張敏

[摘要] 目的 研究普伐他汀（pravastatin，Pra）對人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和凋亡的影響及其聯(lián)合吉西他濱（gemcitabine，GEM）對該細(xì)胞的作用。 方法 MTT比色法測定普伐他汀對SW1990細(xì)胞生長的抑制作用。不同濃度普伐他汀處理細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。吉西他濱、普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用細(xì)胞48 h，MTT法測定各處理組的OD值，并計算相互作用指數(shù)。 結(jié)果 MTT比色法顯示普伐他汀對SW1990細(xì)胞具有抑制增殖的作用，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理SW1990細(xì)胞后，SW1990細(xì)胞出現(xiàn)典型的形態(tài)學(xué)改變，且凋亡百分率隨濃度增大而逐漸增加。普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用細(xì)胞后，GEM的IC50值降低。結(jié)論 普伐他汀具有抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用，普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對SW1990細(xì)胞具有協(xié)同抗瘤作用。

[關(guān)鍵詞] 普伐他??；吉西他濱；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中圖分類號] R735.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）27-0009-04

胰腺癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，在歐美等西方發(fā)達(dá)國家發(fā)病率高，致死率在美國僅次于結(jié)腸癌居第4位[1]。近年來，隨著環(huán)境污染加重、飲食結(jié)構(gòu)調(diào)整及糖尿病年輕化等原因，我國胰腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢[2]。胰腺癌起病隱匿，進(jìn)展迅速，確診時超過80%的患者已屬中晚期而失去手術(shù)機會，需采用以化療為主的綜合治療手段。吉西他濱為脫氧胞苷類似物，是治療進(jìn)展期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的一線標(biāo)準(zhǔn)藥物，但有效率不高，且易發(fā)生耐藥。如何提高化療藥物的敏感性并逆轉(zhuǎn)耐藥，是目前胰腺癌治療領(lǐng)域研究的難點和熱點。他汀類藥物通過抑制內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶——羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶，具有降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的作用，是臨床治療高脂血癥的主要藥物[3]，廣泛用于治療和預(yù)防其他心腦血管疾病[4]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除降膽固醇作用外，還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并能增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。本實驗初步研究了普伐他汀對人胰腺SW1990細(xì)胞的體外作用及其協(xié)同吉西他濱的抗瘤作用。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所。普伐他汀購自Sigma公司，將普伐他汀溶解、激活、滴定后加無菌蒸餾水配制成1 mmol/L備用。吉西他濱為市售齊魯制藥公司產(chǎn)品，溶解于無菌0.9%生理鹽水，按實驗設(shè)定用培養(yǎng)基稀釋成所需終濃度。胎牛血清為杭州四季青生物技術(shù)公司產(chǎn)品，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Sigma公司。試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，將SW1990細(xì)胞于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/mL、含鏈霉素100 U/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 實驗方法

1.3.1 MTT比色法檢測普伐他汀對SW1990細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液（濃度為1×105/mL），接種于96孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入含不同濃度普伐他汀的RPMI-1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24、48、72 h收集細(xì)胞，上機測定OD值（代表細(xì)胞存活率）。實驗設(shè)空白對照組（培養(yǎng)基調(diào)零）、細(xì)胞對照組（未經(jīng)普伐他汀處理）、含5、15、25 μmol/L普伐他汀的處理組，每組設(shè)6個平行孔，所有實驗重復(fù)3次。收集細(xì)胞前預(yù)先加入MTT液，培養(yǎng)4 h后于波長570 nm處測定OD值并計算細(xì)胞生長抑制率： 生長抑制率%=（細(xì)胞組OD值-處理組OD值）/（細(xì)胞組OD值-空白組OD值）×100%。

1.3.2 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 SW1990細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L普伐他汀，繼續(xù)生長48 h，培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并隨機拍照。

1.3.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率 將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀處理48h后收獲細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA分析并計算凋亡率。

1.3.4 MTT比色法檢測普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對SW1990細(xì)胞增殖的影響 將對數(shù)生長期的SW1990細(xì)胞接種于96孔板上，細(xì)胞貼壁后加入含不同組別、不同濃度藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞后上機測定OD值并計算不同組別細(xì)胞生長抑制率。實驗設(shè)空白對照組、細(xì)胞對照組、濃度為0.1、0.5、2 μg/mL單藥吉西他濱組、濃度為5、15、25 μmol/L普伐他汀分別聯(lián)合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組。

通過iobolanalysis分析按公式CI值=普伐他汀1/普伐他汀2+吉西他濱1/吉西他濱2計算兩藥聯(lián)合的相互作用指數(shù)（combination index，CI）。其中，普伐他汀1、吉西他濱1為兩藥聯(lián)合達(dá)到某一生長抑制率時各自的濃度，普伐他汀2、吉西他濱2為兩藥單獨應(yīng)用達(dá)到相同生長抑制率時的各自的濃度。CI值<1.0表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用；CI值=1.0表明兩藥聯(lián)合具有相加作用或無關(guān)作用；CI值>1.0表明兩藥聯(lián)合具有拮抗作用。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1普伐他汀對SW1990細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，5、15、25 μmol/L普伐他汀處理細(xì)胞24～72 h后，各處理組OD值逐漸下降，呈現(xiàn)明顯的劑量和時間依賴性（表1）。方差分析結(jié)果顯示同一作用時間，各組OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24 h 組別：F=99.905，P<0.05；48 h 組別：F=274.000，P<0.05；72 h 組別：F=316.670，P<0.05）。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

