趙 蘇 鄭曉瑜 朱開(kāi)彬 卜建龍 徐世東

肺癌是當(dāng)前全世界最常見(jiàn)的腫瘤，每年導(dǎo)致超過(guò)140萬(wàn)人死亡[1]。肺癌完全性切除術(shù)是目前治療肺癌的主要方式，但手術(shù)本身卻可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[2]。主要原因是手術(shù)創(chuàng)傷會(huì)干擾機(jī)體免疫功能，抑制術(shù)后適應(yīng)性免疫反應(yīng)和抗腫瘤免疫[3]。而CD4+T細(xì)胞亞群分化失衡在適應(yīng)性免疫功能失調(diào)中起主要作用[4]。因此，探討手術(shù)創(chuàng)傷后CD4+T細(xì)胞亞群的變化至關(guān)重要，有助于找到有效的治療策略來(lái)改善手術(shù)創(chuàng)傷后免疫抑制。

初始CD4+T細(xì)胞與抗原作用后會(huì)增殖分化為不同的CD4+T細(xì)胞亞群[5]。CD4+T細(xì)胞亞群主要包括Th1和Th2[6]。新近研究表明，Th細(xì)胞也可轉(zhuǎn)化為Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，Th17細(xì)胞主要誘導(dǎo)正向免疫應(yīng)答，而Treg則主要抑制免疫效應(yīng)[7]。以往研究表明手術(shù)創(chuàng)傷可以誘導(dǎo)Th1/Th2平衡向Th2漂移[8]。新近研究發(fā)現(xiàn)手術(shù)創(chuàng)傷后Th17/Treg細(xì)胞也會(huì)失衡[5，9]。然而，肺癌完全性切除術(shù)后患者Th17/Treg平衡的改變尚未完全闡明。因此本研究旨在探討肺癌完全性切除術(shù)對(duì)肺癌患者外周血中Th17/Treg平衡的影響。

1 資料和方法

1.1 病例資料

研究程序經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為21例病理確診為肺癌并即將接受肺癌完全性切除術(shù)的患者(均為我院2016年1月—2018年1月收治入院的患者)和21名健康對(duì)照者。所有患者均接受肺癌完全性切除術(shù)，進(jìn)行肺葉(全肺)切除及淋巴結(jié)清掃術(shù)。手術(shù)方式均為常規(guī)開(kāi)胸手術(shù)。研究分為三組，健康對(duì)照組(Control)、手術(shù)患者術(shù)前組(Day 0)和手術(shù)患者術(shù)后三天組(Day 3)?；颊呤中g(shù)前必須未接受化療和放療?；加凶陨砻庖咝约膊』虿《靖腥镜幕颊弑慌懦谘芯恐??；颊吆徒】祵?duì)照者的一般資料詳見(jiàn)表1。

表1 肺癌完全性切除術(shù)患者和健康對(duì)照者一般資料的比較Table 1 Correlation between patients underwent lung cancer resection and healthy controls

Note：ASA.American society of anesthesiologists.

1.2 標(biāo)本收集

手術(shù)患者在術(shù)前(Day0)和術(shù)后三天(Day3)清晨，空腹采集肘靜脈血各8 mL，分裝在EDTA-2K抗凝管中，一管6 mL用于流式細(xì)胞和RT-PCR檢測(cè)，另一管2 mL離心后取血清，保存于-80℃冰箱，用于ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子。健康對(duì)照組(不接受手術(shù))隨機(jī)清晨空腹采集肘靜脈血，標(biāo)本收集儲(chǔ)存方法同前。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的分離

取一15 mL離心管，加入2 mL已用抗凝劑處理過(guò)的人血液樣品，再加入2 mL PBS進(jìn)行稀釋，上下顛倒混勻樣品，備用；取一新的無(wú)菌15 mL離心管，加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，然后將稀釋好的4 mL抗凝血標(biāo)本小心地沿離心管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上，保持分離液與標(biāo)本界面清晰；將離心管垂直放入離心機(jī)內(nèi)，18～20℃，1 000 g離心30 min；小心取出離心管，此時(shí)，液體分三層：最上層為血漿，下層為紅細(xì)胞，中間層為分離液層，位于中層靠近血漿層的白膜層即為單個(gè)核細(xì)胞層，小心吸走血漿層，不要打動(dòng)白膜層；用彎頭滴管插入白膜層，小心吸取單個(gè)核細(xì)胞；將白膜層細(xì)胞吸入另一離心管中，加入無(wú)菌PBS重懸，400 g離心10～15 min；重復(fù)洗滌細(xì)胞兩次；末次離心后，棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640重懸細(xì)胞，顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整至2～4×106/mL。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC中的Th17細(xì)胞

