謝雨婷，宋明慧，馬毛毛，陳蘢，楊俊，文學(xué)方,3，曽哲靈,3，余平,3*

1(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330031) 2(南昌大學(xué) 資源環(huán)境與化工學(xué)院，江西 南昌，330031) 3(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)

椰子是熱帶主要果品之一，椰奶中富含中碳鏈甘油三酯[1-3]、低聚糖[4]、植物蛋白[5]、鋅、鈣、鐵等對人體有益的微量元素[6]和多種必需氨基酸[7]，且不含乳糖,具有快速提供能量，益氣生津，祛暑解渴[8]的功能。目前市場上的椰子飲品主要是椰子原汁飲料和風(fēng)味酸奶，因其特有的濃郁椰香、圓潤口感而廣受消費者喜愛，而針對椰奶的益生菌風(fēng)味飲品的開發(fā)研究較少[9-10]。椰汁富含利于乳酸菌生長的天然營養(yǎng)物質(zhì)，可提供優(yōu)良的發(fā)酵環(huán)境[8, 11-13]。植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌可共生定殖于人體腸道而改善機體健康[10-17]。相比較于傳統(tǒng)單一的椰子榨汁飲料及市場上常用的嗜熱鏈球菌與乳酸桿菌的菌種配方，選用嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌對新鮮椰奶進行混合發(fā)酵，將產(chǎn)生全新的風(fēng)味[18-19]，酸味口感更強，不僅膽固醇含量更低[20]，營養(yǎng)物質(zhì)更利于人體吸收[11]。因此，本實驗通過優(yōu)化椰奶發(fā)酵條件，為研制出具高活菌數(shù)的益生菌飲料提供支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

新鮮椰子，購于海南文昌；嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)與植物乳桿菌(Lactobacillusplantrum)，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)；葡萄糖和蔗糖(市售，食品級)；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基與乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(FD-1)，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器(UZWY-2102C)，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1950)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子天平(BSA223S)，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9101-2SA)，上海鴻都電子科技有限公司；低速大容量多管離心機(LXJ-IIB)，上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋(XMTE-8112)，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；循環(huán)水式多用真空泵(SHB-III)，武漢世紀(jì)超杰實驗儀器有限公司；九陽多功能榨汁機(JYL-C022E)，九陽股份有限公司；膠體磨(CRM-50)，廊坊市成瑞機械設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(SKP-02.420)，黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司

1.3 實驗方法

1.3.1 椰子預(yù)處理工藝流程

1.3.2 椰奶制備

取新鮮椰子引流出椰子水，再開椰殼取椰肉，以質(zhì)量比1∶3加入蒸餾水榨汁，過濾后與椰子水混合，經(jīng)均質(zhì)過濾制得新鮮椰奶，呈均勻乳白色，具濃郁椰香，儲存于4 ℃冰箱。

1.3.3 前調(diào)配及滅菌

根據(jù)嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的最優(yōu)碳源[21-23]，選擇蔗糖及葡萄糖為前調(diào)配輔料[24-25]，根據(jù)酸甜口感適量添加。90 ℃，滅菌10 min[8-9]。

1.3.4 菌種活化

商用菌種干粉先用乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基溶解，混勻，在乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中擴培，37 ℃活化12 h，活化2～3次。取一部分活化后菌液與30%甘油等體積混合均勻，分管保存于-20 ℃。

1.3.5 菌粉及菌液制備

取另一部分活化的種子液加入3 L乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中擴培16 h，隨后將菌液在4 000 r/min離心10 min，棄上清取菌泥，加入保護劑配方[26]，于-80 ℃預(yù)凍4 h，再真空冷凍干燥48 h。采用平板稀釋涂布法測定菌粉活菌數(shù)[27]，其中嗜酸乳桿菌菌粉菌含量達1.8×109CFU/g，植物乳桿菌菌粉菌含量達2.4×109CFU/g。

以滅菌生理鹽水溶解菌粉，適當(dāng)稀釋后使菌懸液菌體濃度為108CFU/mL，用于椰奶發(fā)酵接種。

1.3.6 單因素實驗

以活菌數(shù)為評價指標(biāo)，分別對發(fā)酵溫度35、37、39、41、43和45 ℃，發(fā)酵時間14、16、18、20、22和24 h，接種量1.5%、3%、4.5%、6%、7.5%、9%與植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌添加比例(Z/S)為0.5、1、1.5、2、2.5進行單因素實驗，采用平板計數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，確定各因素的影響效果與適宜范圍。

