馮殿鵬 劉廣慧 韓卿

[摘要]目的 探討MG-132對TRAIL誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡的影響。方法 骨肉瘤細胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分為單用TRAIL組、單用MG-132組、聯(lián)合組。在應用上述三種給藥方案24 h后，分別對誘導MG-132細胞凋亡狀況進行檢測;計算細胞抑制率;光鏡下觀察細胞變化。結(jié)果 單用TRAIL組誘導凋亡效果并不理想，隨著TRAIL濃度的升高，骨腫瘤U-2 OS凋亡率不斷升高，單用MG-132組細胞隨著給藥的濃度增加，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;聯(lián)合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），聯(lián)合組骨肉瘤細胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。隨著時間的推移，細胞抑制率上升，而聯(lián)合組的抑制率明顯高于TRAIL組和MG-132組，在72 h處達到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論 單用TRAIL可誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想。聯(lián)合MG-132使用后，可大大提高TRAIL誘導U-2 OS凋亡的效果。

[關鍵詞]蛋白酶體通路;TRAIL;骨肉瘤;凋亡

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）2（b）-0012-05

MG-132是蛋白酶體的阻斷試劑，阻斷后可使之失去活性[1]。泛肽-蛋白酶體（ubiquitin proteasome）是廣泛存在于真核細胞中，其能快速處理和降解蛋白質(zhì)的非溶酶體物質(zhì)，蛋白酶體是指有蛋白降解作用的酶復合體。MG132是一種肽醛，可以有效地阻斷蛋白酶體的蛋白水解活性，包含芐酯基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸序列[2]。據(jù)報道，蛋白酶體的抑制劑（包括MG132）可以通過形成活性氧（ROS）從而誘導細胞凋亡。蛋白酶體抑制劑引起的ROS的形成和谷胱甘肽（GSH）的耗竭可導致線粒體功能障礙和隨后細胞色素C的釋放，從而導致細胞活力的喪失[3-4]。在細胞質(zhì)中蛋白酶體亞群是與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）表面、細胞骨架[5]、中心體相伴隨。大多數(shù)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括調(diào)節(jié)細胞周期的多種蛋白均有此通路降解[6]。

TRAIL（TNF related apoptosis inducing ligand）基因最早由Wiley等[7]在1995 年從人心肌cDNA 文庫中克隆得到并命名，1996 年Pitti等[8]克隆到同樣的基因，并命名Apo22L。由于其氨基酸序列具有TNF超家族的結(jié)構(gòu)特征，并能誘導Jurkat細胞和EB病毒轉(zhuǎn)化的人類B淋巴細胞凋亡，故命名為TNF相關的凋亡誘導配體。但是有研究發(fā)現(xiàn)，某些腫瘤細胞對TRAIL誘導的凋亡作用并不理想，這限制了TRAIL在抗腫瘤治療中的應用[9]。本實驗基于TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡，探討蛋白酶體通路等因素對于其治療效果的影響。

1資料與方法

1.1 一般資料

MG-132購自Cell Signaling公司;新西蘭新生牛血清購自Sigma-Aldrich公司;胰蛋白酶、四氮唑藍（MTT）及雙抗購自Sigma-Aldrich公司;Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒購自Ambion 公司;骨肉瘤細胞U-2 OS購自上海信然公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物干預方案? 骨肉瘤細胞U-2 OS置于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2飽和度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞進入對數(shù)生長期時，以1×105/ml濃度接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后給藥。單用TRAIL組選用400、600、800、1000 μg/L 4種濃度;單用MG-132組選用5、10、15、20 μmol/L 4種濃度，聯(lián)合應用組選用800 μg/L TRAIL以及15 μmol/L MG-132合用。在應用上述3種給藥方案24 h后，分別對誘導MG-63細胞凋亡狀況進行檢測。

1.2.2 Annexin V/PI雙染色流式細胞儀檢測細胞凋亡率? 實驗組給予400、600、800、1000 μg/L TRAIL，5、10、15、20 μmol/L MG-132以及聯(lián)合組，并設立空白對照組，24 h進行檢測。用配備好的洗滌液洗細胞3次，重懸細胞至1 ×106/ml，取100 μl 細胞（105cells）至5 ml管內(nèi)，加入5 μl 培養(yǎng)液混勻，室溫下避光培養(yǎng)20 min，每管加入400 μl 1×Binding Buffer，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測。

1.2.3 MTT法測定細胞的生長抑制效應? 將1×106/ml細胞接種于96孔板，每孔100 μl，貼壁后加入不同濃度藥物細胞培養(yǎng)基，每孔100 μl，每種濃度平行5孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl新配制的10 mg/ml的MTT，37℃繼續(xù)孵育分別于0、24、48、72 h，棄上清加150 μl DMSO溶解，混勻后在540 nm波長測定吸光度。 腫瘤細胞抑制率（%）= （1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.3 觀察指標