向PBMC管中加入1 μL莫能霉素和1 μL細(xì)胞刺激混合液，混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。向PBMC管中加入FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體，室溫下避光孵育30 min。PBS洗滌兩次，棄上清，加入固定劑300 μL，室溫下避光固定30 min。固定后洗滌兩次，棄上清，再加入100 μL破膜劑，加入20 μL PE-IL-17單克隆抗體，室溫下避光孵育15～20 min。最后再加入500 μL PBS洗滌一次，用300 μL 1%濃度的甲醛固定細(xì)胞，放在4℃環(huán)境中，等待用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC中的Treg細(xì)胞

向PBMC管中加入100 μL BD Pharmingen Stain Buffer(554656)混懸細(xì)胞，再加入FITC標(biāo)記的CD4單克隆抗體以及APC-cy7標(biāo)記的CD25單克隆抗體，室溫下避光孵育30 min。用無(wú)菌PBS洗滌兩次，棄上清，加入固定劑(IFP)100 μL，室溫下避光固定4 h。固定后洗滌兩次，棄上清，加入破膜劑100 μL，加入PE-FOXP3單克隆抗體，室溫下避光孵育15～20 min。最后再加入500 μL PBS洗滌一次，用300 μL 1%濃度的甲醛固定細(xì)胞，放在4℃，等待用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)PBMC中RORγt和Foxp3基因的mRNA水平

使用Omega公司的RNA提取試劑盒提取總RNA，用Real-Time PCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。RORγt上游引物序列：5′-AATCTCATCCTCGGAAAAGTG-3′，下游引物序列：5′-TCTCAAAGCAGGAGCAATGGA-3′；Foxp3上游引物序列：5′-TGGAGGAACTCTGGGAATGTG-3′，下游引物序列：5′-GGTGCTGGAGAAGGAGAAGCT-3′；以GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列：5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′，下游引物序列：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。上機(jī)后反應(yīng)程序如下：酶激活溫度95℃(15 min)→擴(kuò)增反應(yīng)溫度94℃(15 s)→退火溫度65℃(30 s)，總計(jì)40個(gè)循環(huán)→延伸溫度溫度70℃(34 s)。1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

采用人IL-17和TGF-β ELISA試劑盒(Abclonal)檢測(cè)三組中血漿IL-17及TGF-β的濃度。按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)，在iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)上測(cè)定OD450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，患者一般資料中的計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，其中身高、年齡、體重等計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，性別和ASA分級(jí)等計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析(one-way AVONA)，多重比較采用SNK法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌完全性切除術(shù)改變手術(shù)后患者外周血中Th17/Treg細(xì)胞百分比

肺癌患者術(shù)前組(Day 0)外周血中Th17細(xì)胞(圖1A和B)(P<0.01)和Treg細(xì)胞百分比(圖1C和D)(P<0.05)均高于健康對(duì)照組(Control)。此外，手術(shù)患者術(shù)后三天組(Day 3)與術(shù)前組(Day 0)相比，Th17細(xì)胞百分比下降(圖1A、B)(P<0.01)，而Treg細(xì)胞百分比明顯增加(圖1C和D)(P<0.01)。

2.2 肺癌完全性切除術(shù)影響肺癌患者PBMC中RORγt和Foxp3的表達(dá)

肺癌患者術(shù)前組(Day 0)與健康對(duì)照組相比，RORγt和Foxp3的mRNA水平均增高(圖2A和B)(P<0.01)。肺癌患者術(shù)后三天組(Day 3)與術(shù)前組(Day 0)相比，RORγt表達(dá)減少(圖2A)(P<0.01)，而Foxp3的表達(dá)增加(圖2B)(P<0.01)。

2.3 肺癌完全性切除術(shù)影響肺癌患者血漿中IL-17和TGF-β1的表達(dá)

通過(guò)ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺癌患者術(shù)前組血漿中IL-17和TGF-β1的水平高于健康對(duì)照組(圖3A，B)(P<0.01)。此外，與術(shù)前組相比較，患者術(shù)后3天組血漿IL-17的水平降低(圖3A)(P<0.01)，然而血漿TGF-β1的水平明顯增高(圖3B)(P<0.01)。