1.3.7 響應(yīng)面法實驗因素水平設(shè)計

以單因素實驗結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Design expert-8軟件應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計方法，選擇發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、菌比例(D)作為響應(yīng)變量，編碼水平為-1、0和1，且以活菌數(shù)(Y)作為響應(yīng)值，對椰奶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵椰奶的活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶，適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，分別在35、37、39、41、43、45 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h后，采用平板計數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 發(fā)酵溫度對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.1 Effects of fermentation temperature on viable count of the coconut milk beverage注：不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)，下同。

由圖1可以看出，37～43 ℃是嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌的較適生長溫度范圍，乳桿菌生長旺盛；39 ℃時總活菌數(shù)達到最高，隨后發(fā)酵溫度繼續(xù)增加，飲料活菌數(shù)下降；45 ℃時，菌種生長受明顯抑制?？赡苁怯捎谠谶m當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)溫度升高有利于催化各種酶反應(yīng)[28-29]，提高了乳桿菌增殖速率和發(fā)酵產(chǎn)酸速率[1]。因此，基于能量及活菌數(shù)的優(yōu)化考慮，選用發(fā)酵溫度為39 ℃為椰奶益生菌飲料最佳發(fā)酵溫度。

2.1.2 發(fā)酵時間對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種等量混合菌液后，在37 ℃下分別恒溫培養(yǎng)14、16、18、20、22和24 h，采用平板計數(shù)法稀釋涂布，將涂布后的平板在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵時間對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.2 Effects of fermentation time on viable count of the coconut milk beverage

由圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，椰奶中的乳桿菌大量增加，18 h時，活菌數(shù)達到最大，隨后趨于平緩，再逐漸下降。這可能是因為起初隨著時間增加，營養(yǎng)物質(zhì)充足，乳桿菌繁殖加快，菌數(shù)升高；而隨著時間延長，飲料中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，限制了乳桿菌的生長，其死亡速率超過增殖速率，因此菌數(shù)在保持穩(wěn)定后逐漸下降[3, 13,28，30]。綜合考慮，選擇發(fā)酵時間為18 h。

2.1.3 接種量對發(fā)酵椰奶的活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，分別接種1.5%、3.0%、4.5%、6%、7.5%、9%的混合菌液，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h，采用平板計數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。

圖3 接種量對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.3 Effects of f inoculation quantity on viable countof the coconut milk beverage

從圖3可知，隨著接種量的增加，椰奶發(fā)酵飲料活菌數(shù)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當(dāng)接種量為7.5%時，活菌數(shù)達最大值且隨后趨于平緩。這是由于隨著乳桿菌數(shù)的增加，乳桿菌對底物利用加快，增殖速率加快；而在有限的發(fā)酵營養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，乳桿菌對底物的利用水平有限，其增殖速率達到最大值后趨于穩(wěn)定[31]。因此，基于菌成本和活菌數(shù)優(yōu)化的考慮，選擇椰奶發(fā)酵飲料的最佳接種量為7.5%。

2.1.4 菌種添加比例對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

取若干潔凈干燥的50 mL滅菌錐形瓶編號，分別加入30 mL的滅菌椰奶、適量滅菌糖液，接種菌比例(Z/S)分別0.5、1.0、1.5、2.0和2.5的等量混合菌液后，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)20 h，采用平板計數(shù)法稀釋涂布，在37 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察并記錄總菌數(shù)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 菌比例(Z/S)對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)的影響

Fig.4 Effects of f bacteria ratio(Lactobacillus plantarum/Lactobacillus acidophilus)on viable count of the coconut milk beverage

由圖4可知，隨著菌比例(Z/S)的增加，椰奶益生菌飲料活菌含量先增加后減少，當(dāng)菌比例(Z/S)為1～1.75時，飲料活菌含量保持較高的水平；當(dāng)菌比例(Z/S)為1.5時活菌數(shù)達到最大值，繼續(xù)增加菌比例(Z/S)，活菌含量下降。這可能是因為當(dāng)植物乳桿菌與嗜酸乳桿菌的比例接近時，產(chǎn)生的競爭抑制較小，對營養(yǎng)底物的利用實現(xiàn)較平衡的優(yōu)化，由于嗜酸乳桿菌產(chǎn)酸及耐酸綜合能力更強[32-33]，因此，選擇菌比例為(Z/S)為1.5。

2.2 Box-Behnken實驗設(shè)計

2.2.1 根據(jù)單因素實驗結(jié)果

響應(yīng)面實驗因素編碼及水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)曲面實驗因素水平設(shè)計

