覃婷婷，榮 姣，黃哲甦

(1.天津市藥品檢驗(yàn)研究院，天津 300070； 2.天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300070)

牛磺酸顆粒為解熱鎮(zhèn)痛類藥物，其主要成分?；撬崾且环N具有多種生理和藥理活性的人體必需氨基酸，具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用，還可提高肌體非特異性免疫功能。主要用于緩解感冒初期的發(fā)熱和上呼吸道感染[1]，臨床上還用于治療心血管疾病、糖尿病、肝炎等疾病[2，3]。本研究在2017年度國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中收集到的?；撬犷w粒大部分為黃色顆粒，處方所用著色劑大部分都為檸檬黃，而檸檬黃是一種人工合成的偶氮型酸性染料，具有一定毒性，大量使用能對(duì)人體產(chǎn)生一定的危害[4]。同時(shí)，?；撬犷w粒的使用人群很大一部分是兒童，但是目前我國(guó)尚未對(duì)藥品中的色素添加量進(jìn)行規(guī)定，存在一定的安全隱患，因此本文參考相關(guān)文獻(xiàn)[5，8]建立了?；撬犷w粒中色素的檢測(cè)方法，并對(duì)市場(chǎng)上不同企業(yè)產(chǎn)品的色素含量進(jìn)行了考查。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1260 液相色譜儀(帶DAD檢測(cè)器)，Mettler XS 205十萬(wàn)分之一天平，水浴鍋，抽濾泵。

1.2試藥 食用合成色素檸檬黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[中國(guó)計(jì)量研究院，GBW(E)100001a，0.5 mg/ml]，食用合成色素日落黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[中國(guó)計(jì)量研究院，GBW(E)100003a，0.5 mg/ml]，?；撬犷w粒70批樣品均為國(guó)家藥品抽驗(yàn)樣品。甲醇(色譜純，天津康科德科技有限公司)，醋酸銨(色譜純，F(xiàn)isher Chemical)，檸檬酸、甲酸、乙醇、氨水、聚酰胺粉為分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Agilent zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇為流動(dòng)相A，0.02 mol/L醋酸銨溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，檸檬黃檢測(cè)波長(zhǎng)為426 nm，日落黃檢測(cè)波長(zhǎng)為486 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 ml/min。

表1 色素測(cè)定梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別精密量取食用合成色素檸檬黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和食用合成色素日落黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.02、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 ml，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為線性試驗(yàn)對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取樣品2 g，精密稱定，加水10 ml，滴加20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值至6，于60 ℃水浴中放置5 min，將1 g聚酰胺粉加10 ml水(20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4)調(diào)成粥狀，倒入上述溶液中，攪拌片刻后以G3垂熔漏斗抽濾，用60 ℃水(20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值為4)洗滌3次，每次10 ml，然后用10、5和5 ml甲醇-無(wú)水甲酸(6∶4)的混合溶液分別洗滌3次，再用水洗滌至濾液呈中性，用乙醇-氨水-水(7∶2∶1)混合溶液解吸洗滌3次，每次5 ml洗至無(wú)色，收集解吸液于水浴上蒸干，放冷，加水溶解并定容至10 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.2.3空白溶液的制備 按?；撬犷w粒處方，稱取除色素外的原輔料，混勻后，稱取2 g，照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備空白溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別精密量取食用合成色素檸檬黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和食用合成色素日落黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 ml，置100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。取系統(tǒng)適用性溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣20 μl分析，理論板數(shù)以檸檬黃計(jì)為5 154，日落黃與檸檬黃分離度為30。見圖1。

1.檸檬黃 2.日落黃圖1 對(duì)照品(A)供試品(B)空白(C)HPLC色譜圖

2.4線性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下系列對(duì)照品溶液各20 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果檸檬黃在0.1～25 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈線性關(guān)系，線性方程Y=32.095X-2.776 5(r=0.999 9)；日落黃在0.1～25 μg/ml濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈線性關(guān)系，線性方程Y=21.257X-1.665 2(r=0.999 9)。

2.5精密度試驗(yàn) 取10 μg/ml的檸檬黃和日落黃對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，檸檬黃峰面積RSD為0.16%，日落黃峰面積RSD為0.36%。說(shuō)明方法精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取某一企業(yè)的?；撬犷w粒樣品，精密稱取2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法重復(fù)制備6份，進(jìn)樣分析，平均含檸檬黃11.4 μg/g，RSD為0.96%。說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品，精密稱取1 g，置小燒杯中，制備9份待用。精密量取食用合成色素檸檬黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和食用合成色素日落黃溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1 ml，置同一50 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，再分別精密量取0.8、1.0和1.2 ml至上述加樣品的小燒杯中，每個(gè)濃度重復(fù)3份，自“加入20%檸檬酸溶液調(diào)節(jié)pH值為6”開始照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備加樣回收率試驗(yàn)溶液。取上述溶液進(jìn)樣分析。檸檬黃平均回收率為96.42%，RSD為1.96%(n=9)；日落黃平均回收率為95.29%，RSD為1.88%(n=9)。結(jié)果見表2 和表3。

