許家瑞，劉冬冬，李貝貝，陳夢(mèng)麟，汪 灣，黃凱鈴，鄭周霞，徐建華

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院//廣東省中醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東 廣州 510120；2.廣州萬德基因醫(yī)學(xué)科技有限公司，廣東 廣州 510535；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)順德醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

乳腺癌是女性中最常見的一種惡性腫瘤，據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌發(fā)病率一直居女性各類惡性癌癥之首，且呈逐年上升趨勢(shì)，其死亡人數(shù)也在不斷增加［1-3］，盡管手術(shù)、放化療等治療使乳腺癌患者的長(zhǎng)期生存率有所提高，但乳腺癌患者的死亡率仍在升高。早期乳腺癌不具備典型癥狀和體征，不易引起病人重視，往往容易漏診。因此，早期診斷乳腺癌對(duì)乳腺癌的治療具有重要意義。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的特異性分子靶點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸。lncRNA曾被認(rèn)為不具有生物學(xué)功能，然而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA能在基因組印記、染色質(zhì)修飾與重塑、轉(zhuǎn)錄激活與干擾和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)壬飳W(xué)進(jìn)程發(fā)揮重要調(diào)控作用［4］，并在各類癌癥中起著重要的調(diào)節(jié)作用［5］。目前已有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中，存在lncRNA表達(dá)的異常改變，提示lncRNA可作為乳腺癌潛在診斷標(biāo)志物，這對(duì)乳腺癌藥物選擇以及治療方法的尋找等方面具有重要意義［6-7］。本研究旨在發(fā)現(xiàn)乳腺癌生存期相關(guān)特異性表達(dá)lncRNA及其共表達(dá)基因，并通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，使其在乳腺癌細(xì)胞T47D中穩(wěn)定過表達(dá)和干擾，為進(jìn)一步研究長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人乳腺癌細(xì)胞株T47D由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研究所鄧敏教授實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen公司；嘌呤霉素Puromycin購(gòu)自Invivogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TAKARA公司；2X PowerUp SYBR Green Master Mix購(gòu)自Thermo公司；PCR引物由上海生工生物設(shè)計(jì)合成；過表達(dá)、干擾及對(duì)照質(zhì)粒pCDH-CMV-MCSEF1-copGFP、pLent-U6-GFP-puro購(gòu)自美國(guó) Vigene公司。Opti-MEM、轉(zhuǎn)染試劑LipofactamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Biomiga公司。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選差異表達(dá)lncRNA與共表達(dá)基因

課題組從癌癥基因圖譜（The Cancer GenomeAtlas，TCGA）下載乳腺癌數(shù)據(jù)，包括轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（RNA-seq）和臨床生存數(shù)據(jù)；經(jīng)單因素COX和Log Rank分析找到與生存期相關(guān)的lncRNA。通過lncRNA相關(guān)性分析，得到正相關(guān)的調(diào)控基因用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)見表1。

表1lncRNA-MAPT-AS1及其靶基因引物序列Table 1 lncRNA-MAPT-AS1 and its target gene primer sequences

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選

用含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞T47D；當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按2 mL/孔將細(xì)胞鋪于6孔板中，實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照（negative control，NC）組，轉(zhuǎn)染過表達(dá)空質(zhì)粒Empty vector和干擾空質(zhì)粒shRNA-NC）組，過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染重組過表達(dá)質(zhì)粒MAPT-AS1 vector）和4個(gè)干擾組（轉(zhuǎn)染shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4干擾質(zhì)粒）。質(zhì)粒（2 μg）與轉(zhuǎn)染試劑LipofactamineTM2 000（5 μL）進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率（質(zhì)粒帶綠色熒光），轉(zhuǎn)染后用最佳濃度嘌呤霉素（0.5 μg/mL）進(jìn)行篩選，連續(xù)培養(yǎng)1周，進(jìn)行傳代直至獲得穩(wěn)定細(xì)胞株，此后用含0.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

1.4 驗(yàn)證穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株內(nèi)lncRNA-MAPT-AS1及其靶基因的表達(dá)水平

收集7組篩選后的穩(wěn)轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞，用Trizol分別提取總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件設(shè)置如表2。經(jīng)羅氏Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測(cè)，以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。每組樣品重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)工作經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 5軟件統(tǒng)計(jì)分析并作圖，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，RNA-seq數(shù)據(jù)分析使用單因素COX和Log Rank分析，各組之間比較用單因素方差分析，P值均為雙邊檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌差異表達(dá)lncRNA與共表達(dá)基因篩選

我們分析了943例RNA-seq數(shù)據(jù)信息：（837例乳腺癌患者+106例正常對(duì)照），經(jīng)單因素COX和Log Rank分析找到與生存期相關(guān)的lncRNA，找到了顯著性最高的長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1；發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1高表達(dá)，預(yù)測(cè)乳腺癌患者生存期更長(zhǎng)（圖1A）。通過lncRNA相關(guān)性分析，找出正相關(guān)的調(diào)控基因共14個(gè)（表3）。選擇相關(guān)性最高的前5個(gè)基因（圖1B-F）用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表3MAPT-AS1正相關(guān)調(diào)控基因Table 3 MAPT-AS1 positive correlation regulatory genes