2.2.2 模型建立與顯著性檢驗

綜合單因素結(jié)果，選擇發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、菌比例(Z/S)(D)4個因素，通過4因素3水平的Box-Behnken實驗設(shè)計和響應(yīng)面分析方法，確定椰奶發(fā)酵最佳工藝條件，所得實驗方案與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實驗方案與結(jié)果

續(xù)表2

實驗號各因素編碼值A(chǔ)BCD活菌數(shù)×10-8/(CFU·mL-1)1700111.8018-10102.211901011.762001-101.82210-1101.82220-1101.76231-1001.7724-10012.2025-11002.332610011.572700001.852800001.81290-1011.56

以活菌數(shù)(Y)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design expert-8軟件進行多元回歸擬合分析，各實驗因素對響應(yīng)值的影響可用如下多元二次回歸方程表示：

Y=1.83-0.17A+0.058B+0.080C-0.029D-0.16AB-0.023AC-0.14AD-0.088BC+0.072AD+5.000E-003CD+0.13A2-0.070B2-0.031C2-0.054D2

(1)

2.2.3 響應(yīng)因素水平的優(yōu)化及模型驗證

通過Design expert-8軟件分析得到椰奶發(fā)酵的最佳條件為：發(fā)酵溫度(A)為41 ℃、發(fā)酵時間(B)為18 h、接種量(C)為9%、菌比例(Z/S)(D)為1。采用此優(yōu)化條件進行發(fā)酵椰奶驗證實驗，重復(fù)3次，椰奶飲料活菌數(shù)含量達2.011×108CFU/mL，與預(yù)測值相近，重復(fù)性好，表明此模型能較好地優(yōu)化得到椰奶發(fā)酵最佳條件。

表3 響應(yīng)面分析實驗方差分析結(jié)果

續(xù)表3

方差來源自由度平方和均方F值P值顯著性D210.0190.0197.220.017 7?殘差140.0372.614E-003失擬項100.0343.423E-0035.800.052 5殘差140.0372.61E-03失擬項100.0343.42E-035.80.0525純誤差42.362×10-35.904×10-4總和280.930.064R2=96.08%RMSE=0.051CV=2.81

由表3可知，該模型效應(yīng)極顯著(P<0.01)。該模型的決定系數(shù)為96.08%，修正決定系數(shù)為92.16%；模型的變異系數(shù)CV=2.81，模型變異較小；模型的失擬項差異不顯著，說明回歸方程擬合程度高，可用于椰奶發(fā)酵條件的優(yōu)化。該模型的一次項A、C、二次項A2和AB、AD是極顯著項，B、BC、B2和D2是顯著項，其他為非顯著項。因素D的P值為0.069 6>0.05，說明菌比例(Z/S)對活菌數(shù)影響不顯著。影響椰奶發(fā)酵優(yōu)化條件的因素順序為:發(fā)酵溫度>接種量>發(fā)酵時間>菌比例(Z/S)。

3 結(jié)論

本文對發(fā)酵椰奶活菌數(shù)條件進行了響應(yīng)面優(yōu)化。以新鮮椰子為原料，嗜酸乳桿菌和植物乳桿菌為菌種，優(yōu)化椰奶發(fā)酵飲料活菌數(shù)最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度為41 ℃、發(fā)酵時間為18 h、接種量為9%、菌比例(Z/S)為1，椰奶飲料活菌數(shù)含量達2.011×108CFU/mL?，F(xiàn)行國標(biāo)中關(guān)于活性乳酸菌數(shù)值的指標(biāo)要求為出廠時不小于100萬個/mL，遠低于1 000萬個/mL的國際標(biāo)準(zhǔn)。該款椰奶飲料活菌數(shù)不僅遠高于市場標(biāo)準(zhǔn)，也達到了國際乳酸菌類飲料活菌數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。另外，發(fā)酵后的椰奶保留了較純正的椰香，顏色偏乳白色，口感細膩，質(zhì)地均勻，有利于進一步市場利用與開發(fā)。

由于本款椰奶發(fā)酵飲料僅添加了蔗糖與葡萄糖做輔料，口味純正較單一，酸味強，發(fā)酵終點pH在3.32～3.49，在實際生產(chǎn)中，可將在此條件下發(fā)酵的椰奶適當(dāng)稀釋，有利于降低成本，提高經(jīng)濟效益；另外，可針對市場需求，添加多種不同輔料以創(chuàng)新更豐富的口感。綜上所述，本文針對椰奶益生菌飲料生產(chǎn)工藝的活菌數(shù)優(yōu)化實驗，對開發(fā)椰奶發(fā)酵產(chǎn)品提供了良好的參考意義及廣闊的市場前景。