王鑒++謝波

摘要：目的 探討CD146在骨肉瘤患者組織中的表達情況，并分析其與骨肉瘤臨床特征的關系。方法 采用免疫組化法檢測50例骨肉瘤患者組織中CD146的表達情況，并檢測用CD34標記的腫瘤微血管密度MVD，并利用RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標本中CD146的表達。結果 CD146在骨肉瘤組織中過高表達，其MVD值顯著高于骨肉瘤周圍非惡性組織， CD146的表達與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉移顯著相關（P<0.01），隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進展，CD146的表達明顯提高，且骨肉瘤組織中有肺結轉移組的陽性表達率顯著高于無肺轉移組。結論 CD146在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著十分重要的作用，其分子水平的高低可能可以成為衡量骨肉瘤疾病活動程度中的一個重要的指標。

關鍵詞：CD146；骨肉瘤；表達

Abstract：Objective To investigate the expression of CD146 in osteosarcoma tissues and the relationship with clinical and pathological characteristics. Methods The expression of CD146 and microvessel density （MVD） in 50 cases of osteosarcoma tissues was determined by Immunohistochemistry， and further detecting the expression of CD146 in osteosarcoma tissues by RT-qPCR and Western blot. Results CD146 was overexpressed in Human Osteosarcoma Tissues， and the MVD value was significantly higher than nonmalignant tissue surrounding in osteosarcoma， and the expression level of CD146 was correlated with Enncking stage and pulmonary metastasis（P<0.01）. With the progress of clinical stage and histological differentiation of osteosarcoma， expression of CD146 was increased， and expression of CD146 in osteosarcoma with pulmonary metastasis group was significantly higher than those without pulmonary metastasis. Conclusion CD146 is related to the occurrence and development of osteosarcoma closely， and should play an important role in the process.

Key words：CD146； Osteosarcoma； Expression

骨肉瘤是人類骨骼系統的惡性腫瘤中，發(fā)病率居首位，并且在青少年中也最為常見，其中在小兒骨惡性腫瘤發(fā)病率中約占5%，嚴重威脅了人類的健康。早期骨瘤肉患者（Enneking IIA期）一般臨床癥狀輕微，難以察覺，由于骨肉瘤發(fā)展迅速，所以多數骨肉瘤患者（約75%）在初診時已是中晚期（Enneking IIB/III期）。如今，由于新型的輔助化療結合外科治療的方法應用于骨肉瘤的治療取得了突破性進展，使得骨肉瘤患者 5 年內生存率提高至60%左右[1]，但是仍有約50%的骨肉瘤患者會發(fā)生肺轉移，一旦出現肺轉移，5年生存率僅10%～15% [2]。

腫瘤血管生成（tumor angiogenesis，TA）及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程的重要作用為骨肉瘤發(fā)生和侵襲轉移的機制研究提供了新的方向。惡性黑色素瘤細胞黏附分子（melanoma cell adhesion molecule， CD146）是腫瘤的血管生成過程重要的相關因子，它通過參與細胞間和細胞-細胞外基質之間的黏附作用促進腫瘤組織的血管生成，并且與多種腫瘤的擴散和轉移息息相關 [3-5]。研究表明CD146在人體多種惡性腫瘤如人類惡性黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌等中表達明顯增高[6]。但 CD146 在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中作用的基礎研究還很薄弱，本研究采用免疫組織化學方法檢測50 例人骨肉瘤組織中 CD146的表達，以 CD34 作標記，同時計數腫瘤組織的微血管密度（microvessel density，MVD），并結合RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標本中CD146的表達，探討它與骨肉瘤臨床特征的關系及其臨床意義，為骨肉瘤的治療研究提供實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來源于武漢某三甲醫(yī)院住院骨科患者，患者均簽署知情同意且在未接受治療前收集標本，包括30（60%）例男性和20（40%）例女性的惡性骨肉瘤組織、周圍惡性骨肉瘤組織及周圍非惡性組織，50例骨肉瘤患者的平均年齡為20歲（范圍從7～31），病理證實所有標本均為骨肉瘤。

1.2試劑及儀器 CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；內參基因：核糖體蛋白S18：上游引物5'-CGA TGG GCGGCG GAA AAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCAACACCACA-3'； QPCR反應儀為ABI 7500（ABI 公司）；日本Olympus BX51 光學顯微鏡；Real Time反應試劑盒（OMEGA公司）；逆轉錄試劑盒（Sigma公司）；總蛋白提取試劑盒（BestBio公司）。鼠抗人CD146單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司產品）。CD34 鼠抗人單克隆抗體、抗鼠即用型快速免疫組化MaxVisionTM 檢測試劑盒及DAB 染色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1 CD146及CD34 的免疫組化檢測 將骨肉瘤及骨肉瘤周圍非惡性組織標本制成4μm切片，參照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色。簡要過程如下：切片用二甲苯脫蠟后浸泡，高壓抗原修復，血清封閉加一抗，4℃孵育過夜，再復溫后加入二抗，孵育。用DAB 顯色，蘇木精對比染色后脫水、透明、封片。在光鏡下觀察結果。

