蘇萌萌,孫芝蘭,劉 芳,吳海虹,張新笑,諸永志,王道營(yíng),徐為民,3,羅 章
(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院,西藏 林芝 860000;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014;3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210095)
由微生物引起的食品腐敗變質(zhì)一直嚴(yán)重威脅著食品安全[1]。雞肉作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源[2],由于其具有適宜微生物生長(zhǎng)的pH、水分活度、營(yíng)養(yǎng)成分等條件,所以在生產(chǎn)運(yùn)輸和銷售等過(guò)程中很容易受到腐敗菌的污染。雞肉中的腐敗菌種類眾多,主要包括沙門氏菌、假單胞菌、腐生葡萄球菌、變形桿菌等[3-5],嚴(yán)重影響著雞肉的品質(zhì),所以控制微生物污染是保證肉品品質(zhì)的重點(diǎn)[6]。
綠原酸作為植物體有氧呼吸的天然產(chǎn)物[7],具有生物活性[8-9]。在不對(duì)食物造成任何有害作用的情況下,對(duì)多種腐敗菌均有一定的抑菌效果[10-12],這使得綠原酸作為生物防腐劑越來(lái)越受人們關(guān)注,然而綠原酸的抑菌機(jī)理尚不完全明了,亦無(wú)較系統(tǒng)的關(guān)于綠原酸抑菌機(jī)理的報(bào)道。據(jù)此,本研究就從杜仲中提取出來(lái)的綠原酸對(duì)雞肉中主要的腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機(jī)理進(jìn)行深入探討,為綠原酸的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。
菌種:熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)分離自市場(chǎng)上的冰鮮雞肉。
培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB) 由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA) 由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。
試劑:綠原酸由陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn),ATP分析試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、cFDA染料、PI染料由碧云天公司生產(chǎn),diSC3(5)、valinomycin、nigericin 由Sigma公司生產(chǎn),戊二醛由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。
Ultra View VOX激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自珀金埃爾默公司,掃描電鏡 EVOMA10/LS10 購(gòu)自德國(guó)Zeiss Oberkochen公司,水浴鍋購(gòu)自國(guó)華電器有限公司,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Herolab公司,Anke TGL-16B離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠,LDZX-50KBS型滅菌鍋購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠,JY5002型電子天平購(gòu)自上海良平儀器儀表有限公司,SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠,SW-CJ-1FD型無(wú)菌操作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。
1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng) 將指示菌接種于NB培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后重新轉(zhuǎn)接到新的NB培養(yǎng)基中,重復(fù)此操作2到3次后,將菌種與滅過(guò)菌的體積濃度30%甘油以 1∶1的比例均勻混合,保存于-40 ℃的冰箱中。使用前,將凍存菌種解凍后,體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中,37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)12 h備用。
1.3.2 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)的測(cè)定 配制菌懸液:將體積濃度2%指示菌接種于NB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后收集菌株,重懸到生理鹽水中,按10倍稀釋后將菌懸液稀釋到106CFU/ml。吸收0.5 ml加入到4.5 ml NB培養(yǎng)基中,用槍頭吹勻待用。
MIC、MBC的測(cè)定:從配好的含10 mg/ml綠原酸的NB培養(yǎng)液中吸200 μl至96孔板中,采用二倍稀釋法將綠原酸稀釋到系列質(zhì)量濃度 (0.1562 5~10.000 0 mg/ml)。在96孔板上每孔加100 μl不同質(zhì)量濃度的綠原酸溶液和100 μl配制好的菌懸液,最終菌液為 5×105CFU/ml[13]。以NB培養(yǎng)液加菌懸液作為對(duì)照,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)OD600,以抑制菌株生長(zhǎng)的最低綠原酸質(zhì)量濃度為MIC。在MIC的基礎(chǔ)上,處理2 h時(shí),從每孔中取10 μl混合菌液加到NA培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。以殺滅99.9%細(xì)菌(未見(jiàn)菌落生長(zhǎng))的最低綠原酸質(zhì)量濃度為MBC[14]。
1.3.3 掃描電鏡 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后,將1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸加入菌液中作為處理組,同體積PBS緩沖液加菌液為對(duì)照組。37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)3 h后6 000 r/min離心10 min,用PBS緩沖液洗滌2次。將菌液固定于體積濃度2.5%的戊二醛緩沖液中,4 ℃ 24 h,2 500 r/min 4 ℃離心10 min,去上清液,加蒸餾水放置10 min再次離心,重復(fù)操作3次,以50%、70%、80%、90%的乙醇按順序依次洗滌,每次洗滌后放置10 min,離心,加入100%的乙醇后放置30 min,將菌泥固定于鏡片上,在通風(fēng)櫥中風(fēng)干,噴金后在掃描電鏡下觀察、拍照[15-16]。
