趙丹丹 吳瑞 白穎 莫芳芳 馬如風(fēng) 柳辰玥 朱如愿 左加成 姜廣建

摘要目的：觀察人參皂苷Rb1對胰島素抵抗（IR）的C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖利用的影響，并基于AMPK信號通路探討其可能的作用機制。方法：將C2C12細(xì)胞分為正常組、模型組、人參皂苷Rb1組，模型組以0.25 mmol/L棕櫚酸，1%小牛血清白蛋白培養(yǎng)16 h誘導(dǎo)IR，人參皂苷Rb1組在模型組的基礎(chǔ)上以1、3、10、30、100 μmol/L濃度的人參皂苷Rb1分別干預(yù)24 h和48 h，通過檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量反映葡萄糖消耗量，并應(yīng)用CCK8試劑盒及光鏡觀察不同濃度人參皂苷Rb1對C2C12細(xì)胞活性及形態(tài)的影響，實時熒光定量PCR擴增分析人參皂苷Rb1對C2C12細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因表達的影響。并應(yīng)用shRNA沉默AMPKα的表達，構(gòu)建AMPKα低表達的骨骼肌細(xì)胞模型，以1、3、10、30、100 μmol/L濃度的人參皂苷Rb1分別干預(yù)24 h和48 h，與不含人參皂苷Rb1的培養(yǎng)液比較，再次驗證人參皂苷Rb1對C2C12細(xì)胞葡萄糖利用的影響及其與AMPK信號通路的關(guān)系。結(jié)果：1、3、10、30 μmol/L人參皂苷Rb1對C2C12細(xì)胞形態(tài)及活性無顯著影響，而100 μmol/L人參皂苷Rb1造成C2C12細(xì)胞活性降低及部分細(xì)胞死亡。10，30 μmol/L人參皂苷Rb1能夠促進IR的C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且人參皂苷Rb1能夠上調(diào)C2C12細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表達（P<0.05）。10、30 μmol/L人參皂苷Rb1亦能增加AMPKα低表達的骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗量（P<0.05），而該作用程度低于其對棕櫚酸誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞IR的影響，且RTPCR結(jié)果顯示人參皂苷Rb1能上調(diào)AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞SIRT1、PGC1α的基因表達。結(jié)論：人參皂苷Rb1能夠有效促進IR的C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖消耗，該作用與調(diào)節(jié)AMPK信號通路有關(guān)，但除AMPK信號通路亦有其他作用途徑。

關(guān)鍵詞人參皂苷Rb1;C2C12骨骼肌細(xì)胞;胰島素抵抗;基因沉默;葡萄糖消耗;AMPK信號通路

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.01.011

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）造成的葡萄糖攝取及利用障礙，是2型糖尿病等多種代謝相關(guān)疾病的中心環(huán)節(jié)[1]。骨骼肌細(xì)胞是參與機體葡萄糖等能量物質(zhì)代謝的重要外周組織，在維持體內(nèi)葡萄糖動態(tài)平衡及外周組織的胰島素敏感性中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2]。降糖消渴顆粒乃肝脾腎三臟同調(diào)的組方，臨床用于治療糖尿病療效確切，且離體研究亦證實降糖消渴顆粒含藥血清具有促進C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取及利用的作用[3]。文獻報道顯示，該方的主要健脾益氣組分人參皂苷Rb1能夠改善糖尿病大鼠骨骼肌組織的胰島素敏感性[4]，亦能促進脂肪細(xì)胞能量代謝[5]，其作用途徑可能與調(diào)節(jié)瘦素受體、脂聯(lián)素受體，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白等有關(guān)[68]。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是機體細(xì)胞能量代謝的重要激酶，能夠調(diào)節(jié)線粒體能量物質(zhì)的代謝，應(yīng)用shRNA沉默AMPK基因構(gòu)建穩(wěn)定的AMPK低表達的細(xì)胞株[9]，可以造成細(xì)胞對葡萄糖攝取及利用障礙[10]，用于胰島素抵抗的相關(guān)研究。本研究將通過棕櫚酸誘導(dǎo)的和AMPKα低表達的2種IR細(xì)胞模型，進一步觀察降糖消渴顆粒中主要健脾益氣組分人參皂苷Rb1對C2C12骨骼肌細(xì)胞葡萄糖利用及AMPKα等基因表達的影響，從分子水平探析其對骨骼肌葡萄糖利用的情況及可能機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株C2C12骨骼肌細(xì)胞株，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2藥物人參皂苷Rb1（曼思特，純度≥98%）購自北京百諾威生物科技有限公司。