1.3.2 免疫組化結果判定 CD146 以胞質及胞膜中出現棕黃色染色顆粒為陽性。微血管密度（microvessel density MVD）計數標準參照Weidner等校正并修改方法。采用 CD34 免疫組化染色標記血管內皮細胞，以胞質及胞膜中出現棕黃色染色顆粒為陽性。單個內皮細胞或細胞團，不管有沒有形成管腔，只要被抗體染色并與周圍的微血管、腫瘤細胞和其他連接組織分離，都認為是1個微血管，有平滑肌壁及管腔直徑約大于8個紅細胞直徑的血管排除在外。先用低倍鏡（×100）下在每一個標本中選擇3個微血管數最多的區(qū)域，在每一個區(qū)域中計數1個高倍鏡（×400）下的微血管數，取其均值為MVD值。

1.3.3 肉瘤組織中CD146的表達及western blot分析 提取組織樣本中總RNA，反轉錄得cDNA，以此為模板Real time PCR檢測，引物序列CD146：上游引物5'-GAAAAAGTGTGGCTGGAAGT-3'，下游引物5'-GTTGTCGTTGGTTGTCTC TT-3'；核糖體蛋白S18（RPS18）：上游引物5'-CGATGG GCGGCGGAAAAT A-3'，下游引物5'-CTGCTTTCCTCA ACACCAC A-3'。用ABI7500熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR實驗。擴增的反應程序：94℃ 5min，94℃ 40s，50℃ 40 s，72℃ 50s，40循環(huán)。實驗結果采用△△Ct法進行分析。提取樣品總蛋白，確定蛋白樣品的濃度后，加入等量樣品到每個加樣孔，進行WB檢測，經曝光、顯影及定影后，統計目的條帶灰度值。

1.4 統計學分析 應用SPSS 16.0軟件完成統計學處理。計量資料結果采用均數±標準差（x±s ）進行統計描述。計量資料采用t檢驗，計數資料采用分析。以P<0.05為差別有統計學意義，反之則為差別無統計學意義。

2 結果

2.1 CD146和CD34在骨肉瘤組織中表達 免疫組織化學染色結果顯示 CD146在骨肉瘤組織中多數呈陽性表達，在 50例骨肉瘤組織切片中，CD146 表達陽性 36 例，陰性 14 例，陽性率 72%。光學顯微鏡觀察發(fā)現 CD146 主要表達于骨肉瘤組織的血管內皮細胞，當胞膜或胞漿中呈現棕黃色顆粒即為陽性（Fig.1），否則判定為陰性；CD34 標記的血管內皮細胞，以胞質內出現棕黃色顆粒為陽性判斷標準（Fig.2），否則為陰性。染色結果顯示所有骨肉瘤切片中 CD34 均呈陽性表達，根據 Weidner 的計數方法，骨肉瘤組中的MVD平均值為48.68±4.00 ，周圍非惡性組織的MVD平均值為10.27±3.00，兩者差異顯著，具有統計學意義，P<0.01。通過檢驗結果比較發(fā)現，CD146的表達與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉移顯著相關（P<0.01），而與性別、年齡、腫瘤直徑無顯著關系（P>0.05）。

2.2 肉瘤組織中CD146 mRNA的表達情況 由表2可見，隨著臨床分期的增加以及組織分化的進展，CD146的表達明顯增加：其在III的表達量高于II、I期（P<0.05）；在周圍非惡性組織中的表達顯著低于I和II肉瘤組織中的表達（P<0.01）。表中數據顯示CD146在肉瘤組織中的高表達與其分期、組織分級密切相關。

2.3 肉瘤組織中CD146的western blot檢測 周圍非惡性組織組中CD146的表達水平均低于I，II和III組，相比差異顯著，P<0.05，有統計學意義；III組中CD146的平均表達水平顯著高于II和I組中的表達水平，P<0.05；II組中CD146的平均表達水平顯著高于I組中的表達水平，P<0.05。表明隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進展，CD146的表達有上升的趨勢。

圖3 骨肉瘤患者肉瘤組織中CD146的western blot檢測

3 討論

骨肉瘤已經成為嚴重危害青少年生命健康的 “殺手”之一，尋找更為有效的方法治療骨肉瘤已經迫在眉睫。腫瘤血管生成及其在腫瘤發(fā)生，侵襲和轉移過程的重要作用為骨肉瘤機制的基礎研究提供了新的方向和思路。眾所周知，腫瘤的生長需要通過血管供給氧及營養(yǎng)，并且惡性腫瘤細胞可進入其周圍的腫瘤血管，并通過這種途徑向周圍轉移擴散。因此，可以說腫瘤的發(fā)生發(fā)展的每一步，包括生長、浸潤、轉移和擴散都與TA這一關鍵步驟相關[6-8]。腫瘤處于無血管期時，主要通過周圍組織的彌散作用來獲取營養(yǎng)物質并清除代謝產物，當腫瘤增殖至一定的階段將啟動血管生成，進入血管期；但是由于新生的血管結構并不完整，相比成熟的正常血管，新生的血管更容易被腫瘤細胞沿新生血管開啟的膠原裂隙侵襲，從而遭到破壞。腫瘤組織中的新生血管越多，預示著腫瘤體增長的速度越快，轉移的可能性就越大，從而患者生存期就越短[9]。

CD146作為分子靶向或基因治療的靶向位點研究成為國內外學者研究的熱點。CD146 是屬于黏附分子（cell adhesion molecule，CAM）家族的一種膜糖蛋白[10]。CD146通過與其他成分如腫瘤細胞、血管內皮細胞、細胞外基質等發(fā)生作用，參與重組細胞骨架、維持細胞形態(tài)、誘導局部細胞聚集、促使細胞游走和調控癌細胞無限增殖等過程。Kang等[11]研究數據表明，在血管新生過程中，CD146起到了重要作用，其中包括了新生血管生成的多個環(huán)節(jié)，如促使內皮細胞增殖、黏附和遷移。CD146 調節(jié)腫瘤血管形成的機制可能是激活了MMP-2，后者能夠降解基膜和細胞外基質；激活生長因子，最主要是血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF），這種作用有利于腫瘤轉移和腫瘤血管形成[13]。

本研究采用免疫組織化學方法結合RT-qPCR和western blot方法檢測人骨肉瘤組織中 CD146的表達，探討它與骨肉瘤臨床特征的關系及其臨床意義。研究結果顯示，CD146在骨肉瘤組織中高表達，其MVD值顯著高于骨肉瘤周圍非惡性組織，并且利用RT-qPCR和western blot方法檢測骨肉瘤組織標本中CD146的表達也同樣證實了這個結論。同時，CD146的表達與骨肉瘤的Enneking 分期及有無肺轉移顯著相關（P<0.01），隨著骨肉瘤組織臨床分期及組織分化的進展，CD146的表達有上升的趨勢，表明其表達上調與腫瘤惡性發(fā)展呈正相關。且骨肉瘤組織中有肺結轉移組陽性表達率顯著高于無肺轉移組，這表明CD146在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中均起著十分重要的作用，其分子水平的高低可能可以成為衡量骨肉瘤疾病活動程度中的一個重要的指標。

參考文獻：

[1] 朱忠勝， 張春林. 骨肉瘤干細胞研究現狀[J]. 國際骨科學雜志， 2011， 32（5）： 296-299.

[2] Nagy N， Legendre H， Engels O， et al. Refined prognostic evaluation in colon carcinoma using immunohistochemical galectin fingerprinting[J].Cancer，2003，97（8）： 1849-1858.

[3] Tryzme lJ， Miskolci V， Castro-Alearaz S， et al. Interleukin-10 inhibits Proinflammatory chemokine release by neutrophils of the newborn without suppression of nuelear factor-κb[J]. PediatrRes， 2003， 54（3）： 382-386.

[4] Johnson. Cell adhesion molecules in the development and Progression of malignant melanoma[J]. Cancer Metastasis Rev， 1999， 18（3）： 345-357.

[5] Yan X， Lin Yang D， et al. A novel anti-CD146 monoclonal anti-body， AA98， inhibits angiogenesis and tumor growth[J]. Blood， 2003， 102（l）： 184-191.

[6] 孫 敏， 王以新. CD146在多種腫瘤中的表達與作用[J]. 中國醫(yī)藥科學， 2012， 2（4）： 44-45.

[7] McGary EC， Heimberger A， Mills L， et al. A fully human anti-melanoma cellular adhesion molecule/MUC18 antibody inhibits spontaneous pulmonarymetastasis of osteosarcoma cells in vivo[J]. Clin Cancer Res， 2003， 9（17）： 6560-6566.

[8] Todorovic V， Sersa G， Cemazar M. Gene electrotransfer of siRNAs against CD146 inhibits migration and invasion of human malignant melanoma cells SK-MEL28[J]. Cancer Gene Ther， 2013， 20（3）： 208-210.

[9] 龍兵，董自強，袁紅綱，等.尿路上皮癌組織中CD146表達、MVD變化及意義[J]. 山東醫(yī)藥， 2010， 50（6）： 20-22.

[10] Shih IM. The role of CDl46（Mel-CAM）in biology and pathology[J].JPathol， 1999， 89（1）： 4-11.

[11] Kang Y， Wang F， Feng J， et al.Knockdown of CD146 reduces the migration and proliferation of human endothelial cells[J]. Cell Res，2006，16（3）： 313-318.

[12] Harhouri K， Kebir A， Guillet B， et al. Soluble CD146 displays angiogenic properties and promotes neovascularization in experimental hind-limb ischemia[J]. Blood， 2010， 115（18）： 3843-3851編輯/馮焱