曹 宸，余思菲，郭雪雪，周宇濤，李春煒，陳合新

（中山大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉醫(yī)院；2.中山醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東 廣州 510080）

鼻乳頭狀瘤是鼻腔鼻竇最常見的上皮組織性良性腫瘤，其中，鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤（nasal inverted papilloma，NIP）約占乳頭狀瘤的70%，約占全部鼻腔鼻竇腫瘤的0.5%～4.0%［1］；人群中，鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤的患病率為0.2/105至0.6/105，男女比例約為3∶1～5∶1［2］。內(nèi)翻性乳頭腫瘤（inverted papilloma，IP）多發(fā)于鼻腔外側(cè)壁和鼻中隔，主要侵犯上頜竇和篩竇，癥狀表現(xiàn)為鼻塞，流黏膿涕時帶血，伴有頭痛和嗅覺異常；其主要的臨床特征為：復(fù)發(fā)傾向（20%～47%）［3］，破壞周圍解剖結(jié)構(gòu)，與惡變相關(guān)（惡變率約為6%～13%）［1-4］。目前，NIP的具體致病機(jī)制及主要影響因素暫不明確，有學(xué)者提出腫瘤組織的慢性炎癥在該病發(fā)生發(fā)展過程中參與重要作用，局部上皮改變與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)［5］。因此，本研究擬通過對腫瘤組織局部炎癥細(xì)胞浸潤類型及程度進(jìn)行分析，探討NIP的臨床病理學(xué)特征與局部炎癥細(xì)胞表達(dá)相關(guān)性，為NIP發(fā)病機(jī)制中的慢性炎癥假說提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本實驗收集2016年6月至2018年6月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科住院的接受腫瘤切除術(shù)的50例NIP患者腫瘤組織；并收集接受單純鼻中隔偏曲矯正手術(shù)的20例患者鼻腔鼻竇粘膜作為正常對照組。NIP患者均接受鼻竇CT與鼻內(nèi)鏡檢查，并根據(jù)檢查結(jié)果進(jìn)行Krouse分級。其余臨床指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)包括：①吸煙：患者術(shù)前一年內(nèi)仍有吸煙行為，每日吸煙20根煙及以上；②復(fù)發(fā)：患者入院前接受鼻部腫物切除手術(shù)，術(shù)后病理診斷為內(nèi)翻性乳頭狀瘤；③伴發(fā)息肉：腫物切除術(shù)后病理診斷存在息肉樣變。④Krouse分級：Ⅰ級：腫物局限于鼻腔內(nèi)；Ⅱ級：腫瘤局限于篩竇、上頜竇內(nèi)側(cè)壁和中鼻道；Ⅲ級：腫瘤侵犯范圍至上頜竇外側(cè)壁和下壁并侵犯蝶竇、額竇；Ⅳ級：包括鼻腔鼻竇外侵犯或腫瘤惡變。 本研究已通過院倫理委員會批準(zhǔn)，病例組與正常對照組均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與實驗儀器

中性樹脂（懿洋，上海）、組織固定液（鼎國昌盛，北京）、檸檬酸抗原修復(fù)液（鼎國昌盛，北京）、蘇木素伊紅染色試劑盒（索萊寶，北京）、蘇木素染色液（索萊寶，北京）、Anti-Neutrophil Elastase antibody（Abcam，美國）、Anti-CD68 antibody（Abcam，美國）、Anti-CD4 antibody（Abcam，美國）、CD8α（C8/144B）（CST，美國）、APC/Cy7 anti-human CD3（biolegend，美國）、PerCP/Cy5.5 anti-human CD4（biolegend，美國）、FITC anti-human CD8（biolegend，美國）、APC anti-human IFN-γ（biolegend，美國）、過氧化物酶/DAB 兔/小鼠（DAKO，丹麥）、膠原酶Ⅰ（Sigma-Aldrich，美國）、DNA酶Ⅰ（Takara，日本）、淋巴細(xì)胞分離液（浩陽生物，天津）、細(xì)胞破膜固定試劑盒（BD，美國）、流式刺激劑與阻斷劑（Gibco，美國）、光學(xué)顯微鏡（Leica-SFL4000，德國）流式分析儀（Beckman Coulter-CytoFLEX，美國）、液相芯片分析系統(tǒng)（Luminex magpix，RD，美國）、多因子檢測試劑盒（Human luminex screening assay，RD，美國）。

1.3 實驗方法

HE染色：嗜酸性粒細(xì)胞觀察與計數(shù)采用HE染色法。染色方法：取腫瘤或鉤突粘膜組織于多聚甲醛中固定24 h后，脫水蠟塊包埋后連續(xù)切片，片厚5 μm。65°C烘片30 min；二甲苯脫蠟10 min；100%、95%、85%、75%乙醇各浸洗1 min；HE染色3 min；鹽酸乙醇分化30 s；2%稀氨水返藍(lán)30 s；伊紅染色3 min；階梯濃度乙醇浸洗脫水1 min；二甲苯10 min；中性樹脂封片。在400倍視野下觀察組織切片中嗜酸性粒細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)有均勻分布的嗜酸性顆粒，細(xì)胞核主要表現(xiàn)為雙葉核或多個圓核，隨機(jī)選取5個不同視野，計算陽性細(xì)胞平均數(shù)。

免疫組化染色：嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞均通過免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)與觀察。染色方法：取腫瘤或鉤突粘膜組織于多聚甲醛中固定24 h后，脫水蠟塊包埋后連續(xù)切片，片厚5 μm。第1天，65°C烘片30 min；二甲苯脫蠟10 min；100%、95%、85%、75%乙醇各浸洗1 min；檸檬酸鈉高壓熱修復(fù)15 min；100 mL/L羊血清封閉抗原0.5 h；一抗過夜；第2天，二抗孵育0.5 h后，DAB顯色5 min；蘇木素復(fù)染30 s；階梯濃度乙醇脫水1 min、二甲苯脫水10 min；中性樹脂封片后鏡下觀察。在400倍鏡視野下，隨機(jī)選取5個不同視野，計算陽性細(xì)胞平均數(shù)。

組織單核細(xì)胞分離：剪碎新鮮腫瘤或鉤突粘膜組織至1～2 mm，于膠原酶Ⅰ、DNA酶Ⅰ中37°C孵育40 min；消化組織混合液過100 μm濾網(wǎng)得細(xì)胞混合液；往淋巴細(xì)胞分離液上層緩慢加入細(xì)胞混合液，500×g，5 min離心，取中間單核細(xì)胞層；PBS清洗離心，得到組織分離單核細(xì)胞。

流式細(xì)胞染色：細(xì)胞表面染色：取組織單核細(xì)胞PBS重懸，4°C避光孵育流式表面抗體30 min；PBS清洗離心，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至106/mL，上機(jī)檢測。胞內(nèi)因子染色：取組織單核細(xì)胞PBS重懸，加入流式細(xì)胞刺激劑與阻斷劑37°C，體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下孵育6 h；PBS清洗離心重懸后進(jìn)行細(xì)胞表面染色；PBS清洗離心后進(jìn)行細(xì)胞破膜固定；4°C避光孵育流式胞內(nèi)因子抗體30 min；PBS清洗離心，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至106/mL，上機(jī)檢測。

IFN-γ蛋白表達(dá)水平：新鮮腫瘤組織與正常對照組織4°C勻漿，離心后收取上清液。按多因子蛋白檢測試劑盒Human luminex screening assay（RD，USA）說明進(jìn)行分步驟加樣；上機(jī)，利用液相芯片分析系統(tǒng)（Luminex magpix，RD，美國）檢測勻漿液中IFN-γ表達(dá)水平變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析處理。病例組與對照組兩組之間炎癥細(xì)胞及IFN-γ表達(dá)差異用曼-惠特尼U檢驗分析；NIP病例組內(nèi)Krouse分級與腫瘤復(fù)發(fā)特性相關(guān)性分析用卡方檢驗分析；不同程度臨床病理特征之間炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)差異性分析用曼-惠特尼U檢驗。雙側(cè)檢驗，取α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床表征情況

基線資料：通過耳鼻喉住院部收集NIP患者50例、正常對照組20例。NIP患者中，男41例，女9例；平均年齡 52（95%CI，41-60.5）歲；吸煙患者∶不吸煙患者=23∶27；初發(fā)患者31例，復(fù)發(fā)2次及以內(nèi)患者13例，復(fù)發(fā)2次以上患者6例。正常對照組中，男15例，女5例；平均年齡30.5（95%CI，26-39）歲，吸煙患者：不吸煙患者=17∶3；所有對照組均為初次入院。

鼻內(nèi)鏡檢查50例NIP患者中，45例表現(xiàn)為單側(cè)腫塊，5例表現(xiàn)為雙側(cè)，腫物表面均呈現(xiàn)粗糙不光滑樣改變；40例鼻腔粘膜可見水腫與大量粘液膿性分泌物，5例有粘液血性分泌物，余病例未見明顯鼻腔鼻竇分泌物。根據(jù)Koruse評分，術(shù)前鼻竇CT檢查提示，30例患者主要表現(xiàn)為KrouseⅡ級（篩竇、上頜竇內(nèi)側(cè)壁和中鼻道受累）；14例患者主要表現(xiàn)為KrouseⅢ級（上頜竇外側(cè)壁和下壁并侵犯蝶竇、額竇）；僅少數(shù)病例表現(xiàn)為KrouseⅠ級或KrouseⅣ級。術(shù)后病理檢查提示，16例患者伴同側(cè)息肉，1例患者伴發(fā)對側(cè)息肉生；所有NIP患者均伴有同側(cè)或雙側(cè)慢性鼻竇炎。

2.2 腫瘤局部炎癥細(xì)胞染色情況

對50例NIP病例組與20例正常對照組組織切片進(jìn)行HE染色與免疫組化染色與分析，可見NIP腫瘤組織局部可見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。HE染色提示：NIP患者表現(xiàn)為上皮組織高度增生伴不同程度鱗狀化生，上皮下間質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密，存在不同程度炎癥表現(xiàn)。

運用曼-惠特尼U檢驗分析每高倍視野下（400倍）炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)提示：相對于正常粘膜對照組，NIP組嗜酸性粒細(xì)胞（P＜0.001）、嗜中性粒細(xì)胞（P ＜0.001）、巨噬細(xì)胞（CD68+；P ＜0.001）、TH細(xì)胞（CD4+T淋巴細(xì)胞；P=0.005）數(shù)量均明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，TC細(xì)胞（CD8+T淋巴細(xì)胞；P=0.990）未見明顯差異性表現(xiàn)。NIP中，嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞主要聚集于增厚上皮內(nèi)與上皮下間質(zhì)近基底膜處；TH細(xì)胞與TC細(xì)胞主要浸潤于遠(yuǎn)離上皮間質(zhì)區(qū)域，呈大面積散在分布或不規(guī)則團(tuán)塊狀聚集（圖1），主要炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)見表1。

2.3 腫瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞表達(dá)情況

50例NIP組織與20例正常對照組織進(jìn)行局部淋巴細(xì)胞流式細(xì)胞學(xué)分析提示，相對于正常對照組，NIP組表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞比例升高，CD8+T淋巴細(xì)胞比例下降，CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值1.81，明顯高于正常對照組CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比值0.63（圖2）。

運用曼-惠特尼U檢驗比較NIP病例組與正常對照組內(nèi)CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞（TH1細(xì)胞）與CD8+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞（TC1細(xì)胞）表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)TH1細(xì)胞相對于正常對照組存在高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；TC1細(xì)胞相對于正常對照組未見明顯表達(dá)差異（圖3），流式細(xì)胞檢測局部T淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)見表2。

表1 NIP與正常對照組組織局部炎癥細(xì)胞浸潤程度組化分析Table 1 The Analysis of Immunohistochemical Cell Intensity in NIP and Controls

圖2 NIP組與正常對照組織中T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況及所占比例流式結(jié)果分析Fig.2 Expression and percentages of different T cells in nip and control samples by flow cytometry

圖3 NIP組與正常對照組中胞內(nèi)因子IFN-γ表達(dá)情況流式結(jié)果分析Fig.3 The cellular source of IFN-γ in NIP and control samples by flow cytometry

表2 NIP與正常對照組組織局部T淋巴細(xì)胞浸潤程度分析Table 2 The analysis of T cells in NIP and controls

圖4 NIP組與正常對照組組織中IFN-γ蛋白水平表達(dá)情況及NIP組內(nèi)復(fù)發(fā)組與非復(fù)發(fā)組中IFN-γ蛋白水平表達(dá)情況Fig.4 Expression of IFN-γ protein level in NIP and control samples，recurrence and non-recurrence in NIP

2.4 腫瘤局部炎癥細(xì)胞表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性分析

取30例NIP組與16例正常對照組組織勻漿液，用luminex magpix檢測勻漿液內(nèi)IFN-γ表達(dá)水平提示，NIP組相對于正常對照組，IFN-γ呈現(xiàn)明顯高表達(dá)；且NIP組內(nèi)初發(fā)組相對于復(fù)發(fā)組，IFN-γ表達(dá)呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

在不同程度NIP臨床病理特征（吸煙、伴發(fā)息肉、Krouse分級等）間比較腫瘤組織局部炎癥細(xì)胞（嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、TH1細(xì)胞、TC1細(xì)胞）浸潤程度，未發(fā)現(xiàn)明顯差異性。

NIP組內(nèi)Krouse分級與腫瘤復(fù)發(fā)特性相關(guān)性分析，未見明顯相關(guān)性（χ2=1.438，P=0.230）。

3 討論

NIP屬于良性上皮來源性腫瘤，被覆為分化良好的柱狀上皮或纖毛呼吸上皮，并伴有鱗狀上皮化生；上皮不同程度向腫瘤基質(zhì)層內(nèi)翻性生長，同時保持基底膜完整［6］。NIP的發(fā)生發(fā)展過程受到諸多因素影響，主要包括：人乳頭狀瘤病毒感染、EB病毒感染、慢性炎癥、吸煙飲酒等不良飲食習(xí)慣、環(huán)境污染等，目前該病主要致病原因及其發(fā)生發(fā)展機(jī)制暫不明確［7］。

國外學(xué)者通過對NIP與鼻竇局部炎癥關(guān)系研究認(rèn)為慢性炎癥是NIP發(fā)生發(fā)展的重要影響因素［8-9］。國內(nèi)外學(xué)者Suh、房高麗等學(xué)者發(fā)現(xiàn)NIP一般起源部位為鼻腔鼻竇慢性炎癥常見發(fā)生部位，且鼻息肉與NIP常發(fā)生于相同部位，較少起源于鼻中隔或下鼻甲，普通鼻竇CT往往難以明確區(qū)分炎性鼻息肉與瘤體組織［9-11］。Yoon等［12］學(xué)者通過對96例NIP患者術(shù)后病理分析發(fā)現(xiàn)，21.9%腫瘤伴有同側(cè)鼻息肉，且均伴有慢性鼻竇炎。在該病上皮與上皮下微結(jié)構(gòu)研究中，Zhao［5］、Roh等［13］學(xué)者發(fā)現(xiàn)腫瘤局部有大量炎癥細(xì)胞浸潤，主要浸潤細(xì)胞類型為中性粒細(xì)胞，且相對于鼻外翻型乳頭狀瘤與鼻嗜酸性乳頭狀瘤，NIP炎癥細(xì)胞浸潤更為明顯，局部慢性炎癥浸潤也為后續(xù)HPV病毒感染創(chuàng)造了有利局部微環(huán)境。有學(xué)者在研究內(nèi)翻性乳頭狀瘤復(fù)發(fā)相關(guān)因素中發(fā)現(xiàn)90%NIP附著處骨質(zhì)存在不同程度的骨炎與病理性骨重塑，鼻腔鼻竇慢性炎癥有助于腫瘤附近骨質(zhì)破壞，從而加速腫瘤對周圍組織結(jié)構(gòu)的入侵［14］。

本研究通過對NIP組織進(jìn)行染色分析，發(fā)現(xiàn)相對于正常對照組，嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞均有明顯高表達(dá)。該研究結(jié)果與之前Zhao等［5］學(xué)者在NIP中觀察結(jié)論一致。然而，本研究對炎癥細(xì)胞在腫瘤組織局部分布特征進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織不同區(qū)域主要浸潤細(xì)胞類型不一致：上皮及上皮下近基底膜基質(zhì)區(qū)域（遠(yuǎn)腫瘤根部區(qū)域）主要表現(xiàn)為嗜中性粒細(xì)胞浸潤；遠(yuǎn)基底膜基質(zhì)區(qū)域（近腫瘤根部區(qū)域）主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞團(tuán)塊狀浸潤。該現(xiàn)象產(chǎn)生原因暫時不明，但提示NIP在不同發(fā)生發(fā)展階段主要參與炎癥反應(yīng)類型不同。

本研究對NIP腫瘤組織內(nèi)單核細(xì)胞進(jìn)行流式染色分析，發(fā)現(xiàn)主要浸潤淋巴細(xì)胞類型為CD4+T淋巴細(xì)胞（TH細(xì)胞）及CD8+T淋巴細(xì)胞（TC細(xì)胞）。在腫瘤組織中，最主要淋巴細(xì)胞類型為TH細(xì)胞，而在正常對照組中，最主要淋巴細(xì)胞類型為TC細(xì)胞。進(jìn)一步對組織局部淋巴細(xì)胞分泌因子分析，發(fā)現(xiàn)TH細(xì)胞與TC細(xì)胞均可分泌γ-干擾素（IFN-γ），在NIP中，TH細(xì)胞為最主要IFN-γ因子細(xì)胞來源，且相對于正常對照組，TH1細(xì)胞（CD4+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞）呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，而TC1細(xì)胞（CD8+IFN-γ+T淋巴細(xì)胞）未見明顯變化。TH1淋巴細(xì)胞數(shù)目增多或功能亢進(jìn)可導(dǎo)致局部炎癥的慢性遷移及病理性損傷；IFN-γ高表達(dá)可活化巨噬細(xì)胞增強(qiáng)其吞噬病原體功能，同時可促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向TH1細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致慢性炎癥的持續(xù)進(jìn)行［15］。TC1細(xì)胞主要作用在于清除細(xì)胞內(nèi)病原體，TC1細(xì)胞通過釋放顆粒酶、穿孔素等細(xì)胞毒性分子進(jìn)入免疫突觸，通過分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子殺死攜帶靶抗原的的細(xì)胞，從而加速對胞內(nèi)病原體的先天性與適應(yīng)性免疫反應(yīng)［16］。腫瘤組織內(nèi)TC1細(xì)胞相對于正常對照組未存在顯著高表達(dá)，提示NIP組織局部以細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的粘膜炎癥不是主要的炎癥反應(yīng)。

針對慢性炎癥在NIP發(fā)生發(fā)展過程中參與的作用，目前主要有“炎癥微環(huán)境”與“腫瘤占位”兩類假說［9］。在“炎癥微環(huán)境”理論中，慢性炎癥微環(huán)境為組織內(nèi)病毒感染與復(fù)制或微生物的入侵創(chuàng)造了有利的生存條件，病毒或微生物致癌基因的表達(dá)與炎癥因子的分泌可參與異常腫瘤形成過程；“腫瘤占位”理論中，單側(cè)的腫瘤占位性阻塞可導(dǎo)致鼻腔鼻竇引流不暢引起同側(cè)粘膜炎癥，產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)同時作用于雙側(cè)鼻腔鼻竇，從而引起雙側(cè)慢性鼻竇炎的發(fā)生，該現(xiàn)象與本研究中單側(cè)NIP患者往往伴有雙側(cè)鼻腔鼻竇炎癥現(xiàn)象一致。

本研究也對NIP患者臨床特征與組織病理學(xué)變化之間關(guān)系進(jìn)行了分析探討。NIP具有明顯復(fù)發(fā)特性，以往研究報道復(fù)發(fā)率可達(dá)29.2%～62%［17-18］。本研究中，復(fù)發(fā)患者占38%，初發(fā)患者占62%。后期對局部組織勻漿上清液中IFN-γ蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，NIP組相對于正常對照組呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，NIP組內(nèi)初發(fā)組相對于復(fù)發(fā)組呈現(xiàn)明顯高表達(dá)，提示NIP的發(fā)生機(jī)制可能與局部IFN-γ表達(dá)有關(guān)，IFN-γ低表達(dá)可能與腫瘤復(fù)發(fā)特性有關(guān)。然而，其他臨床病理特征（吸煙、飲酒、伴發(fā)息肉、Krouse分級等）與鼻內(nèi)翻性乳頭狀瘤局部炎癥細(xì)胞浸潤程度無明顯相關(guān)性，且腫瘤占位性阻塞程度特征（Krouse分級）與腫瘤復(fù)發(fā)特性未見明顯相關(guān)性，該研究結(jié)果與之前新加坡學(xué)者Zhao等［5］研究結(jié)果相一致。鑒于本研究未收集復(fù)發(fā)患者初發(fā)標(biāo)本，復(fù)發(fā)與初發(fā)組織均來源于不同個體，因此不能完全排除局部慢性炎癥對該病其余臨床病理特性的影響。Krouse分級系統(tǒng)是一種常見額CT分期系統(tǒng)，主要為臨床醫(yī)生在手術(shù)路徑的選擇與預(yù)后治療提供相應(yīng)指導(dǎo)。本研究暫未發(fā)現(xiàn)局部炎癥細(xì)胞浸潤程度與Koruse分級之間有明顯相關(guān)性。

NIP致病原因及發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍不明確，本研究通過對腫瘤局部炎癥細(xì)胞浸潤程度與分布特征進(jìn)行分析，為NIP致病原因中慢性炎癥假說提供了一定的理論依據(jù)。然而，炎癥細(xì)胞及因子在NIP發(fā)生發(fā)展過程中參與的具體調(diào)控機(jī)制仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究與探討。