圖1MAPT-AS1與共表達(dá)基因Fig.1 MAPT-AS1 and co-expressed genes

2.2 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證及長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1干擾片段篩選

轉(zhuǎn)染效率如圖2所示，可見轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，以此條件繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染過表達(dá)長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株內(nèi)長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的相對(duì)表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001；圖2C），表明篩選的細(xì)胞株為穩(wěn)定過表達(dá)長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的乳腺癌細(xì)胞株T47D。轉(zhuǎn)染不同干擾片段后長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的相對(duì)表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05；圖2D），結(jié)果顯示shRNA3干擾效果最好。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株內(nèi)長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1共表達(dá)基因的表達(dá)水平

本研究選取預(yù)測(cè)結(jié)果中表達(dá)量最高的5個(gè)共表達(dá)基因：MAPT（microtubule associated protein tau）、MAPT-IT1（MAPT intronic transcript 1）、SPPL2C（signal peptide peptidase like 2C）、KDM4B（lysine demethylase 4B）、NXNL2（nucleoredoxin like 2）進(jìn)行驗(yàn)證，在乳腺癌細(xì)胞T47D中預(yù)先轉(zhuǎn)染MAPTAS1干擾片段shRNA3和干擾對(duì)照shRNA-NC，再進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示：MAPT、MAPT-IT1和NXNL2在轉(zhuǎn)染了shRNA3干擾片段后相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05，圖3），與長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的表達(dá)趨勢(shì)一致，SPPL2C未見表達(dá)。

圖2 乳腺癌細(xì)胞株T47D轉(zhuǎn)染長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1效率驗(yàn)證及其過表達(dá)和干擾的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Efficiency verification and overexpression and interference relative expression of breast cancer cell line T47D transfected with lncRNA-MAPT-AS1

圖3 長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1共表達(dá)基因表達(dá)水平Fig.3 lncRNA-MAPT-AS1 co-expression gene expression level

3 討論

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)篩選乳腺癌患者差異表達(dá)lncRNA，經(jīng)單因素COX和Log Rank分析找到與生存期相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)了顯著性最高的長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1。通過LncRNA相關(guān)性分析，找出正相關(guān)的調(diào)控基因，選擇相關(guān)性最高的前5個(gè)基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。熒光顯微鏡可見轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%以上，RT-qPCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1過表達(dá)及干擾穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株T47D，并篩選出干擾效率最高的長(zhǎng)非編碼MAPTAS1干擾片段sh-RNA3。RT-qPCR驗(yàn)證長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1共表達(dá)基因，得到MAPT、MAPT-IT1和NXNL2在轉(zhuǎn)染了shRNA3干擾片段后表達(dá)量降低，與長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1的表達(dá)趨勢(shì)一致，結(jié)果顯示，長(zhǎng)非編碼MAPT-AS1在乳腺癌患者中高表達(dá)，可能具有致癌作用。

近年來，研究者發(fā)現(xiàn)MAPT表達(dá)增加可能與帕金森?。≒D）疾病狀態(tài)有關(guān)，而MAPT-AS1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）為MAPT的潛在表觀遺傳調(diào)節(jié)因子［8］；MAPT-AS1、SPPL2C、MAPT、MAPTIT1、CRHR1、MGC57346、CRHR1-IT1、STH和KANSL1這些基因中的一個(gè)或多個(gè)的單倍不足可能是導(dǎo)致Koolen de Vries綜合征（KDVS；MIM 610443）表型的原因［9］。MAPT-AS1過表達(dá)可部分保護(hù)MAPT不被降解，而MAPT-AS1敲低可降低MAPT的表達(dá)，同時(shí)也降低了MAPT的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)MAPT-AS1在年齡較?。ǎ?0），腫瘤較大（≥2 cm），轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和分期（Ⅲ-Ⅳ）的ER陰性患者中表達(dá)較高，并與細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲性和紫杉醇抗性相關(guān)，可作為ER陰性乳腺癌的潛在治療靶點(diǎn)［10］。MAPT變體可能與家族性和散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）和額顳葉變性（FTLD）的發(fā)生相關(guān)［11］。系統(tǒng)性硬化癥（SSc）相關(guān)性間質(zhì)性肺?。↖LD）與特發(fā)性間質(zhì)性肺炎（IIP）中肺部受累的表型相似，預(yù)測(cè)用力肺活量百分比（FVC%）與SPP2C中的SNP rs2076295、rs17690703和MAP19中的rs1981997相關(guān)［12］。KDM4B在TGF-β誘導(dǎo)的胰腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中表觀遺傳地調(diào)節(jié)ZEB1的表達(dá)，是EMT過程中的關(guān)鍵介質(zhì)。在胰腺癌患者的腫瘤組織中，KDM4B的蛋白水平與ZEB1呈正相關(guān)，可作為人胰腺癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［13］。

研究發(fā)現(xiàn)MAPT-AS1及其共表達(dá)基因MAPT、MAPT-IT1、SPPL2C、KDM4B、NXNL2在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中均具有一定意義，但他們?cè)谌橄侔┓肿铀缴系淖饔脵C(jī)制研究仍不明確，進(jìn)一步研究和證實(shí)他們?cè)谌橄侔┲械墓δ軝C(jī)制，或許能成為乳腺癌診斷治療、生存預(yù)后的重要新靶點(diǎn)。