陶明，王媛，郭琦，蔡克亞，趙高嶺

(1.河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450008； 2.鄭州安圖生物工程股份有限公司,河南 鄭州 450000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭陽性菌的代表，可引起許多嚴重感染。美國疾病控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第2位，僅次于大腸桿菌?；瘖y品中的金黃色葡萄球菌也是衛(wèi)生學檢驗的重要致病菌指標之一，檢驗的依據為《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)中規(guī)定的培養(yǎng)法，鑒定主要依賴于菌落形態(tài)、染色特性、顯微鏡下形態(tài)特征、生化反應以及選擇性培養(yǎng)基等，但這種傳統(tǒng)的鑒定方法繁瑣、耗時長，同時也會受到培養(yǎng)時間以及檢驗人員經驗能力等一些人為因素的影響。選用合適的鑒定系統(tǒng)是提高實驗室能力的重要保障。本實驗室收到中國食品藥品檢定研究院組織NIFDC-PT-188 化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗能力驗證盲樣2個：CODE1和CODE2,結合目前對微生物鑒定的常用手段[1-4]，本實驗室采用VITEK2 Compact、杜邦BAX Q7、miniVIDAS、MALDI-TOF質譜(Autof ms1000)、國標法聯(lián)合檢測盲樣中是否存在金黃色葡萄球菌。最后建立本實驗室藥品化妝品微生物聯(lián)合檢測程序，提高實驗室微生物檢測能力。

1 材料

1.1 樣品

金黃色葡萄球菌盲樣CODE1和CODE2,由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器

BD240 恒溫培養(yǎng)箱(德國BINDER)；JY10002電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；ESCO生物安全柜(新加坡ESCO科技有限公司)；Yamato SQ810C 立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)；VITEK 2 Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃股份有限公司)；杜邦BAX Q7、miniVIDAS(法國生物梅里埃股份有限公司)；Autof ms1000(安圖生物)。

1.3 菌種

微生物限度檢查法用標準菌株：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(B)44102]，在中國食品藥品檢定研究院購買，實驗室傳代保藏。

1.4 試劑

凍干兔血漿(青島高科園海博生物技術有限公司，批號：6333802);REAL-TIME PCR AssayStaphylococcusaureu(美國杜邦，批號Q8114);VITEK2 CP、GN鑒定卡(法國梅里埃，批號：2420735203、2410627103)；VIDAS金黃色葡萄球菌測試試劑盒(法國梅里埃，批號：1006051870)。

1.5 培養(yǎng)基

SCDLP液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司，批號：6333802)；Baird-Parker瓊脂(鄭州貝瑞特，批號：0011916)；血平板(鄭州貝瑞特批號：0011916)；胰酪大豆胨瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號：J0167Y)；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術有限公司，批號：20170509)，以上培養(yǎng)基均進行培養(yǎng)基適用性試驗合格后使用。

2 方法與結果

2.1 國標法

2.1.1 樣品前處理 樣品的西林瓶在生物安全柜中打開，無菌操作向西林瓶中加入6 mL SCDLP,將樣品完全混勻，使其分散混懸，轉移到滅菌的試管中，然后再用SCDLP潤洗西林瓶4次，每次1 mL，最終試管中SCDLP體積為10 mL。

2.1.2 增菌培養(yǎng) 上述稀釋液作為增菌液，于36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.3 分離培養(yǎng) 從上述增菌培養(yǎng)液中，取1環(huán)劃線接種在Baird Parker平板上，置36 ℃培養(yǎng)48 h。劃線接種血平板，置36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.4 純化培養(yǎng) 挑取疑似單個菌落在血瓊脂平板上，置36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血平板上疑似單個菌落在胰酪大豆胨瓊脂平板上進一步純化，置36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.5 染色鏡檢 挑取純化的可疑菌落，涂片，革蘭染色。

2.1.6 甘露醇發(fā)酵試驗 取上述分純的菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2～3 mm的滅菌液體石蠟，置36 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵甘露醇產酸溶液顏色變黃者為陽性。

