唐雪琪，盧金淼，毛曉芳，王永祥

（1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院King′s Lab，上海 200240；2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院臨床藥學(xué)部，上海201102）

臨床研究表明，嬰兒及兒童極少發(fā)生神經(jīng)病理性疼痛［1-2］。文獻(xiàn)報道證明，在幼年（出生后10 d以內(nèi)）接受神經(jīng)病理性疼痛造模手術(shù)的大鼠不會發(fā)生痛覺超敏。同時較多文獻(xiàn)報道，接受神經(jīng)病理性疼痛造模的幼年大鼠脊髓背角抗炎因子IL-10（interleukin-10，IL-10）和白細(xì)胞介素-4（IL-4）表達(dá)升高，而小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化［3］，巨噬細(xì)胞激活［4］及炎性因子白介素-1α、干擾素-γ的蛋白表達(dá)［5］都明顯弱于接受造模的成年大鼠（出生33 d以后）。幼年小鼠脊髓抗炎因子IL-10基因表達(dá)升高能夠抑制神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生［5］。這些研究表明，幼年動物少發(fā)神經(jīng)病理性疼痛與其免疫系統(tǒng)向抗炎方向激活有著密切的關(guān)系，但下游是否存在其他信號通路尚未見明確報道。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，鞘內(nèi)注射IL-10能夠通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)β-內(nèi)啡肽發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［6］。鞘內(nèi)注射β-內(nèi)啡肽中和性抗體或μ-阿片受體選擇性拮抗劑CTAP能夠完全阻斷IL-10的鎮(zhèn)痛效果，說明IL-10的鎮(zhèn)痛作用是由升高β-內(nèi)啡肽的表達(dá)介導(dǎo)的。這一通路被我們定義為脊髓IL-10/β-內(nèi)啡肽通路，可以被胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）受體激動劑及其他鎮(zhèn)痛療法啟動［7-8］。結(jié)合文獻(xiàn)報道以及本實(shí)驗(yàn)室前期研究，我們推測幼年大鼠較少產(chǎn)生痛覺超敏的生理現(xiàn)象可能是由脊髓IL-10/β-內(nèi)啡肽通路介導(dǎo)。本研究證明了IL-10及隨后的β-內(nèi)啡肽釋放在抑制幼年大鼠神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生中起到關(guān)鍵作用，為理解神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展過程提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

本研究所涉及動物實(shí)驗(yàn)方案獲得上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（201708007），并嚴(yán)格按照有關(guān)動物福利指導(dǎo)進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)操作。本實(shí)驗(yàn)所涉及動物主要包括10 d齡性別隨機(jī)的SD大鼠和33 d齡雄性SD大鼠，購于上海實(shí)驗(yàn)動物資源中心。大鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)級別為清潔級，條件如下：溫度（22±2）℃，濕度 55%±5%，光照條件為12/12 h晝夜交替（光照時間為 7：00至 19：00），動物可自由攝取水和食物。實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動物放置于實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)3 d。實(shí)驗(yàn)時，動物隨機(jī)分組，每組6只，行為學(xué)測定時，測定者對實(shí)驗(yàn)試劑單盲。大鼠IL-10中和性抗體購于R&D Systems（AF519），大鼠β-內(nèi)啡肽中和性抗體購于Phoenix Pharmaceuticals.Inc.（H-022-33），CTAP購于Abcam（ab120680）。

1.2 坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型構(gòu)建

主要參考Decosterd和Woolf在文獻(xiàn)中提出的方法進(jìn)行手術(shù)［9］。將10 d齡性別隨機(jī)的SD大鼠和33 d齡雄性SD大鼠使用異氟烷氣體吸入麻醉，麻醉后大鼠取側(cè)臥位固定，打開手術(shù)側(cè)股骨附近皮膚，向下打開股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其三個末梢：腓腸神經(jīng)、腓總神經(jīng)及脛神經(jīng)。坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷（spared nerve injury，SNI）模型大鼠將腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)用5-0絲線緊扎，剪除2～4 mm遠(yuǎn)端神經(jīng)，最后分兩層關(guān)閉肌肉和皮膚；假手術(shù)大鼠在暴露坐骨神經(jīng)及其末梢后不進(jìn)行結(jié)扎或剪斷，分兩層關(guān)閉肌肉和皮膚。