表2 檸檬黃加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 日落黃加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.8定量限與檢出限 取檸檬黃和日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋一系列濃度溶液進(jìn)樣分析，檸檬黃和日落黃均為0.1 μg/ml濃度時(shí)，信噪比約為10，定量限為1 ng；二者濃度為0.03 μg/ml濃度時(shí)，信噪比約為3，定量限為0.3 ng。

2.9樣品測(cè)定 取收集到的17家企業(yè)的70批?；撬犷w粒進(jìn)行了色素測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。

3 討論

3.1色譜條件的選擇與優(yōu)化 前期通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，如果以甲醇-0.02 mol/L 醋酸銨溶液(10∶90)為流動(dòng)相等度洗脫，日落黃出峰時(shí)間較晚，在10 min以后；若采用梯度洗脫程序在5 min時(shí)增加流動(dòng)相A甲醇的比例至40%以上，盡管可以使日落黃出峰時(shí)間提前至7 min，但日落黃峰前面出現(xiàn)負(fù)峰，影響積分的準(zhǔn)確性，因此最終選擇了將甲醇的比例調(diào)至30%，既可使日落黃出峰時(shí)間提前，又保證了測(cè)量的準(zhǔn)確性。此外，目前一般文獻(xiàn)[6-8]中測(cè)定合成色素為了兼顧測(cè)定多種色素，波長(zhǎng)多選用254 nm，由于收集到的?；撬犷w粒樣品日落黃含量很低，通過(guò)DAD檢測(cè)器掃描發(fā)現(xiàn)檸檬黃與日落黃的最大吸收波長(zhǎng)分別在428 nm和486 nm，因此選用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，保證了檢測(cè)的靈敏度。

表4 ?；撬犷w粒色素測(cè)定結(jié)果 μg/g

*其中4批檢出日落黃，均值為1.3 μg/g，其余5批未檢出日落黃。

3.270批牛磺酸顆粒色素含量結(jié)果分析 17家企業(yè)除企業(yè)6和13未檢出色素外，其余15家企業(yè)產(chǎn)品均檢出檸檬黃，其中企業(yè)4的全部樣品和企業(yè)5的部分樣品還檢出了處方中未標(biāo)識(shí)的日落黃，均約為1 μg/g。不同企業(yè)間產(chǎn)品的檸檬黃色素含量差異較大，介于9.5～88.3 μg/g之間(見圖2)，其中企業(yè)5的批間差異最大，9批樣品結(jié)果從24.9～61.9 μg/g不等。不同企業(yè)產(chǎn)品色素含量差別懸殊，反映出生產(chǎn)企業(yè)對(duì)于藥品中色素的使用安全還不夠重視。鑒于目前藥品輔料中合成色素的標(biāo)準(zhǔn)體系尚未完善[9]，建議有關(guān)部門能出臺(tái)相應(yīng)的指導(dǎo)文件，規(guī)范藥企的生產(chǎn)行為，保障藥品的安全性。

不同企業(yè)圖2 不同企業(yè)?；撬犷w粒檸檬黃含量散點(diǎn)圖

3.3市場(chǎng)上檸檬黃色素質(zhì)量參差不齊 由于企業(yè)4和5檢出了處方中未列出的微量日落黃色素，因此本文對(duì)日落黃色素的來(lái)源進(jìn)行了探討。17家企業(yè)有8家提供了檸檬黃色素，本文對(duì)檸檬黃色素的含量進(jìn)行了檢測(cè)，其中7家企業(yè)檸檬黃含量均大于80%，且未檢出日落黃，而企業(yè)4 的檸檬黃色素檸檬黃含量?jī)H為56.6%，并含有1.9%的日落黃，由此可見，企業(yè)4產(chǎn)品中檢出的日落黃應(yīng)該是來(lái)源于檸檬黃色素。而企業(yè)5的9批樣品中有4批檢出了日落黃，另外5批未檢出，通過(guò)輔料使用信息對(duì)比發(fā)現(xiàn)，企業(yè)5的9批樣品分別使用了兩個(gè)輔料企業(yè)生產(chǎn)的檸檬黃色素，檢出日落黃色素的4批樣品均使用了企業(yè)A的相同批次檸檬黃色素，而未檢出日落黃色素的樣品則使用的是企業(yè)B的檸檬黃色素， 推測(cè)是由于使用了不同來(lái)源的檸檬黃色素導(dǎo)致企業(yè)5?；撬犷w粒色素種類和含量出現(xiàn)較大差異?？梢娔壳笆忻嫔蠙幟庶S色素的質(zhì)量參差不齊，個(gè)別色素生產(chǎn)企業(yè)的檸檬黃色素含量較低，且副染料含量較高，導(dǎo)致藥品制劑生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品的色素含量批間均一性較差，建議藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)關(guān)注色素輔料的質(zhì)量并對(duì)制劑中色素的含量進(jìn)行控制，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、均一，同時(shí)有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)藥用輔料生產(chǎn)過(guò)程的管理工作。