2.1.7 血漿凝固酶試驗 取凍干兔血漿西林瓶，無菌操作加入0.5 mL生理鹽水，再加入疑似菌24 h肉湯培養(yǎng)物0.3 mL，混勻，置36 ℃培養(yǎng)箱中，每半小時觀察1次，6 h之內呈現凝塊即為陽性。

2.1.8 檢驗結果報告 在上述選擇平板上有可疑菌落生長，經染色鏡檢，證明為革蘭陽性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產酸，血漿凝固酶試驗陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。結果見表1。CODE1在血平板上有白色圓形光滑，無溶血圈疑似菌落，鏡檢為革蘭陽性球菌，甘露醇發(fā)酵試驗和血漿凝固酶試驗均為陰性，所以判定未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2在血平板上有金黃色圓形光滑，周圍有溶血圈疑似菌落，鏡檢為革蘭陽性球菌，甘露醇發(fā)酵試驗和血漿凝固酶試驗均為陽性，所以判定檢出金黃色葡萄球菌。實驗同時做陽性對照為陽性結果，陰性對照為陰性結果。

2.2 VITEK2 Compact鑒定

挑取“2.1.4”項下方法純化的單個菌落，鑒定根據菌落形態(tài)、革蘭染色結果，按照儀器說明書配置一定濃度的菌懸液，接種相應的鑒定卡，上機檢測。結果見表2。CODE1中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鑒定結果分別為表皮葡萄球菌、泛菌屬、單核細胞增生李斯特菌，結論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鑒定結果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬，結論為檢出金黃色葡萄球菌。

2.3 杜邦BAX Q7鑒定

取“2.1.2”的增菌液5 μL，加入裂解液200 μL，55 ℃保持1 h，95 ℃保持10 min，立即冷卻5 min，取50 μL加入PCR管條中，上機檢測。結果見表3。杜邦BAX Q7鑒定結果：CODE1為“-”，即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”，即檢出金黃色葡萄球菌。同時做陽性對照結果為“+”，陰性對照結果為“-”。

2.4 miniVIDAS鑒定

儀器定標后，取“2.1.2”的增菌液2 mL，使用水浴滅活，取0.5 mL加入試劑條第1個加樣孔，放入SPR管上機鑒定。結果見表3。miniVIDAS鑒定結果：CODE1為“-”，即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”，即檢出金黃色葡萄球菌。同時做陽性對照結果為“陽性”，陰性對照結果為“陰性”。

2.5 MALDI-TOF質譜鑒定

安圖生物的全自動微生物質譜檢測系統(tǒng)，型號：Autof ms1000。處理方法如下:在1.5 mL離心管中加入300 μL去離子水。取“2.1.4”項下純化的單個菌落于離心管中，充分振蕩混勻。加入900 μL無水乙醇，充分混勻。室溫離心2～4 min(轉速13 000 r/min)，倒去上清，再次離心，使用移液槍完全除去上清。37～40 ℃干燥沉淀2～5 min，至沉淀表面無明顯水跡。加入10 μL裂解液1，充分混勻。加入10 μL等體積的裂解液2，充分混勻。室溫離心2～4 min(轉速13 000 r/min)。吸取1 μL上清液，滴加到樣品靶上，晾干至樣品點無明顯水跡。取1 μL基質溶液覆蓋在上述樣品點上，晾干至樣品點無水跡。上機檢測。結果見表4。CODE1中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF質譜鑒定結果分別為表皮葡萄球菌、阪崎克洛諾桿菌、單核細胞增生李斯特菌，結論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF質譜鑒定結果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬，結論為檢出金黃色葡萄球菌。

2.6 結果比較

國標法的鑒定主要靠傳統(tǒng)的手工生化法，結果受人員的操作和判定有很大的影響。其他4種儀器法采用不同的原理對樣品進行鑒定，大大縮短了檢出時間，減少了人為因素的影響，但需要儀器和試劑成本有所提高。5種方法的結果見表5，比較發(fā)現結果均一致。CODE1均未檢出金黃色葡萄球菌，CODE2均檢出金黃色葡萄球菌。