1.1.3試劑與儀器DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶，均購自GIBCO公司;胎牛血清（杭州四季青）、青/鏈霉素，購自百諾威生物科技有限公司;棕櫚酸、小牛血清白蛋白，購自Sigma公司;葡萄糖氧化酶法測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所;CCK8試劑盒，購自于碧云天生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑購自于美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于美國Thermo公司，Power SYBR Green PCR Master Mix購自于美國ABI公司。BMG全波長酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH公司），逆轉(zhuǎn)錄PCR儀（美國Thermo公司），實時熒光定量PCR儀器7500型（美國ABI公司）。PCR擴增引物：AMPKα，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1（SIRT1），過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子1α（PGC1α）由上海生工公司合成。引物序列如下：AMPKα上游引物AAACCCACAGAAATCCAAACAC，下游引物CCTTCCATTCATAGTCCAACTG;SIRT1上游引物GCAACAGCATCTTGCCTGAT，下游引物GTGCTACTGGTCTACAAG;PGC1α上游引物CCCTGCCATTGTTAAGACC，下游引物TGCTGCTGTTCCTGCTCCT。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代C2C12骨骼肌細(xì)胞以含10%胎牛血清（FBS），100 IU/mL青霉素，100 IU/mL鏈霉素的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基于37 ℃，5%CO2條件下無菌培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至80%左右時用0.25%胰酶進行消化并傳代，每2～3 d傳代1次。

1.2.2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立及鑒定方法同前期實驗，具體如下：C2C12細(xì)胞以104/mL接種于96孔板，每6孔1組，分別加入正常培養(yǎng)液及含0.25 mmol/L棕櫚酸，1%小牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后觀察，若其葡萄糖消耗量明顯下降，則表明IR模型建立成功[3]。

1.2.3AMPKα低表達的骨骼肌細(xì)胞模型的建立首先應(yīng)用綠色熒光蛋白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，摸索最佳的電轉(zhuǎn)條件，并確定嘌呤霉素的藥殺濃度。根據(jù)AMPKα基因信息（GeneID：105758），構(gòu)建shRNA沉默點，設(shè)計并合成AMPKα基因shRNA靶位點，將AMPKα基因shRNA克隆至定點整合表達載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后抽提質(zhì)粒測序，使質(zhì)粒達到電轉(zhuǎn)級別;電轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞，根據(jù)沉默效果篩選陽性克隆及摸索好的電轉(zhuǎn)條件，將靶向性oligo和shRNA定點整合載體同時電轉(zhuǎn)C2C12細(xì)胞。經(jīng)藥殺后，realtime PCR驗證確定陽性克隆數(shù)量及過表達倍數(shù);完成AMPKα低表達C2C12細(xì)胞株建立，用于后續(xù)人參皂苷Rb1的干預(yù)研究。

1.2.4干預(yù)方法將20 mg人參皂苷Rb1，溶解于適量DMSO中，0.22 μm濾膜過濾后作為貯存液。使用時用完全培養(yǎng)基進行稀釋，分為5個劑量組，將終濃度分別為1、3、10、30、100 μmol/L的人參皂苷Rb1分別干預(yù)IR的C2C12細(xì)胞和AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞，空白組給予含有等體積DMSO正常培養(yǎng)基進行均一化對照，每組設(shè)5個復(fù)孔，藥物干預(yù)24 h、48 h。

1.2.5葡萄糖消耗量、細(xì)胞增殖檢測及細(xì)胞形態(tài)的觀察分別在給藥干預(yù)24 h、48 h時取培養(yǎng)基上清20 μL/孔，按GODPOD法，依照葡萄糖氧化酶法測定試劑盒中的步驟進行檢測。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并根據(jù)公式及稀釋倍數(shù)計算葡萄糖的濃度（mmol/L），通過比較培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，即可得知各組中細(xì)胞葡萄糖消耗量。按照CCK8試劑盒說明，分別將不同藥物濃度干預(yù)24 h、48 h后，每孔加入10 L CCK8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光毒，記錄OD值，觀察不同濃度藥物對細(xì)胞增殖的影響，并用于校正葡萄糖消耗量檢測時的細(xì)胞數(shù)。并用光學(xué)顯微鏡進行拍照，觀察不同濃度藥物對細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.2.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）檢測將C2C12細(xì)胞及AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞中，分別加入中濃度人參皂苷Rb1（1、3、10、30、100 μmol/L）干預(yù)24 h后，分別設(shè)置空白對照組，每組4個樣本復(fù)孔，使用Trizol試劑抽提總RNA并定量，取總RNA 1 μg使用Oligo（dT）引物逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。進一步以SYBR MIX（10 μL）+cDNA模板（2 μL）+上/下游引物（各1 μL）+無核酸酶超純水（6 μL）的反應(yīng)體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性2 min，繼以95 ℃變性20 s，退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此反復(fù)40個循環(huán)后，結(jié)束后4 ℃保存。每個樣品設(shè)立2個復(fù)孔重復(fù)。以GAPDH為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果以相對mRNA水平表示（2-ΔΔCt法），

