徐 暉 李 希 周春水

肺癌的腫瘤形成是一種復雜的多因素、多步驟過程，它涉及多種遺傳學及表觀遺傳學上的異常變化[1-3]，這些惡性表型歸根結底都是控制這些生理過程的基因發(fā)生了異常改變。因此，發(fā)現并且闡明在腫瘤起源和進展中起關鍵作用的腫瘤抑制基因成為腫瘤防治中的中心任務，新型腫瘤相關基因的發(fā)現也為開發(fā)新型腫瘤治療方法提供更有效、更有針對性的藥物靶標[4]。

近年來發(fā)展起來的針對人轉錄組的shRNA文庫為全基因組功能缺失性篩選提供了有力工具。shRNA文庫由大量針對驗證的目標基因設計的shRNA克隆組成[5-7]。通過shRNA文庫及腫瘤細胞的錨定不依賴性生長特性已經在乳腺癌中篩選了包括PTPN12在內的多種腫瘤抑制基因[8]。本研究擬通過應用shRNA文庫篩選肺癌相關的腫瘤抑制基因，為今后大規(guī)模、高效率的篩選更多種類的抑癌基因奠定堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 shRNA文庫逆轉錄病毒的包裝

以300萬細胞/孔將GP2-293細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中。24 h后進行shRNA文庫(pSM2c_shRNAmir 1.1-1.6，Hannon-Elledge 文庫)轉染，選取3.1～3.6亞庫進行病毒包裝，包裝體系如下：VSVG for retro 12 μg、shRNA文庫12 μg、Opti-MEM 1.5 mL、Mirus 60 μL，室溫作用20 min，分別加入到GP2-293細胞中。以此時間為零點，零點之后的第48 h吸取上清(病毒在上清中)，然后再加入新鮮的培養(yǎng)基，零點之后的72 h吸取上清。將病毒液以800 rpm離心5 min后用0.45 μM濾膜過濾，-80℃凍存。

1.2 shRNA文庫包裝病毒感染BEAS-2B細胞

培養(yǎng)BEAS-2B細胞，將BEAS-2B細胞種六孔板，30萬細胞/孔。以MOI為1加入文庫包裝的病毒。加入終濃度為0.5 μg/mL的puromycin篩選病毒陽性感染細胞。

1.3 軟瓊脂克隆形成實驗篩選錨定不依賴性生長BEAS-2B細胞系

配制底層瓊脂：微波爐中溶解1.6%低熔點瓊脂糖，水浴鍋中冷卻到40℃。將2×培養(yǎng)基放入40℃水浴鍋中。加等體積的1.6%低熔點瓊脂糖與2×培養(yǎng)基，使瓊脂糖終濃度為0.8%。將其倒入10 cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿10 mL。室溫冷卻至凝固。配制上層瓊脂：微波爐中溶解3.5%低熔點瓊脂糖，并將其放入40℃水浴鍋中。消化puromycin篩選的文庫轉染細胞，800 rpm離心5 min，細胞計數，并將細胞濃度配制成10萬細胞/mL。在50 mL離心管中加入3.5%低熔點瓊脂糖3 mL，BEGM培養(yǎng)基27 mL，細胞450 μL。每10 cm培養(yǎng)皿加入10 mL混合液，此時細胞數為1.5萬細胞/10 cm培養(yǎng)皿。室溫冷卻至凝固。將培養(yǎng)皿放入37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)3周，每三天加入1.5 mL BEGM培養(yǎng)基。

1.4 新腫瘤抑制基因的篩選

從軟瓊脂平板中挑取單個克隆放入24孔板中培養(yǎng)。逐漸擴大培養(yǎng)至6 cm培養(yǎng)皿中。提取細胞全基因組DNA(按照Qiagen試劑盒方法提取)。PCR擴增基因組DNA片段，根據MSCV-PM-mir30質粒序列設計通用引物，由北京英駿公司合成引物序列，如表1所示。PCR產物測序并應用Pubmed blast分析其對應的人類基因名稱。

表1 MSCV-PM-mir30擴增通用引物Table 1 Primers for MSCV-PM-mir30 amplification

1.5 軟瓊脂克隆形成實驗驗證基因沉默后BEAS-2B細胞惡性轉化情況

對候選基因INPP4B所在的細胞系擴大培養(yǎng)，細胞融合度為80%～90%時進行后續(xù)實驗。配制底層瓊脂及上層瓊脂，方法同前所述。消化puromycin篩選的文庫轉染細胞，800 rpm離心5 min，細胞計數，并將細胞濃度配制成10萬細胞/mL。在50 mL離心管中加入3.5%低熔點瓊脂糖3 mL，BEGM培養(yǎng)基27 mL，細胞450 μL。每10 cm培養(yǎng)皿加入10 mL混合液，此時細胞數為1.5萬細胞/10 cm培養(yǎng)皿。室溫冷卻至凝固。將培養(yǎng)皿放入37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)3周，每三天加入1.5 mL BEGM培養(yǎng)基。每個10 cm培養(yǎng)皿加入1 mL結晶紫溶液，室溫1 h，照相，計數10 cm培養(yǎng)皿中克隆形成數量。