1.3 足底機(jī)械痛閾值測定

采用von Frey法檢測大鼠機(jī)械痛閾值。將大鼠放置于金屬網(wǎng)架和有機(jī)玻璃盒組成的檢測架上，待大鼠完全適應(yīng)環(huán)境后，采用連接15號測試?yán)w維（量程0.1～90 g）的電子足底機(jī)械痛閾測定儀（IITC Life Science Inc，Woodland Hill，CA，USA）垂直刺激大鼠足底中部。測定時逐漸增加力度，同時觀察大鼠是否有縮足反應(yīng)。記錄大鼠產(chǎn)生縮足反應(yīng)時儀器所顯示的作用力值，即為足底收縮閾值（paw withdrawal threshold）。重復(fù)測定3次，每次測定之間間隔5 min，3次測定的平均值即為最終機(jī)械痛閾值。

1.4 鞘內(nèi)注射給藥

大鼠吸入異氟烷短暫麻醉，用50 μL微量注射器針頭自L3-L4間隙穿刺進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔進(jìn)行注射。在大鼠SNI手術(shù)后7～9 d連續(xù)3 d進(jìn)行IL-10中和性抗體、β-內(nèi)啡肽中和性抗體或CTAP鞘內(nèi)注射，注射完成后1 h進(jìn)行機(jī)械痛閾值測定。

1.5 組織總RNA提取與熒光定量PCR

完成機(jī)械痛閾值測定后將動物處死，取脊髓腰膨大處組織用TRIzol（Invitrogen）法進(jìn)行總RNA提取。提取總RNA后采用微量分光光度計(jì)測定所得RNA濃度及A260/A280值，保證A260/A280在1.8～2.0之間以確保RNA純度。提取所得RNA采用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（Toyobo）在普通PCR儀（BioRad）中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

熒光定量PCR采用Mastercyclereprealplex（Eppendorf），按照 RealmasterMix（SYBR Green I；Toyobo）試劑盒提供的反應(yīng)體系和兩步法反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增和熒光定量。所用引物序列如下：5′-CCAAGGTCATCCATGACGAC-3′和 5′-TCCACAGTCTTCTGAGTGGC-3′（GAPDH）；5′-GGCTCAGCACTGCTATGTTGCC-3′和 5′-AGCATGTGGGTCTGGCTGACTG-3′（IL-10）；5′-CTTTCCGCGACAGAGCCT-3′和 5′-CCAGCTCCACACGTCTATGG-3′（β-內(nèi)啡肽前體阿黑皮素原，proopiomelanocortin，POMC）。根據(jù)熒光定量PCR儀所測定的Ct值［10］，以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）處理組-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）對照組。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Graphpad Prism 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計(jì)分析，每個實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以平均值±樣本平均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）表示。采用非配對t-檢驗(yàn)、單因素方差分析和雙因素重復(fù)方差分析分析不同處理組和不同因素下的數(shù)據(jù)是否有差異。當(dāng)差異顯著時，進(jìn)一步采用post hoc Student-Newman-Keuls分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNI手術(shù)引發(fā)成年與幼年大鼠機(jī)械痛超敏結(jié)果

為驗(yàn)證SNI手術(shù)能夠在成年大鼠中建立穩(wěn)定的疼痛模型而在幼年大鼠中不能引起明顯疼痛反應(yīng)這一觀點(diǎn)，我們分別檢測了出生33 d接受SNI手術(shù)和出生10 d接受SNI手術(shù)大鼠1周后的機(jī)械痛閾值，結(jié)果如圖1所示。出生33 d的成年大鼠在接受SNI手術(shù)7 d后，健側(cè)肢機(jī)械痛閾值為（22.7±2.6）g，術(shù)側(cè)肢閾值下降至健側(cè)的27%（P＜0.05；圖1A），而出生10 d的幼年大鼠在接受SNI手術(shù)7 d后，術(shù)側(cè)肢機(jī)械痛閾值相比于健側(cè)沒有明顯變化（圖1B）。