對照組細(xì)胞呈扁長形，形態(tài)規(guī)則、連接緊密。細(xì)胞經(jīng)不同濃度普伐他汀處理48 h后，出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞皺縮變形，有的胞質(zhì)中可見中空的空泡，細(xì)胞破裂增多，在細(xì)胞周圍可見大量裂解片段，細(xì)胞之間空隙增加，見圖1。

圖1 不同濃度普伐他汀作用SW1990細(xì)胞48 h（10×10）

2.3普伐他汀對SW1990細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示：SW1990細(xì)胞經(jīng)5、15、25 μmol/L普伐他汀處理48 h后，流式細(xì)胞儀測得的細(xì)胞凋亡率隨處理濃度增加逐漸升高。

2.4 普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對SW1990細(xì)胞增殖的影響

MTT比色法分析了普伐他汀聯(lián)合吉西他濱對SW1990細(xì)胞增殖的作用，如表2所示，0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱作用細(xì)胞后，OD值顯著低于細(xì)胞對照組（F=851.059，P<0.05）。5、15、25 μmol/L普伐他汀分別配伍聯(lián)合0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱，不同濃度普伐他汀聯(lián)合某一濃度吉西他濱后，聯(lián)合組OD值顯著低于該濃度單藥吉西他濱組0.1、0.5、2 μg/mL吉西他濱組別（F值分別為93.543、124.774、14.060，P均<0.05）。

根據(jù)公式計算出普伐他汀聯(lián)合吉西他濱作用SW1990細(xì)胞后的生長抑制率并繪制成抑制率曲線（圖3）。從抑制率曲線中可以看出聯(lián)合5、15、25 μmol/L普伐他汀可顯著降低吉西他濱的IC50值，且隨著普伐他汀濃度增加，吉西他濱的IC50值降低愈明顯。根據(jù)CI值公式，我們計算了普伐他汀聯(lián)合吉西他濱達(dá)到細(xì)胞生長抑制率為50%時的CI值，發(fā)現(xiàn)普伐他汀聯(lián)合吉西他濱的CI值均<1，說明普伐他汀和吉西他濱可協(xié)同抑制SW1990細(xì)胞增殖。

3 討論

HMG-CoA還原酶是內(nèi)源性膽固醇合成的限速酶。他汀類藥物包括辛伐他汀、美伐他汀、普伐他汀等，通過競爭性抑制HMG-CoA還原酶的活性阻滯甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）通路，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的合成，并能增加血清膽固醇的清除，從而起到降低膽固醇的作用。膽固醇合成過程中的中間產(chǎn)物MVA是體內(nèi)許多生物活性物質(zhì)的前體，如泛醌、血紅素A、異戊烯腺嘌呤、焦磷酸法呢酯（FPP）、焦磷酸牻牛兒基牻牛兒酯（GGPP）等[5]。他汀類藥物可通過阻礙MVA途徑從而抑制其一系列下游產(chǎn)物的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞生長、分化、凋亡及細(xì)胞間信號傳導(dǎo)，發(fā)揮調(diào)控腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[6-8]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的不斷深入，他汀類藥物的抗腫瘤作用日益受到重視。近年來一系列的研究表明，他汀類藥物對前列腺癌[9]、肺癌[10]、乳腺癌[11，12]、結(jié)直腸癌[13]、惡性膠質(zhì)瘤[14]、頭頸部腫瘤[15]等多種腫瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用。

本實驗通過MTT法觀察普伐他汀對胰腺癌細(xì)胞SW1990的影響，發(fā)現(xiàn)普伐他汀可明顯抑制細(xì)胞生長。如表1所示，不同濃度普伐他汀作用SW1990細(xì)胞24～72 h后，抑制率由14.47%增至65.37%。光學(xué)顯微鏡下，我們可以看到普伐他汀作用細(xì)胞后的凋亡形態(tài)學(xué)改變，DNA凝膠電泳則顯示藥物組出現(xiàn)階梯狀排列的DAN梯帶，說明普伐他汀可誘導(dǎo)SW1990細(xì)胞發(fā)生凋亡。在聯(lián)合用藥的實驗中，經(jīng)計算普伐他汀聯(lián)合吉西他濱的CI值均小于1，證實普伐他汀可增強吉西他濱的抑瘤作用，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用。實驗結(jié)果提示，在臨床應(yīng)用吉西他濱單藥或含有吉西他濱的聯(lián)合化療方案治療胰腺癌，同時加用普伐他汀，可能起到增加化療藥物敏感性、減少化療藥物劑量的作用，進(jìn)而提高進(jìn)展期或晚期胰腺癌患者的化療耐受性，改善生活質(zhì)量，延長生存期。

近年來越來越多的體外實驗和動物實驗證實他汀類藥物具有抗腫瘤作用，但確切的分子機制尚未闡明。本實驗的結(jié)果為臨床治療胰腺癌提供了一些有益的借鑒，關(guān)于普伐他汀抗胰腺癌細(xì)胞及增敏吉西他濱的作用機制尚待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2016-04-27）