表1 國標法試驗結果Table 1 Results of national standard method

注：陽性對照為金黃色葡萄球菌，陰性對照為大腸埃希菌。

表2 VITEK2 Compact鑒定結果Table 2 Results of VITEK2 Compact

表3 杜邦BAX Q7和miniVIDAS鑒定結果Table 3 Results of BAX Q7 and miniVIDAS

注：陽性對照為金黃色葡萄球菌，陰性對照為大腸埃希菌。

表4 MALDI-TOF質譜鑒定結果Table 4 Results of MALDI-TOF MS

表5 5種鑒定方法結果Table 5 Results of five identification methods

3 討論

檢驗機構的檢測能力是評價實驗室能力重要條件[5]。為了加強藥品化妝品微生物檢測質量的控制，提高本檢驗機構微生物檢測能力，特進行此次驗證活動。盲樣中除可能添加目標菌金黃色葡萄球菌外，還會添加多種其他菌以干擾陽性菌的檢出。各種細菌具有不同的酶系統(tǒng)，對營養(yǎng)基質的分解能力也不一樣，國標法利用生化試驗的方法檢測細菌對各種基質的代謝作用及其代謝產物，從而鑒別細菌的種屬。由于許多不同種屬菌在相同選擇性培養(yǎng)基上有相似或相同的菌落形態(tài)，如試驗中干擾菌與金黃色葡萄球菌在血平板上有極相似的形態(tài)，這就導致傳統(tǒng)國標法非常依賴檢驗人員經驗能力，很容易出現漏檢、假陰性結果出現。并且傳統(tǒng)國標法通常至少需要5～7 d時間，試驗周期過長。所以使用儀器進行輔助有助于提高檢出率和結果的準確性[6-10]。

為縮短試驗時間，實現快速鑒定。越來越多的現代分子生物學手段和儀器運用到了細菌種屬鑒定上。杜邦BAX Q7采用實時定量熒光PCR 技術檢測微生物，miniVIDAS利用酶聯(lián)免疫的原理對微生物或毒素等進行篩選檢測。兩種方法都是增菌后即可進行檢測，30 h左右就可得到試驗結果，大大縮短了試驗周期，而且準確率高，不容易出現假陰性結果。

為滿足更多的工作需要，本實驗室不僅僅停留在目標菌檢出或未檢出的層面，而是有能力鑒定出樣品中篩選到的所有菌。上述3種鑒定手段顯然已經不能滿足我們的需要。VITEK2 Compact和MALDI-TOF MS則能很好地解決這一問題。儀器法中VITEK2 Compact利用集成了眾多的生化試驗的鑒定卡，根據實驗結果與數據庫比對得出結論。MALDI-TOF MS是近年發(fā)展起來的一種軟電離技術，通過細菌的蛋白質指紋圖譜與數據庫中已知菌種的標準圖譜進行比對，幾分鐘內就可以完成鑒定。上述兩種方法都可鑒定出金黃色葡萄球菌和篩出的所有干擾菌種屬，通量高，準確性好。但試驗中發(fā)現，這兩種方法都依賴數據庫比對，由于各自公司數據庫容量不同，對于一些不常見種屬的細菌種屬鑒定上可能存在差異。如CODE1的菌落2，VITEK2的鑒定結果為泛菌屬(Pantoeaspp)，而MALDI-TOF MS鑒定結果則為阪崎克洛諾桿菌(Cronobactersakazakii)。出現這種情況時，就需要通過16SrRNA基因測序方法進行進一步鑒定[11-14]。

綜上所述，根據不同的試驗目的可以選擇不同的試驗方法。本實驗室建立的藥品化妝品微生物致病菌檢測程序如下：盲樣經增菌后，劃線分離的同時可以先使用杜邦BAX Q7和miniVIDAS進行初篩。根據初篩的結果更有針對性的從分離培養(yǎng)基中挑取疑似的和非疑似的菌落，分別利用國標法、VITEK2 Compact和全自動微生物質譜檢測系統(tǒng)Autof ms1000對其進行鑒定。以期通過多種實驗手段互相佐證，得出最全面最準確的結果。