1.3.4 胞外ATP的檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后,離心、用PBS緩沖液洗滌3次后,重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心,取上清液待用。以未加入綠原酸處理的懸浮液作為對(duì)照。采用熒光標(biāo)記法,具體操作步驟參照碧云天ATP試劑盒說(shuō)明書(shū)。試驗(yàn)重復(fù)操作3次。
1.3.5 胞外蛋白質(zhì)的檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后,離心、重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心,取上清液待用。采用Bradford法,利用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)使溶液被染為藍(lán)色[17],測(cè)定595 nm處的吸光值,根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的體積計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。以指示菌加PBS緩沖液作為對(duì)照組,試驗(yàn)重復(fù)3次。具體操作步驟參照碧云天Bradford蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。
1.3.6 膜電位的檢測(cè) 采用熒光探針diSC3(5)測(cè)定指示菌細(xì)胞膜電位[18]。將已活化的指示菌按體積濃度2%接種培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后,離心、重懸到PBS緩沖液中。將0.5 mmoL/L的diSC3(5)加入到菌懸液中,放置15 min,向菌懸液中加入100 mmoL/L KCl用以平衡胞內(nèi)外K+濃度。用移液槍各吸取1 ml上述菌懸液,加入1 μmoL/L valinomycin、nigericin和1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸,取1 ml菌懸液作為空白對(duì)照。酶標(biāo)儀測(cè)其熒光強(qiáng)度(ex=622 nm,em=670 nm),每2 min測(cè)定1次,測(cè)定10 min。試驗(yàn)重復(fù)操作3次。
1.3.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后加入 1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸,37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)1 h,以同體積PBS緩沖液加菌液為對(duì)照組。8 000 r/min離心3 min,去上清液后加入PBS緩沖液洗滌1次,離心。將菌體重懸在1 ml PBS緩沖液中,加入50 μl熒光探針cFDA,37 ℃孵育15 min,加入15 μl熒光染液PI,37 ℃ 孵育15 min,8 000 r/min離心3 min后將菌泥重懸在1 ml PBS緩沖液,重復(fù)操作3次,用移液槍吸取2 μl混合菌液于載玻片上,蓋上蓋玻片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。
試驗(yàn)結(jié)果如表1,綠原酸對(duì)于熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌具有抑菌、殺菌作用。MIC和MBC均為5 mg/ml。
表1綠原酸對(duì)熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的MIC、MBC
Table1Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)andminimalbactericidalconcentration(MBC)ofPseudomonasfluorescensandStaphylococcussaprophyticustreatedbychlorogenicacid
菌種MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)熒光假單胞菌5.05.0腐生葡萄球菌5.05.0
利用掃描電鏡對(duì)微生物進(jìn)行觀察可以更直觀地掌握微生物的形態(tài)[16]。如圖1所示,未加入綠原酸的對(duì)照組中,熒光假單胞菌在電鏡下呈飽滿、圓潤(rùn)桿狀,菌體完整,表面細(xì)滑有光澤,充滿活力。經(jīng)過(guò)綠原酸處理3 h后,熒光假單胞菌表面粗糙,大多數(shù)菌體扁平,色澤也變得暗淡,菌體變形嚴(yán)重,出現(xiàn)明顯孔洞;未加入綠原酸的對(duì)照組中,腐生葡萄球菌在電鏡下呈飽滿的球狀,菌體完整,色澤明亮,體態(tài)圓潤(rùn)。經(jīng)過(guò)綠原酸處理3 h后,部分菌體色澤變暗,菌體表面有絮絨狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn),大多數(shù)菌體有凹陷和孔洞出現(xiàn)。說(shuō)明綠原酸能夠破壞熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的表面結(jié)構(gòu),使細(xì)胞受損嚴(yán)重。并且綠原酸對(duì)熒光假單胞菌的作用效果更強(qiáng)。
A:熒光假單胞菌;B:腐生葡萄球菌。圖1 綠原酸處理后的熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌掃描電鏡結(jié)果Fig.1 SEM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid
2.3.1 綠原酸處理對(duì)ATP流失的影響 胞外ATP來(lái)源于細(xì)胞的釋放,其含量的測(cè)定直接可以說(shuō)明細(xì)胞膜的受損情況[19]。ATP含量如圖2所示,在未加入綠原酸的對(duì)照組中,熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外ATP含量隨著時(shí)間的增加均保持在50 nmol/ml以內(nèi),而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中,熒光假單胞菌的胞外ATP含量在處理1 h后明顯呈上升趨勢(shì),在2.5 h內(nèi)增加到263 nmol/ml;腐生葡萄球菌的胞外ATP含量在處理1 h后呈明顯上升趨勢(shì),在2.5 h內(nèi)增加到230 nmol/ml。結(jié)果說(shuō)明綠原酸導(dǎo)致了熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞膜的受損,從而使胞內(nèi)ATP流失。隨著綠原酸處理的時(shí)間越長(zhǎng),細(xì)胞膜的受損情況越嚴(yán)重;相對(duì)于熒光假單胞菌,腐生葡萄球菌的耐抗性可能更強(qiáng)。