2.2 SNI手術(shù)誘導(dǎo)幼年大鼠術(shù)側(cè)脊髓IL-10和POMC mRNA升高

為了探究成年大鼠和幼年大鼠SNI術(shù)后脊髓抗炎因子和內(nèi)源性阿片樣肽的表達(dá)情況，我們?nèi)NI手術(shù)7 d后的大鼠脊髓腰膨大組織用實(shí)時熒光定量PCR方法測定了IL-10及POMC的mRNA表達(dá)水平。SNI手術(shù)7 d后，成年大鼠術(shù)側(cè)脊髓中IL-10 mRNA表達(dá)下降至健側(cè)的43%（P＜0.05；圖1C），而幼年大鼠術(shù)側(cè)脊髓IL-10 mRNA表達(dá)升高至健側(cè)的180%（P=0.12；圖1D）；成年大鼠術(shù)側(cè)脊髓POMC mRNA表達(dá)下降至健側(cè)的81%（P＜0.05；圖1E），而幼年大鼠術(shù)側(cè)脊髓POMC mRNA表達(dá)則升高至健側(cè)的240%（P＜0.05；圖1F）。

2.3 鞘內(nèi)中和IL-10或β-內(nèi)啡肽引發(fā)幼年大鼠機(jī)械痛超敏反應(yīng)

為探究幼年大鼠脊髓內(nèi)IL-10和β-內(nèi)啡肽高表達(dá)是否與其不發(fā)生機(jī)械痛超敏有因果關(guān)系，我們在幼年大鼠假手術(shù)或SNI造模7 d后，經(jīng)鞘內(nèi)注射連續(xù)3 d給予生理鹽水（10 μL）、IL-10中和性抗體（2 μg/10 μL）或β-內(nèi)啡肽中和性抗體（1∶5，10 μL），分別在給藥前和每天給藥后1 h檢測幼年大鼠的雙側(cè)機(jī)械痛閾值，結(jié)果如圖2。與假手術(shù)組相比，SNI手術(shù)并未明顯影響幼年大鼠術(shù)側(cè)的機(jī)械痛閾值。在SNI組中，與鞘內(nèi)注射IL-10抗體或β-內(nèi)啡肽抗體均不影響健側(cè)機(jī)械痛閾值（圖2A），但在第2天注射IL-10抗體或β-內(nèi)啡肽抗體大鼠的術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值分別下降至當(dāng)天生理鹽水組的34%和36%；第3天注射IL-10抗體或β-內(nèi)啡肽抗體大鼠的術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值分別下降至當(dāng)天生理鹽水組的41%和37%（P=0.0001；圖2B）。

2.4 鞘內(nèi)注射CTAP引發(fā)幼年大鼠機(jī)械痛超敏反應(yīng)

由于β-內(nèi)啡肽是μ-阿片受體內(nèi)源性激動劑［11］，我們采用了CTAP進(jìn)一步驗(yàn)證上述假說。在幼年大鼠SNI手術(shù)7 d后，經(jīng)鞘內(nèi)注射連續(xù)3 d給予生理鹽水（10 μL）或CTAP（4 μg/10 μL），分別在給藥前和每天給藥后1 h檢測雙側(cè)機(jī)械痛閾值。從圖3中可以看出，與鞘內(nèi)注射生理鹽水相比，注射CTAP不影響健側(cè)機(jī)械痛閾值（圖3A），但在注射的第2天術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值降低至當(dāng)天生理鹽水組的62%；第3天術(shù)側(cè)機(jī)械痛閾值降低至當(dāng)天生理鹽水組的38%（P＜0.0001；圖3B）。