于0、24、48、72 h在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化及細胞抑制率。

1.4統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1 光鏡下觀察細胞形態(tài)

光鏡下可見單純應用TRAIL及MG-132 分別作用于骨肉瘤細胞U-2 OS后，隨時間推移，細胞形態(tài)出現(xiàn)相應變化，24 h后腫瘤細胞開始變小，48 h部分腫瘤細胞進一步變小并脫落，72 h后大多數(shù)腫瘤細胞脫落并聚集成團塊。TRAIL和MG-132聯(lián)合作用時，上述現(xiàn)象更明顯（圖1）。

2.2 流式細胞儀結(jié)果

2.2.1 單用TRAIL組流式細胞儀結(jié)果? 單用400、600、800、1000 μg/L TRAIL的細胞凋亡率分別為（5.7±1.0）%、（6.4±2.3）%、（7.1±2.5）%、（8.6±2.1）%，結(jié)果顯示，隨著給藥濃度的增加，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2）。

2.2.2 單用MG-132組流式細胞儀結(jié)果? 單用5、10、15、20 μmol/L的MG-132細胞凋亡率分別為（6.9±1.5）%、（7.8±1.3）%、（8.5±2.1）%、（9.2±1.3）%，結(jié)果顯示，隨著給藥的濃度，凋亡率也隨之增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3）。

2.2.3 聯(lián)合組流式細胞儀結(jié)果? 空白對照組、單用800 μg/L TRAIL組、單用15 μmol/L MG-132組及聯(lián)合組的細胞凋亡率分別為（2.8±0.6）%、（7.1±2.5）%、（8.5±2.1）%、（9.8±1.2）%，不同用藥濃度，凋亡率也隨之變化，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖4）。

流式細胞儀結(jié)果的比較

聯(lián)合組、單用TRAIL組和單用MG-132組分別與空白對照組比較，骨肉瘤細胞凋亡率均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且單用MG-132組高于單用TRAIL組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），聯(lián)合組骨肉瘤細胞凋亡率明顯高于單用TRAIL組和單用MG-132組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3 MTT測得抑制率結(jié)果

隨著時間的推移，細胞抑制率上升，而聯(lián)合組的抑制率明顯高于單用TRAIL組和MG-132組，在72 h處達到最大值[（82.32±2.54）%]，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖5）。

3討論

生物治療作為繼傳統(tǒng)腫瘤治療手段后的又一種治療方法，在腫瘤治療中越來越顯示出其特殊性及優(yōu)越性[10-11]。特別是對骨惡性腫瘤的治療，已有大量的基礎研究報告。TRAIL是1995年克隆的TNF超家族新成員，與其受體（TNF related apoptosis inducing ligand receptor，TRA ILR）相結(jié)合后能啟動細胞內(nèi)的調(diào)節(jié)細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導，誘導細胞凋亡，但對部分腫瘤細胞的作用不敏感[12-14]。

MG-132是泛素-蛋白酶體的阻斷劑，能有效阻斷多種調(diào)節(jié)蛋白的降解，在誘導細胞凋亡過程中起到重要作用。有研究認為蛋白質(zhì)的泛肽化與包括細胞凋亡在內(nèi)的許多細胞活動過程有關[15-17]。

近來有研究發(fā)現(xiàn)，泛肽-蛋白酶體通路可能參與了多種凋亡調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的降解，在細胞凋亡的調(diào)控中起著非常重要的作用。Soldalenkov等[18]發(fā)現(xiàn)，當泛肽-蛋白酶體阻斷后會引起某些細胞出現(xiàn)凋亡。推測：在TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡過程中存在某些調(diào)節(jié)蛋白，可大大提高TRAIL誘導凋亡的作用，而這些調(diào)節(jié)蛋白很大可能是由蛋白酶體通路所降解，阻斷凋亡的傳單，增加腫瘤細胞對TRAIL的抵抗性。泛肽-蛋白酶體阻斷后，可在很大程度上保證這些調(diào)節(jié)蛋白的存在，大大提高TRAIL的誘導腫瘤細胞凋亡的作用。本研究著重探討泛素-蛋白酶體與TRAIL誘導的細胞凋亡之間的相互關系。單一使用TRAIL誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡效果較差，聯(lián)合MG-132后抑制效果顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），顯示出一定的臨床應用價值。目前臨床上治療腫瘤的傳統(tǒng)方法是手術、放療、化療相結(jié)合的方法，但對正常細胞有極大的殺傷作用，限制了其治療效果。TRAIL以其高效低毒的生物學特點，給腫瘤治療帶來了新的希望[19-20]。其內(nèi)在機制并未被完全闡釋清晰，仍需進一步深入探討。

綜上所述，TRAIL可誘導骨肉瘤細胞U-2 OS凋亡，但效果不太理想?；旌鲜褂肕G-132后，可大大提高TRAIL誘導U-2 OS凋亡的效果。

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（收稿日期：2018-09-19? 本文編輯：許俊琴）