圖2 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外ATP濃度Fig.2 Extracellular ATP concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid
2.3.2 綠原酸對(duì)胞外蛋白的影響 如圖3所示,在未加入綠原酸的對(duì)照組中,2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度分別為12.35 μg/ml和13.87 μg/ml。而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中,2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度上升為321.25 μg/ml和330.79 μg/ml。由此可見(jiàn),加入5 mg/ml綠原酸的處理組胞外蛋白質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未加入綠原酸處理的對(duì)照組,說(shuō)明綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜有明顯影響,通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲透到胞外,綠原酸處理的時(shí)間越長(zhǎng)蛋白質(zhì)滲透越明顯。
圖3 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度Fig.3 Extracellular protein concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid
2.3.3 綠原酸對(duì)膜電位(△φ)的影響 利用熒光探針diSC3(5)測(cè)定指示菌的膜電位,當(dāng)指示菌細(xì)胞膜破損時(shí),diSC3(5)會(huì)滲透到胞外使測(cè)定的熒光量增強(qiáng),膜電位發(fā)生變化。利用尼日利亞菌素(nigericin)能夠保持細(xì)胞最大電位,纈氨霉素(valinomycin)能夠完全破壞細(xì)胞電位的原理,將二者設(shè)置為陰性和陽(yáng)性對(duì)照[20]。如圖4、圖5所示,A為熒光假單胞菌未加入綠原酸的對(duì)照組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到2 784,而加入綠原酸的處理組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到12 335;B為腐生葡萄球菌未加入綠原酸的對(duì)照組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到2 720,而加入綠原酸的處理組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到14 208。2種指示菌在加入綠原酸處理2 min后,熒光值迅速增加,這說(shuō)明綠原酸造成熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞膜損傷,膜電位被嚴(yán)重破壞。
圖4 綠原酸處理后熒光假單胞菌的膜電位Fig.4 The membrane potential of P. fluorescens treated by chlorogenic acid
圖5 綠原酸處理后腐生葡萄球菌的膜電位Fig.5 The membrane potential of S. saprophyticus treated by chlorogenic acid
2.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 通過(guò)cFDA染料、PI染料對(duì)細(xì)胞熒光染色,二者滲入細(xì)胞的能力不同,在激光掃描共聚焦顯微鏡下,cFDA能夠較容易穿過(guò)細(xì)胞膜,將健康細(xì)胞染色呈現(xiàn)綠色熒光;PI不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜,但能使致死細(xì)胞染色呈現(xiàn)紅色熒光,而亞致死細(xì)胞在顯微鏡下將紅色、綠色熒光疊加呈現(xiàn)黃色熒光[21]。如圖6所示,A為熒光假單胞菌,B為腐生葡萄球菌。未加入綠原酸的對(duì)照組在顯微鏡下可以明顯看到絕大多數(shù)的菌體呈綠色熒光,幾乎沒(méi)有菌體表面呈紅色,這說(shuō)明未加入綠原酸的對(duì)照組菌體健康,生長(zhǎng)狀況良好;加入綠原酸的處理組在顯微鏡下,可以看到熒光假單胞菌大多數(shù)菌體都被染成紅色熒光,部分菌體呈現(xiàn)綠色和黃色熒光,腐生葡萄球菌也呈現(xiàn)出大量紅色熒光。這說(shuō)明經(jīng)綠原酸處理后的2種指示菌細(xì)胞膜均有不同程度的受損,而綠原酸對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的作用比腐生葡萄球菌更強(qiáng)一些。
A:熒光假單胞菌;B:腐生葡萄球菌。圖6 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌在共聚焦顯微鏡下的狀態(tài)Fig.6 CLSM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid
本研究通過(guò)測(cè)定綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度、最小殺菌質(zhì)量濃度,利用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),對(duì)胞外ATP、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定觀察胞內(nèi)大分子物質(zhì)的泄漏情況,以及根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果和膜電位的測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證膜損傷情況,深入探究綠原酸對(duì)雞肉腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機(jī)理。得到以下結(jié)論:1)綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌這2種指示菌具有抑菌、殺菌效果。2)綠原酸對(duì)2種指示菌的最小抑菌質(zhì)量濃度、最小殺菌質(zhì)量濃度為5 mg/ml。3)綠原酸是通過(guò)作用于2種指示菌的細(xì)胞膜,使細(xì)胞膜發(fā)生損傷從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP等大分子物質(zhì)泄漏,膜電位被破壞,最終達(dá)到抑菌、殺菌效果。