2.5 SNI手術(shù)引起的幼年大鼠脊髓β-內(nèi)啡肽表達(dá)由IL-10調(diào)控

為探究SNI術(shù)后幼年大鼠脊髓IL-10和β-內(nèi)啡肽表達(dá)的關(guān)系，我們?nèi)〖偈中g(shù)或SNI術(shù)后7 d經(jīng)過連續(xù)3 d鞘內(nèi)注射生理鹽水、IL-10中和性抗體或β-內(nèi)啡肽中和性抗體幼年大鼠的脊髓腰膨大組織樣本，通過實(shí)時熒光定量PCR方法檢測其IL-10和POMC的mRNA表達(dá)。SNI大鼠脊髓IL-10 mRNA表達(dá)升高至假手術(shù)大鼠的178%（P＜0.05）。連續(xù)注射IL-10抗體或β-內(nèi)啡肽抗體均不影響SNI引起的IL-10 mRNA表達(dá)升高（圖4A）。同時，SNI大鼠脊髓POMC mRNA表達(dá)升高為假手術(shù)大鼠的169%（P=0.08）。連續(xù)注射β-內(nèi)啡肽抗體不影響SNI引起的POMC mRNA表達(dá)升高，但連續(xù)注射IL-10抗體則能拮抗這一作用（P=0.08；圖4B）。

圖1 坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷手術(shù)對成年和幼年大鼠機(jī)械痛閾值（A，B），脊髓IL-10（interleukin-10，IL-10）mRNA（C，D）和β-內(nèi)啡肽前體阿黑皮素原mRNA（E，F(xiàn)）表達(dá)的影響Fig.1 Impact of spared nerve injury（SNI）on mechanical paw withdrawal threshold（A and B），interleukin-10（IL-10）mRNA expression（C and D）and POMC mRNA expression（E and F）in infant rats and adult rats

3 討論

SNI手術(shù)可以快速造成成年大鼠機(jī)械痛超敏，在手術(shù)后2 h即會出現(xiàn)，維持時間達(dá)9周以上［9，12］，是一種穩(wěn)定的慢性疼痛動物模型。幼年接受SNI手術(shù)的大鼠則會表現(xiàn)出遲發(fā)性疼痛，即在手術(shù)后4周及以后才出現(xiàn)機(jī)械痛超敏［5，13］。本研究證實(shí)了成年大鼠術(shù)側(cè)后肢機(jī)械痛閾值在術(shù)后1周后顯著低于健側(cè)，而幼年大鼠術(shù)后1周術(shù)側(cè)后肢機(jī)械痛閾值與健側(cè)相比則沒有明顯變化，即幼年大鼠的神經(jīng)病理性疼痛處于被抑制的狀態(tài)。

圖2 假手術(shù)或SNI手術(shù)后連續(xù)鞘內(nèi)注射IL-10中和性抗體或β-內(nèi)啡肽中和性抗體對幼年大鼠后肢的機(jī)械痛閾值的影響Fig.2 Effect of constitutive injections of the IL-10 neutralizing antibody or β-endorphin neutralizing antibody on hindpaws in infants after sham of SNI surgery

圖3 假手術(shù)或SNI手術(shù)后連續(xù)鞘內(nèi)注射μ-阿片受體拮抗劑CTAP對幼年大鼠后肢的機(jī)械痛閾值的影響Fig.3 Effect of constitutive injections of the μ-opioid receptor antagonist CTAP on hindpaws in infants rats after sham of SNI surgery