1.6 細胞增殖檢測

取對數生長期BEAS-2B shFF2、BEAS-2B shINPP4B沉默細胞，將其接種于96孔板中，2000細胞/孔，每種細胞接種六個復孔。接種七塊相同的96孔板。24 h后取其中的一塊96孔板，吸去培養(yǎng)基，PBS洗三次。每孔加入培養(yǎng)基200 μL，CellTiter96?Aqueous One Solution Reagent 20 μL，37℃孵箱孵育4 h，用酶標儀測定490 nm處的光吸收值。每天重復測定一次，共測定7次。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.7 裸鼠成瘤實驗驗證基因沉默后BEAS-2B細胞惡性轉化情況

對含有shINPP4B沉默基因的BEAS-2B細胞擴大培養(yǎng)。細胞計數，每種細胞取5×107個細胞接種裸鼠皮下，接種3周后測量腫瘤體積的大小。

1.8 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行分析，采用兩獨立樣本t檢驗方法對克隆形成及裸鼠成瘤大小及體積進行統(tǒng)計學分析，MTT實驗采用重復測量方差分析進行比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 shRNA文庫轉染BEAS-2B細胞軟瓊脂克隆形成實驗

與shFF2轉染細胞相比，文庫轉染細胞數目較多，并可形成較大的克隆。對MSCV-PM-shFF2轉染細胞及文庫轉染細胞的軟瓊脂平板所形成的的細胞團(直徑>1 mm)進行計數，shFF2轉染細胞的克隆形成數為86±20，文庫轉染細胞的克隆形成數205±35，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.014)(圖1)。

圖1 shFF2及文庫轉染BEAS-2B細胞軟瓊脂克隆實驗Figure 1 The number of colony formation between BEAS-2B cells infected with shFF2 and cells transfected with shRNA libraryNote：A.Cells transfected with shFF2；B.Cells transfected with shRNA library；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and cells transfected with shINPP4B.

2.2 新腫瘤抑制基因的篩選

所插入的shRNA基因片段經PCR擴增、DNA測序后，用blast 發(fā)現其相應的靶基因并剔除重復測序基因(表2)。

表2 BEAS-2B細胞候選腫瘤抑制基因Table 2 Candidates of malignant transformation suppressors were identified in BEAS-2B cells by the shRNA library targeting transcriptome

2.3 候選基因INPP4B沉默效果檢測

選取INPP4B作為候選腫瘤抑制基因。將軟瓊脂平板上的克隆擴大培養(yǎng)，Western blot驗證基因沉默效果。可見shINPP4B沉默組相應基因表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)(圖2)。

2.4 軟瓊脂克隆形成實驗驗證基因沉默后BEAS-2B細胞惡性轉化情況

將含有shINPP4B的BEAS-2B細胞擴大培養(yǎng)后，接種軟瓊脂平板，待細胞生長三周后結晶紫染色，照相。shINPP4B組細胞克隆數較多，體積較大。說明當INPP4B沉默后，細胞發(fā)生了惡性轉化。顯微鏡下觀察，shFF2對照組細胞零星分布于平板中，shINPP4B轉染組細胞較密集，數量較多。經細胞計數，shFF2對照組、shINPP4B組分別為(205±40)個/10 cm培養(yǎng)皿、(618±36)個/10 cm培養(yǎng)皿(圖3)，實驗組組與對照組具有統(tǒng)計學差異(P=0.003)(圖3)。

圖2 INPP4B沉默細胞中INPP4B蛋白水平檢測Figure 2 The level of INPP4B protein in BEAS-2B cells silenced with shINPP4BNote：A.The expression of INPP4B in BEAS-2B cells transfected with shINPP4B and shFF2；B.The intensity of protein INPP4B bands was quantified with a densitometry.

圖3 BEAS-2B細胞軟瓊脂克隆形成實驗Figure 3 The colony formation in BEAS-2B cellsNote：A.BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The number of colony formation between BEAS-2B cells transfected with shFF2 and shINPP4B.

2.5 MTT法檢測INPP4B基因沉默后BEAS-2B細胞增殖情況

取shFF2對照組，shINPP4B沉默BEAS-2B細胞系，應用MTT實驗檢測細胞增殖速度，在490 nm處讀取吸光度值。實驗結果可見，shINPP4B沉默組細胞增殖速度均高于shFF2對照組細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4)。

2.6 裸鼠成瘤實驗驗證基因沉默后BEAS-2B細胞惡性轉化情況

FF2對照組、shINPP4B轉染組腫瘤重量分別為(0.156±0.071)g，(0.844g±0.074)g，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。FF2對照組、shINPP4B轉染組腫瘤體積分別為(69.02±31.48)mm3，(874.56±60.80)mm3，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖5)。

圖4 MTT實驗檢測細胞增殖Figure 4 Proliferative curves of BEAS-2B cells transfected with shFF2 or shINPP4B

圖5 BEAS-2B細胞裸鼠成瘤實驗Figure 5 Xenografts in nude miceNote：A.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shFF2；B.The nude mouse implanted BEAS-2B cells transfected with shINPP4B；C.The tumor weight between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B；D.The volume of tumor between nude mice implanted cells with shFF2 or shINPP4B.