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量數(shù)據(jù)均使用（Mean±SEM）形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用方差分析（ANOVA），兩兩比較采用Dunnett法或獨立樣本t檢驗進行，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用GraphPadPrism6軟件進行數(shù)據(jù)管理并制圖。

2結(jié)果

2.1對IR的C2C12細(xì)胞形態(tài)及活力的影響如圖1所示，應(yīng)用前法構(gòu)建IR模型，并加入不同濃度的人參皂苷Rb1干預(yù)48 h，光鏡下觀察低濃度（1、3、10、30 μmol/L）人參皂苷Rb1對C2C12骨骼肌細(xì)胞形態(tài)無顯著影響，100 μmol/L的人參皂苷Rb1組細(xì)胞生長略緩慢，細(xì)胞數(shù)有所減少，培養(yǎng)基中出現(xiàn)部分死亡的細(xì)胞。CCK8檢測亦顯示，人參皂苷Rb1干預(yù)48 h后，除100 μmol/L以外，其他低濃度人參皂苷Rb1對骨骼肌活力影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2對IR的C2C12細(xì)胞模型葡萄糖消耗的影響由圖2可見，與正常C2C12細(xì)胞比較，加入棕櫚酸的C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)液中剩余葡萄糖濃度明顯升高，葡萄糖消耗量均明顯降低（P<0.05），提示IR細(xì)胞模型構(gòu)建成功。與無藥物干預(yù)的IR細(xì)胞比較，除100 μmol/L外，不同濃度的人參皂苷Rb1（1、3、10、30 μmol/L）干預(yù)24 h、48 h，葡萄糖消耗量均有一定程度的增加，且呈現(xiàn)了一定的劑量依賴性，其中干預(yù)24 h時，10 μmol/L和30 μmol/L組干預(yù)細(xì)胞的葡萄糖消耗量分別增加了82.23%和83.13%，干預(yù)48 h時10 μmol/L和30 μmol/L組干預(yù)細(xì)胞的葡萄糖消耗量分別增加了87.50%和100.50%，與不加入人參皂苷Rb1的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3對IR的C2C12細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因的影響與對照組IR的C2C12細(xì)胞比較，10 μmol/L人參皂苷Rb1能夠顯著上調(diào)細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表達（P<0.05）。說明人參皂苷Rb1促進葡萄糖消耗的作用可能與調(diào)節(jié)上述基因有關(guān)。見圖3。

2.4對AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞模型葡萄糖消耗的影響如圖4所示，與不經(jīng)藥物干預(yù)的AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞比較，除100 μmol/L外，不同濃度的人參皂苷Rb1（1、3、10、30 μmol/L）干預(yù)24 h、48 h，葡萄糖消耗量均有顯著的增加（P<0.05）。其中干預(yù)24 h時，10 μmol/L和30 μmol/L組干預(yù)細(xì)胞的葡萄糖消耗量分別增加了61.14%和76.29%，干預(yù)48 h時，10 μmol/L和30 μmol/L組干預(yù)細(xì)胞的葡萄糖消耗量分別增加了58.86%和65.54%，與不加入人參皂苷Rb1的對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。人參皂苷Rb1對AMPKα低表達的IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量的影響程度低于對棕櫚酸誘導(dǎo)的IR細(xì)胞的影響，該結(jié)果進一步說明人參皂苷Rb1促進C2C12細(xì)胞葡萄糖消耗的與調(diào)節(jié)AMPKα有關(guān)。

2.5對AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α基因的影響與對照組IR的C2C12細(xì)胞比較，10 μmol/L人參皂苷Rb1能夠顯著上調(diào)AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞SIRT1、PGC1α的基因表達（P<0.05），對AMPKα的低表達細(xì)胞株的AMPKα基因表達有一定的上調(diào)作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖5?？梢夾MPKα基因沉默影響了人參皂苷Rb1對AMPKα的影響，但對SIRT1、PGC1α基因的影響仍存在，說明人參皂苷Rb1促進AMPKα低表達的C2C12細(xì)胞葡萄糖消耗的作用可能不僅僅通過調(diào)節(jié)AMPKα基因來完成。

