn)物(535 bp,綠色框框住的條帶)。除了引入酶切內(nèi)對照確保分型結(jié)果的準(zhǔn)確性外，本法還具有如下優(yōu)點：(1)只涉及離心、PCR、酶切、電泳等常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，操作較為簡便；(2)通過酶切產(chǎn)物的電泳圖譜判斷基因型，結(jié)果非常直觀；(3)不需昂貴的儀器設(shè)備和試劑，可極大地降低實驗成本；(4)酶切反應(yīng)時間極短(FastDigest快速內(nèi)切酶可在10 min內(nèi)完成酶切反應(yīng))，而常規(guī)酶切反應(yīng)需要數(shù)小時乃至過夜[23-24]，故可極大節(jié)省檢測時間?？傊牧糚CR-RFLP法準(zhǔn)確、簡便、快速、成本低廉，對實驗平臺要求不高，在臨床檢測上有較高的推廣應(yīng)用價值。此外，該法還可用于流行病學(xué)調(diào)查以促進(jìn)相關(guān)疾病發(fā)病機制的深入研究。