圖1 肺癌完全性切除術(shù)對(duì)外周血中Th17和Treg細(xì)胞百分比的影響Figure 1 Effects of lung cancer resection on the percentages of Th17 and Treg cells in the peripheral blood of patientsNote：A.Representative diagram of the percentage of Th17 in healthy controls and patients before surgery(Day 0)or Day 3；B.Graph shows the percentage of Th17 cells；C.Representative diagram of the percentage of Treg cells in healthy controls and patients before surgery(Day 0)or Day 3；D.Graph shows the percentage of Treg cells.* P<0.05，** P<0.01，when compared with the control group；# P<0.05，when compared with the Day 0；## P<0.01，when compared with the Day 0.

圖2 肺癌完全性切除術(shù)對(duì)患者PBMC中RORγt和Foxp3的影響Figure 2 Effects of lung cancer resection on the expression of RORγt and Foxp3 in PBMCNote：A.Expression of RORγt in the three groups；B.Expression of Foxp3 in the three groups.* P<0.05，** P<0.01，when compared with control group；#P<0.05，## P<0.01，when compared with Day 0.

圖3 肺癌完全性切除術(shù)對(duì)患者血漿中TGF-β1和 IL-17的影響Figure 3 Effects of lung cancer resection on the plasma levels of tumor growth factor(TGF)-β1 and interleukin(IL)-17Note：A.Plasma level of IL-17 in the three groups；B.Plasma level of TGF-β1 in the three groups.* P<0.05，** P<0.01，when compared with control group；#P<0.05，## P<0.01，when compared with Day 0.

3 討論

肺癌是全球癌癥的第一原因，也是癌癥的第一死因。手術(shù)切除仍然是治療肺癌的一線治療方法，但手術(shù)本身導(dǎo)致的術(shù)后免疫抑制可以促進(jìn)肺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，因此深入研究手術(shù)切除對(duì)肺癌患者術(shù)后免疫抑制的影響，并尋找新的可運(yùn)用于臨床的治療策略，是提高患者臨床受益的迫切需要。

手術(shù)創(chuàng)傷能觸發(fā)機(jī)體發(fā)生復(fù)雜的宿主反應(yīng)，它既干擾固有免疫反應(yīng)，又干擾適應(yīng)性免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞和促炎、抗炎細(xì)胞因子發(fā)生短暫性的變化，從而造成機(jī)會(huì)性感染和創(chuàng)傷后并發(fā)癥增加[10-11]。創(chuàng)傷后免疫失衡可導(dǎo)致膿毒癥和多器官功能障礙，對(duì)抗抗腫瘤免疫反應(yīng)，促進(jìn)腫瘤患者的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，全面理解免疫應(yīng)答的活化和變化對(duì)于預(yù)防創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展以及改善創(chuàng)傷后的不良臨床后果至關(guān)重要。迄今為止，手術(shù)創(chuàng)傷相關(guān)并發(fā)癥的確切機(jī)制仍未被闡明。然而，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制被公認(rèn)對(duì)于創(chuàng)傷后并發(fā)癥的發(fā)展至關(guān)重要。其中，CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的改變?cè)诩?xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制中發(fā)揮關(guān)鍵性作用，主要包括Th1/Th2平衡向Th2漂移，同時(shí)伴隨Th1功能的喪失和Treg細(xì)胞數(shù)量的上調(diào)[12]。

近年來(lái)，有研究表明嚴(yán)重的胸部創(chuàng)傷和創(chuàng)傷后敗血癥會(huì)使得Th17/Treg失衡[13-14]。但是，肺癌完全性切除術(shù)對(duì)肺癌患者術(shù)后Th17/Treg細(xì)胞平衡的影響尚未被闡明。本研究結(jié)果顯示，在接受肺癌完全性切除術(shù)后的患者外周血中，Th17細(xì)胞的百分比下降，而Treg細(xì)胞的百分比上調(diào)。同時(shí)，血漿IL-17的表達(dá)水平降低，而血漿TGF-β1的表達(dá)水平增高。ROR-γt是Th17細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，在初始輔助性T細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-17基因的轉(zhuǎn)錄。Th17細(xì)胞百分比在ROR-γt-缺陷型小鼠中明顯降低[15]。同時(shí)，Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子是Foxp3，并且已經(jīng)有研究表明TGF-β依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以促進(jìn)初始T細(xì)胞中的Foxp3的表達(dá)[16]。因此，本研究也采用RT-PCR法檢測(cè)了ROR-γt和Foxp3的表達(dá)。結(jié)果表明，肺癌患者術(shù)后與術(shù)前相比，ROR-γt的表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3的表達(dá)升高，以上結(jié)果均表明肺癌完全性切除術(shù)帶來(lái)的手術(shù)創(chuàng)傷可能導(dǎo)致Th17/Treg平衡向Treg方向漂移。這種變化抑制了機(jī)體的抗腫瘤免疫，并可能促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