3討論

人參用于治療糖尿病歷史悠久，早在《本草綱目》中就有過記載?，F(xiàn)代研究證明，人參中抗糖尿病作用的有效成分主要有人參皂苷，人參多肽，人參多糖等，其中人參皂苷是人參藥理活性最重要的成分[1112]。其抗糖尿病的作用機制包括抑制食欲，降低腸道葡萄糖與脂肪的吸收;調(diào)節(jié)糖脂代謝通路，增加能量消耗;調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖劑活化受體γ活性和表達，改善IR;促進胰島素分泌和抗胰島β細(xì)胞凋亡;抗氧化應(yīng)激和抗炎作用等[1314]。

人參皂苷Rb1是二醇組皂苷的主要成分之一，我們前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠改善肥胖小鼠的胰島素敏感性，該作用可能與促進白色脂肪組織棕色化有關(guān)[15]。也有文獻報道其具有促進脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等胰島素敏感細(xì)胞葡萄糖攝取的作用[8，16]，該作用與調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運子4（GLUT4）的表達有關(guān)[8]，然其上游是否與調(diào)節(jié)AMPKα等因子相關(guān)卻尚待深入研究。

在本研究中，我們觀察到一定濃度的人參皂苷Rb1（10、30 μmol/L）能夠促進高糖高脂誘導(dǎo)的IR的C2C12骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗，但過高劑量100 μmol/L因影響細(xì)胞活性而降低了葡萄糖的利用，且人參皂苷Rb1能夠上調(diào)IR的C2C12骨骼肌細(xì)胞AMPKα、SIRT1、PGC1α的基因表達。PGC1α參與骨骼肌葡萄糖攝取及胰島素敏感性的調(diào)節(jié)[17]，可以通過激活下游靶基因NRF1，NRF2等增強線粒體的生物合成，提高細(xì)胞線粒體數(shù)量和氧化呼吸功能[18]，與機體葡萄糖的消耗密切相關(guān)。而AMPK和SIRT1是PGC1α的重要上游調(diào)節(jié)因子，AMPK一方面可以直接磷酸化PGC1α相關(guān)位點增強PGC1α的轉(zhuǎn)錄活性，另一方面AMPK亦能通過提升胞內(nèi)NAD+水平增強SIRT1的活性，從而以去乙?；姆绞秸{(diào)節(jié)SIRT1下游靶蛋白PGC1α的活性[19]。我們的研究結(jié)果表明人參皂苷Rb1調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞葡萄利用與AMPK信號通路有關(guān)，該發(fā)現(xiàn)與既往研究結(jié)果一致[4]。

此外，我們進一步通過構(gòu)建AMPKα基因沉默的細(xì)胞株，進一步驗證人參皂苷Rb1促進骨骼肌細(xì)胞葡萄利用與AMPK信號通路的關(guān)系。結(jié)果顯示人參皂苷Rb1（10、30 μmol/L）亦能促進AMPKα低表達細(xì)胞株的葡萄糖消耗情況，但其促進作用較在棕櫚酸誘導(dǎo)的IR的細(xì)胞中發(fā)揮的作用弱，且在AMPKα低表達細(xì)胞株中，較低濃度（1、3 μmol/L）人參皂苷Rb1也顯示了一定的促進葡萄糖消耗的作用。此外，PCR結(jié)果提示人參皂苷Rb1對AMPKα基因沉默的細(xì)胞株SIRT1、PGC1α基因亦有上調(diào)作用?？傊?，本研究結(jié)果證實了參皂苷Rb1促進骨骼肌細(xì)胞葡萄利用與AMPK信號通路的有關(guān)，但不是單純通過AMPK信號通路發(fā)揮作用，亦有其他信號通路發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，靶組織中葡萄糖攝取是維持的機體血糖水平關(guān)鍵步驟，AMPK信號通路是葡萄糖等能量物質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)機制[2021]。本研究結(jié)果揭示了人參皂苷Rb1對骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖消耗利用的促進作用，這種作用可能與AMPKα，SIRT1，PGC1α多個因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。然而有鑒于經(jīng)由AMPK信號通路調(diào)節(jié)的葡萄糖利用多是通過線粒體呼吸鏈有氧呼吸完成的，人參皂苷Rb1促進葡萄糖消耗及對AMPK信號通路的調(diào)節(jié)是否與影響骨骼肌線粒體呼吸功能有關(guān)，尚待進一步研究明確。

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（2018-10-12收稿責(zé)任編輯：王明）