3 討論

shRNA文庫一般采用的是鼠源逆轉錄病毒(MSCV)或慢病毒(Lentivirus)作表達載體。shRNA文庫保存形式有列陣(Arrayed)文庫和集合(Pooled)文庫。Arrayed文庫能用于高通量圖像分析以及探測細胞周期變化。Pooled文庫需要的試劑少，成本小，便于進行大規(guī)模、高效率功能篩選。shRNA-mir文庫靶點涵蓋廣、基因沉默效率高，可廣泛應用于體外實驗進行腫瘤抑制基因的篩選。為了研究肺癌發(fā)生過程中起到關鍵作用的腫瘤抑制基因，我們應用shRNA文庫進行腫瘤抑制基因的篩選。

哈佛大學Elledge實驗室應用shRNA-mir文庫和體外軟瓊脂細胞克隆形成這兩種技術在永生化的乳腺上皮細胞中篩選出PTPN12等多個新型腫瘤抑制基因。由于不同來源的細胞基因略微有些差別，而美國乳腺癌占有很大的比例，所以哈佛大學的研究主要集中在對乳腺上皮的永生化細胞腫瘤抑制基因的篩選上。而在過去的30年，中國肺癌死亡率逐年增加，肺癌已經超過肝癌，成為癌癥死亡的首要病因[9]。上海、遼寧更是肺癌高發(fā)城市。根據WHO的統(tǒng)計，2025年，中國新增肺癌人數將達每年100萬。因此我們主要針對肺腫瘤抑制基因進行研究。我們利用研究中較常見的永生化肺支氣管上皮細胞BEAS-2B，應用shRNA文庫技術篩選肺上皮腫瘤抑制基因，發(fā)現了幾個在肺癌過程中起到關鍵作用的肺腫瘤抑制基因，這在之前的研究中未見報道。

在本研究中，我們應用shRNA文庫篩選技術和軟瓊脂克隆形成實驗在肺支氣管上皮細胞全基因組中分離出100個分離較好，較大的克隆，經過PCR擴增、基因組比對確定了6個肺腫瘤抑制基因候選基因，分別為INPP4B、Sesn2、TIAR、ACRC、NUP210、LMTK3。其中INPP4B已證實可能是乳腺癌及前列腺癌的腫瘤抑制基因[10-11]，但在肺癌發(fā)生中的作用未見報道。Sesn2是p53基因的靶蛋白，對mTOR通路具有負調節(jié)作用[12]。TIAR是RNA結合蛋白，對細胞凋亡、病毒復制、感染、代謝應激具有調節(jié)作用，下調TIAR蛋白的表達可促進腫瘤細胞的增殖與侵襲，有文獻報道稱其可能是腫瘤抑制基因[13]。ACRC的功能未知，有報道稱與帕金森病有關。NUP210是210KD的核孔蛋白，其表達可能決定細胞的命運[14]。LMTK3蛋白的表達水平可影響乳腺癌對藥物的敏感性，對于腫瘤內蛋白質LMTK3水平較高的患者，一些常規(guī)藥物的療效不佳，患者存活時間較短，而蛋白表達水平較低的患者，對藥物的敏感性更好存活時間較長。其可能成為乳腺癌治療的新靶點[15]。

由于本研究通過shRNA文庫篩選了幾個已知的腫瘤抑制基因及幾個與腫瘤發(fā)生相關的基因，發(fā)現的候選基因限制肺癌細胞的錨定不依賴性生長，說明通過shRNA篩選腫瘤抑制基因的方法有效。根據已有文獻的報道，我們選取了INPP4B作為肺腫瘤抑制基因的優(yōu)先候選基因。

當肺支氣管上皮細胞BEAS-2B沉默了INPP4B基因后，細胞在軟瓊脂平板上形成的克隆數較對照組克隆增大，數目增多。沉默了INPP4B基因后細胞增殖速度增快在裸鼠皮下注射后可形成較大的腫瘤，說明肺支氣管上皮細胞可能發(fā)生了惡性轉化，但其具體通過的機制不明，我們將在后續(xù)的實驗中進行研究。我們通過shRNA文庫及軟瓊脂克隆實驗結合測序分析，初步探討了發(fā)現腫瘤抑制基因的一種方法，為今后大規(guī)模的篩選工作奠定了基礎。