目前很多研究表明成年大鼠在神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生后，外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生炎癥反應(yīng)，炎性因子如IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α表達(dá)升高［14-16］，抗炎因子IL-10表達(dá)下降［17］，小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)化［3，18］，而幼年大鼠在 SNI手術(shù)后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化、IL-10 mRNA和蛋白表達(dá)量升高［3，5］。本研究證實(shí)了SNI術(shù)后1周，成年大鼠術(shù)側(cè)脊髓與健側(cè)相比IL-10基因表達(dá)水平下降，而幼年大鼠的術(shù)側(cè)脊髓組織與健側(cè)或假手術(shù)組脊髓相比，IL-10基因表達(dá)水平明顯升高，說明幼年大鼠神經(jīng)病理性疼痛的抑制與IL-10表達(dá)密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性和外源性脊髓IL-10的鎮(zhèn)痛作用均由小膠質(zhì)細(xì)胞釋放β-內(nèi)啡肽介導(dǎo)［6］。IL-10激動IL-10受體及其下游轉(zhuǎn)錄因子STAT3能夠促進(jìn)POMC的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致β-內(nèi)啡肽分泌，激動突觸后膜μ-阿片受體產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。在本研究中，連續(xù)注射IL-10中和性抗體和β-內(nèi)啡肽中和性抗體均能夠在幼年大鼠SNI術(shù)側(cè)后肢引發(fā)機(jī)械痛超敏。同時檢測其脊髓的IL-10 mRNA和POMC mRNA表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，連續(xù)注射IL-10中和性抗體能夠基本拮抗SNI術(shù)后幼年大鼠脊髓中的POMC mRNA基因表達(dá)升高，而連續(xù)注射β-內(nèi)啡肽中和性抗體則對IL-10 mRNA的表達(dá)沒有影響。此結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室以前結(jié)果相吻合，即IL-10可升高小膠質(zhì)細(xì)胞β-內(nèi)啡肽表達(dá)，而β-內(nèi)啡肽不影響小膠質(zhì)細(xì)胞 IL-10［6，8］。由此我們認(rèn)為，在SNI手術(shù)后的幼年大鼠體內(nèi)，IL-10的表達(dá)促進(jìn)了下游β-內(nèi)啡肽的表達(dá)分泌，并由此抑制神經(jīng)病理性疼痛。

圖4 假手術(shù)或SNI手術(shù)后連續(xù)鞘內(nèi)注射IL-10中和性抗體或β-內(nèi)啡肽中和性抗體對幼年大鼠脊髓IL-10 mRNA和POMC mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of constitutive injections of the IL-10 and β-endorphin neutralizing antibodies on the gene expression of IL-10 mRNA and POMC mRNA in infant rats after sham of SNI surgery

β-內(nèi)啡肽作為一種內(nèi)源性阿片類物質(zhì)，具有很強(qiáng)的中樞和外周鎮(zhèn)痛作用［19］，與μ-阿片受體的親和力較強(qiáng)［20］。本研究中，鞘內(nèi)注射μ-阿片受體拮抗劑CTAP能夠在幼年SNI大鼠術(shù)側(cè)后肢引發(fā)機(jī)械痛超敏，進(jìn)一步說明了β-內(nèi)啡肽在幼年疼痛抑制中發(fā)揮的重要作用。另有研究表明，腦脊液β-內(nèi)啡肽含量會隨著年齡增長而降低，1～10歲兒童腦脊液β-內(nèi)啡肽含量明顯高于31～62歲成人［21］；血漿β-內(nèi)啡肽含量較低的幼兒更易發(fā)生驚跳反應(yīng)，運(yùn)動和感覺能力相較正常幼兒發(fā)展緩慢［22］，患有孤獨(dú)癥的兒童血漿β-內(nèi)啡肽水平顯著低于正常兒童，對疼痛也更加敏感［23］。因此我們認(rèn)為，幼兒體內(nèi)較高的β-內(nèi)啡肽水平可能是保證其神經(jīng)正常生長發(fā)育的重要因素。

IL-10和β-內(nèi)啡肽作為具有鎮(zhèn)痛作用的重要內(nèi)源性物質(zhì)，其在疼痛發(fā)生及疼痛治療中的作用已經(jīng)被大量研究報道，我們實(shí)驗(yàn)室率先發(fā)現(xiàn)了兩者的上下游關(guān)系，從而首次提出IL-10/β-內(nèi)啡肽通路假說［6-8］。本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)現(xiàn)，GLP-1受體激動劑艾塞那肽能夠激活大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞GLP-1受體/IL-10/β-內(nèi)啡肽信號通路，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用［7］。在本研究中，SNI手術(shù)同樣激活了幼年大鼠脊髓的IL-10/β-內(nèi)啡肽通路，抑制了其神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生，表明脊髓IL-10/β-內(nèi)啡肽通路可能介導(dǎo)多種生理性和藥理性鎮(zhèn)痛。

綜上所述，本研究分析了幼年大鼠SNI術(shù)后的行為學(xué)表現(xiàn)以及脊髓IL-10和β-內(nèi)啡肽基因表達(dá)，首次揭示了脊髓IL-10/β-內(nèi)啡肽通路抑制幼年大鼠SNI誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛。