杜 柳，何 苗，王 曄，林少賓，林美芳，謝紅寧

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.超聲醫(yī)學(xué)科，2.婦產(chǎn)科，廣東廣州510080）

持續(xù)性左上腔靜脈是最常見(jiàn)的體循環(huán)靜脈系統(tǒng)異常，產(chǎn)前超聲檢出率約0.5%～1.1%［1］。研究顯示持續(xù)性左上腔靜脈與染色體異常相關(guān)性高，約13%合并染色體異常，最常見(jiàn)的是18-三體綜合征及21-三體綜合征［2］。我們的前期研究結(jié)果表明持續(xù)性左上腔靜脈在染色體異常胎兒中的檢出率是染色體正常胎兒的27.5倍［1］。近年來(lái)的研究認(rèn)為持續(xù)性左上腔靜脈胎兒合并的其他心內(nèi)外畸形與染色體異常的相關(guān)性更高［2-3］。因此，建議當(dāng)持續(xù)性左上腔靜脈伴有其他心內(nèi)外畸形時(shí)行侵入性產(chǎn)前診斷。傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析技術(shù)可以在產(chǎn)前檢測(cè)胎兒染色體數(shù)目異常和大片段結(jié)構(gòu)異常，但其分辨率較低，無(wú)法判斷染色體上微小片段的缺失及重復(fù)異常，另外此技術(shù)需要培養(yǎng)細(xì)胞且結(jié)果分析依賴(lài)于檢驗(yàn)人員的水平。染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis，CMA）能夠在全基因組水平上進(jìn)行掃描，可檢測(cè)染色體不平衡畸變，包括染色體非整倍體、染色體微缺失或微重復(fù)，以及亞端?；蚱渌黄胶獾娜旧w重排，具有更高的分辨率（達(dá)0.05 Mb），可檢測(cè)到常規(guī)染色體核型分析無(wú)法檢測(cè)的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNV），并且能夠精確定位復(fù)雜易位及來(lái)源［4］。目前已應(yīng)用于先天畸形的產(chǎn)前診斷以及胚胎發(fā)育的機(jī)制研究，相關(guān)研究表明在產(chǎn)前超聲診斷先天性心臟病而染色體核型正常的胎兒中，應(yīng)用CMA進(jìn)行分子遺傳學(xué)分析可進(jìn)一步檢出7%具有臨床意義的微缺失或微重復(fù)綜合征［5-6］，但關(guān)于持續(xù)性左上腔靜脈胎兒的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究探討CMA在持續(xù)性左上腔靜脈胎兒、特別是染色體核型正常病例中的臨床應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)CNV涉及的基因進(jìn)行分析，為產(chǎn)前診斷及遺傳學(xué)咨詢提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年1月至2016年12月于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胎兒系統(tǒng)性超聲篩查提示持續(xù)性左上腔靜脈且在我院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)一步行常規(guī)染色體核型分析和CMA檢測(cè)的病例納入本研究。所有行侵入性產(chǎn)前診斷的病例均接受檢測(cè)前的遺傳咨詢并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 超聲檢查儀器及方法

1.2.1 檢查儀器 采用Voluson E6及Voluson E8（GE，Kretztechnik，Austria）三維彩色多普勒超聲診斷儀，經(jīng)腹部三維超聲容積探頭（4～8 MHz）。

1.2.2 檢查方法 常規(guī)系統(tǒng)掃查胎兒全身及附屬結(jié)構(gòu)，根據(jù)胎兒雙頂徑、頭圍、腹圍、股骨長(zhǎng)度等生物測(cè)量指標(biāo)結(jié)合停經(jīng)史及早孕期超聲檢查結(jié)果判斷孕周。觀察胎兒頭顱、胸腔、腹腔臟器及四肢結(jié)構(gòu)，記錄胎兒全身結(jié)構(gòu)聲像特征。對(duì)可疑胎兒心臟血管異常病例由2名具有5年以上產(chǎn)前超聲診斷經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)家針對(duì)胎兒心臟進(jìn)行專(zhuān)項(xiàng)檢查并做出診斷。胎兒心臟超聲檢查依據(jù)國(guó)際婦產(chǎn)科超聲學(xué)會(huì)頒布的胎兒超聲心動(dòng)圖操作指南進(jìn)行專(zhuān)項(xiàng)檢查［7］。

1.2.3 胎兒持續(xù)性左上腔靜脈的超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)間接征象：四腔心切面顯示左心房外側(cè)壁近房室交界處可見(jiàn)一圓形無(wú)回聲區(qū)，探頭稍向心底側(cè)偏轉(zhuǎn)則可顯示擴(kuò)張的冠狀靜脈竇。直接征象：三血管-氣管切面顯示動(dòng)脈導(dǎo)管的左側(cè)可見(jiàn)一圓形的血管橫切面。以此血管為中心旋轉(zhuǎn)探頭90°顯示其長(zhǎng)軸切面，通過(guò)冠狀靜脈竇引流入右心房。

1.3 侵入性產(chǎn)前診斷

1.3.1 標(biāo)本的采集 依據(jù)孕周大小，在超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)（孕16～24周）抽取羊水30 mL或臍靜脈穿刺術(shù)（孕＞24周）抽取臍血3 mL。

1.3.2 染色體核型分析 對(duì)胎兒的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、制片、G顯帶，按照人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行G顯帶染色體核型分析診斷，顯微鏡下檢查20個(gè)核型，分析3個(gè)核型，若出現(xiàn)嵌合體則檢查50個(gè)或100個(gè)核型。

1.3.3 CMA檢測(cè) 采用美國(guó)Affymetric公司提供的高分辨率全基因組CytoScan HD芯片。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照Affymetric公司提供的操作流程。該芯片不僅能檢測(cè)基因組缺失、重復(fù)，還能檢測(cè)雜合性缺失和單親二倍體。

1.3.4 CNV的判斷和評(píng)價(jià) 參照本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)及在線公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)，如DGV數(shù)據(jù)庫(kù)、DEFCIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)等?？截悢?shù)變異分為3種類(lèi)型：致病性、良性和臨床意義不明（variants of unknown significance，VOUS）［8］。

1.4 分組方法

根據(jù)是否合并其他超聲軟指標(biāo)及結(jié)構(gòu)異常，分為單純組及合并異常組。合并的心內(nèi)異常包括除外持續(xù)性左上腔靜脈的其他心臟畸形、血管變異，心外異常包括各系統(tǒng)臟器的結(jié)構(gòu)畸形及超聲軟指標(biāo)異常。超聲軟指標(biāo)包括枕后皮層增厚、鼻骨缺損或發(fā)育不良、側(cè)腦室增寬、后顱窩池增寬、脈絡(luò)膜叢囊腫、腸管回聲增強(qiáng)、腎盂積液、單臍動(dòng)脈、長(zhǎng)骨短、髂骨翼角增寬等。

1.5 隨訪

所有病例根據(jù)孕婦及家屬意愿選擇繼續(xù)妊娠、終止妊娠或選擇性減胎。出生病例追蹤其手術(shù)或其他影像學(xué)檢查情況，存活者持續(xù)隨訪；引產(chǎn)病例追蹤大體結(jié)構(gòu)及病理結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的資料以中位數(shù)（P25～P75）表示，計(jì)數(shù)資料用頻率及百分率表示。核型分析與CMA檢測(cè)染色體異常的檢出率差異、單純組與合并異常組染色體異常的檢出率差異、染色體正常組與異常組合并的各類(lèi)心內(nèi)外異常率的差異比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

2014年1月至2016年12月于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胎兒系統(tǒng)性超聲篩查提示持續(xù)性左上腔靜脈胎兒201例，其中81例行進(jìn)一步侵入性產(chǎn)前診斷（常規(guī)染色體核型分析和CMA檢測(cè)）的病例納入研究。孕婦的中位年齡為29（27～35）歲，年齡最小值、最大值分別為20歲、43歲；產(chǎn)前診斷的中位孕周為24（21～27）周，孕周最小值、最大值分別為17、33周。

2.2 核型分析與CMA檢測(cè)結(jié)果的比較

常規(guī)核型分析檢出15例（18.5%，15/81）染色體核型異常，包括5例21-三體綜合征，1例18-三體綜合征，1例13-三體綜合征，1例45X［34］/47XXX［16］，7例其他染色體異常。66例（81.5%，66/81）染色體核型正常。核型異常胎兒的超聲特征見(jiàn)表1。

在15例核型異常病例中，CMA檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果一致，并精確定位了染色體缺失/重復(fù)的位點(diǎn)。而在66例核型正常病例中，CMA額外檢出4例（6.1%，4/66）含致病性CNV，4例（6.1%，4/66）含VOUS。CNV的片段大小從155 kb到9.09 Mb不等（表2）。CMA共檢出19例（23.5%，19/81）含致病性CNV，兩種檢測(cè)方法染色體異常的檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（18.5%vs.23.5%，P=0.44）。

2.3 單純組和合并異常組病例染色體核型和CMA研究

81例胎兒中，12例（14.8%，12/81）為單純組病例，69例（85.2%，69/81）為合并異常組病例，其中8例（9.9%，8/81）合并其他心臟異常，29例（35.8%，29/81）合并心外異常，32例（39.5%，32/81）合并其他心臟及心外異常。

單純組中僅1例染色體異常（47，XX，del（18）（p11.2），+mar），檢出率為8.3%（1/12）；合并異常組中染色體異常的檢出率為26.1%（18/69），其中14例核型分析及CMA檢測(cè)結(jié)果均異常，4例（7.5%，4/53）僅CMA檢出致病性CNV。兩組間染色體異常的檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（26.1%vs.8.3%，P=0.277）。

合并異常組中，心內(nèi)異常以室間隔缺損為主，心外異常以超聲軟指標(biāo)異常為主。房室間隔缺損、顏面部畸形和多發(fā)超聲軟指標(biāo)異常在染色體異常胎兒中的檢出率顯著高于染色體正常胎兒（P=0.030，P=0.012，P=0.014，表3）。

表1 15例染色體核型異常胎兒合并心內(nèi)心外異常的超聲表現(xiàn)Table 1 Characteristics of 15 PLSVC fetuses with abnormal karyotypes

2.4 妊娠結(jié)局及隨訪情況

81例胎兒中，4例失訪（4.9%，4/81）；2例（2.4%，2/81）胎死宮內(nèi)；34例（42.0%，34/81）終止妊娠，其中染色體異常者18例，合并結(jié)構(gòu)畸形16例；41例（50.6%，41/81）出生，其中2例嬰幼兒因合并畸形死亡，余均存活至今未見(jiàn)明顯不良預(yù)后。

3 討論

3.1 持續(xù)性左上腔靜脈胎兒與染色體核型異常

持續(xù)性左上腔靜脈與染色體異常有相關(guān)性，約13%的持續(xù)性左上腔靜脈胎兒合并染色體核型異常［2-3］。本研究染色體核型異常的檢出率為18.5%，最常見(jiàn)的是21-三體綜合征。較之前報(bào)道的檢出率高，其主要原因可能是本中心在前期研究的基礎(chǔ)上，常規(guī)推薦超聲檢出合并其他結(jié)構(gòu)畸形或血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的高危人群行進(jìn)一步侵入性產(chǎn)前診斷，導(dǎo)致本研究的單純組病例以及低危人群所占比例較低。然而，傳統(tǒng)的染色體核型分析僅可檢出染色體非整倍體異常及大片的的染色體結(jié)果異常。染色體微陣列分析技術(shù)能夠在全基因組水平上進(jìn)行掃描，具有更高的分辨率（達(dá)0.05Mb），可檢測(cè)到常規(guī)染色體核型分析無(wú)法檢測(cè)的拷貝數(shù)變異，提高臨床相關(guān)微缺失或微重復(fù)綜合征的檢出率，有助于揭示部分先天性畸形的遺傳性病因［4］。

表2 含致病性CNV（例16-19）及VOUS（例20-23）胎兒CMA結(jié)果及超聲特征Table 2 Characteristics of PLSVC fetuses with pathogenic CNV（cases 16-19）or VOUS（cases 20-23）detected by CMA among the 52 fetuses with normal karyotypes

3.2 持續(xù)性左上腔靜脈胎兒與拷貝數(shù)變異

近年來(lái)CMA逐漸應(yīng)用于先天畸形的產(chǎn)前診斷，研究顯示在超聲檢出結(jié)構(gòu)畸形且染色體核型正常的胎兒中，CMA可進(jìn)一步檢出6-16%具有臨床意義的染色體微缺失或微重復(fù)綜合征［4，6］。Donnelly等［9］對(duì)產(chǎn)前超聲診斷結(jié)構(gòu)畸形的胎兒進(jìn)行分類(lèi)研究，同樣證實(shí)CMA較傳統(tǒng)核型分析顯著增加了染色體異常的檢出率，且先天畸形的種類(lèi)以心臟畸形為主（15.6%）。美國(guó)婦產(chǎn)科醫(yī)師指南（ACOG）指出，當(dāng)超聲發(fā)現(xiàn)胎兒一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)異常時(shí)，建議產(chǎn)前診斷行CMA檢測(cè)，以替代常規(guī)染色體核型分析［10］。一項(xiàng)系統(tǒng)綜述顯示CMA在核型正常的先心病胎兒中額外檢出染色體異常率為7.0%，在單純組病例中額外檢出率為3.4%［5］。然而，目前僅有一篇病例報(bào)道一例持續(xù)性左上腔靜脈并雙側(cè)多囊腎發(fā)育不良的胎兒行傳統(tǒng)核型分析未見(jiàn)異常，CMA進(jìn)一步檢測(cè)出17q12區(qū)域的1.93 Mb缺失，可能由于該區(qū)域涉及HNF1B基因通過(guò)與CREBBP相互作用而影響心臟結(jié)構(gòu)的表型異常［11］。本研究首次探討CMA在持續(xù)性左上腔靜脈胎兒中的臨床應(yīng)用，并分析了持續(xù)性左上腔靜脈胎兒中致病性CNV與產(chǎn)前超聲表現(xiàn)的關(guān)系。

表3 染色體異常（核型異常及含致病性CNV）與染色體正常胎兒合并心內(nèi)外異常的情況Table 3 The numbers and types of intracardiac and extracardiac sonographic anomalies among PLSVC fetuses with abnormal genetic test results（abnormal karyotypes or normal karyotypes with pathogenic CNV）and normal genetic test results ［n（%）］

本研究顯示CMA在核型正常的持續(xù)性左上腔靜脈胎兒中可進(jìn)一步檢出4例（6.1%）致病性CNV，將染色體異常的總體檢出率提高至23.5%。1例22q11.2微缺失綜合征（例16），其中法洛四聯(lián)癥及右位主動(dòng)脈弓與22q11.2缺失綜合征的相關(guān)性已有報(bào)道，但持續(xù)性左上腔靜脈與22q11.2缺失綜合征的相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道［12-13］。1例（例17）在Yq11.223q11.23區(qū)域檢出3.433 MB重復(fù)，該區(qū)域涉及DAZ基因。DEFCIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)中有該重復(fù)區(qū)域的病例報(bào)道。這些病例表現(xiàn)出多種表型，包括特殊面容、智力低下和上呼吸道異常，但未見(jiàn)與先天性心臟病相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。1例（例18）檢出2個(gè)致病性CNV：7q361q33.3區(qū)域檢出9.09Mb重復(fù)，12q24.33區(qū)域檢出1.289 Mb缺失。該微重復(fù)與微缺失與已知的綜合征無(wú)關(guān)，但包含許多基因，如 XRCC2、DPP6、DNAJB6、LMBR1、WDR60、PRKAG2、P2RX2、POLE1和 ANKLE2。由于涉及的染色體片段較大，不能排除染色體疾病的一般臨床表現(xiàn)，包括先天性畸形、智力低下和生長(zhǎng)遲緩。1例（例19）Xp11.4區(qū)域檢出249 kb缺失，該區(qū)域涉及CASK基因。CASK基因功能缺失突變或缺失/重復(fù)的表型類(lèi)似，包括中至重度精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育不良、低血壓、言語(yǔ)及行動(dòng)缺乏［14］。另外還有一些特征性的結(jié)構(gòu)畸形，包括嚴(yán)重的小頭畸形伴有腦橋和小腦發(fā)育不良，寬鼻橋，大耳朵，長(zhǎng)人中，小下頜，眼距過(guò)寬［14］。該病例的產(chǎn)前超聲表型與相關(guān)報(bào)道的臨床表型較一致，但持續(xù)性左上腔靜脈與該基因的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

3.3 合并異常組與染色體異常的關(guān)系

此外，染色體核型的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)單純性持續(xù)性左上腔靜脈胎兒中核型異常的檢出率較低，大多數(shù)染色體核型異常病例常合并其他心臟和/或心外畸形［3］。但此研究結(jié)果并不表明不建議單純組病例行侵入性產(chǎn)前診斷，特別是隨著微陣列分析技術(shù)的快速發(fā)展。目前僅有個(gè)例報(bào)道表明在持續(xù)性左上腔靜脈胎兒合并其他結(jié)構(gòu)畸形時(shí)CMA可進(jìn)一步檢出染色體異常，單純組病例中CMA是否有臨床應(yīng)用價(jià)值尚無(wú)相關(guān)報(bào)道［2］。本研究將病例分為兩組，進(jìn)一步比較單純組與合并異常組中染色體異常的檢出率差異。研究結(jié)果顯示合并異常組與單純組染色體異常的檢出率差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但CMA僅在合并異常組中發(fā)現(xiàn)核型分析未檢出的致病性CNV。另外，在合并異常組中，心內(nèi)異常以室間隔缺損為主，心外異常以超聲軟指標(biāo)異常為主。房室間隔缺損、顏面部畸形和多發(fā)超聲軟指標(biāo)異常在染色體異常胎兒中的檢出率顯著高于染色體正常胎兒。

綜上所述，CMA在持續(xù)性左上腔靜脈胎兒中具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值，特別是產(chǎn)前超聲檢出合并其他結(jié)構(gòu)異常時(shí)，CMA可檢測(cè)出常規(guī)核型分析難以檢出的微缺失和微重復(fù)綜合征，提高染色體異常的檢出率，并可在染色體上進(jìn)行精確定位，為產(chǎn)前遺傳學(xué)咨詢提供重要依據(jù)。但由于基因的不完全外顯性、印跡基因或修飾劑的作用、隱性基因突變和位置效應(yīng)等復(fù)雜機(jī)制，仍難以明確部分CNV或候選基因與臨床表型的相關(guān)性。