導(dǎo)致手術(shù)創(chuàng)傷后Th17/Treg失衡的原因包括很多，首先，細(xì)胞因子微環(huán)境是Th17/Treg平衡的主要決定因素之一。TGF-β1是由Treg分泌的特征性細(xì)胞因子，可促進(jìn)Treg的分化[15]。然后由Treg細(xì)胞分泌產(chǎn)生的TGF-β1又可以為Treg的誘導(dǎo)產(chǎn)生提供強(qiáng)大的正反饋回路。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)促進(jìn)了TGF-β1的產(chǎn)生，這可能是術(shù)后患者外周血Th17/Treg細(xì)胞平衡向Treg方向偏移的一個(gè)重要原因；最近有報(bào)道稱共刺激分子如PD-1也是控制Th17和Treg細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子[17]。PD-1通過(guò)與其配體PD-L1結(jié)合導(dǎo)致PD-1胞內(nèi)段的酪氨酸發(fā)生磷酸化，PD-1內(nèi)段免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)與免疫酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM)發(fā)生磷酸化，隨后抑制抗原信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)傳入，抑制T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，介導(dǎo)免疫抑制作用[18-19]；并且，手術(shù)創(chuàng)傷同時(shí)會(huì)引起微循環(huán)功能障礙，導(dǎo)致乳酸水平升高[20]。乳酸水平的增加導(dǎo)致T細(xì)胞的代謝重整，損害了T輔助細(xì)胞的功能，但卻不影響Treg細(xì)胞的功能，這一研究表明，手術(shù)創(chuàng)傷為Tregs提供了代謝優(yōu)勢(shì)[21]。此外，嚴(yán)重的創(chuàng)傷改變了常規(guī)樹突狀細(xì)胞(cDCs)分泌促炎細(xì)胞因子的能力，從而損害了其有效觸發(fā)Th1和Th17細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力；還會(huì)誘導(dǎo)未成熟抗原呈遞細(xì)胞如未成熟樹突細(xì)胞(DC)和骨髓來(lái)源抑制細(xì)胞(MDSC)的百分比明顯增加[22]。這些抗原呈遞細(xì)胞損害了Th1和Th17細(xì)胞的功能，并可促進(jìn)Treg細(xì)胞的功能，這也可能是手術(shù)創(chuàng)傷中Th17/Treg失衡的潛在機(jī)制[23]。

此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，Th17和Treg細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中表現(xiàn)出復(fù)雜和有爭(zhēng)議的作用[19，24]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，肺癌患者外周血中的Th17和Treg細(xì)胞的百分比與健康對(duì)照者相比均增高，與以往的文獻(xiàn)報(bào)道一致，可能的原因主要有，肺癌患者相比較健康對(duì)照者IL-17A、IL-23、IL-1 β以及RORC的血漿蛋白水平和mRNA分子水平均增高，這些增高了的細(xì)胞因子和特異性轉(zhuǎn)錄因子會(huì)明顯促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化[25]；肺癌患者相比較健康對(duì)照者TGF-β以及Foxp3表達(dá)水平也增高，而這些細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化[26]。

綜上所述，接受肺癌完全性切除術(shù)后的患者外周血Th17/Treg細(xì)胞平衡向Treg方向偏移，可使得外科手術(shù)患者術(shù)后的免疫功能處于抑制狀態(tài)，可能會(huì)促進(jìn)或加速腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，因而下一步對(duì)肺癌完全性切除術(shù)后Th17/Treg失衡進(jìn)行深入的機(jī)制研究有助于尋找治療靶點(diǎn)以改善術(shù)后Th17/Treg失衡，對(duì)肺癌患者的預(yù)后有重要的臨床意義。