蘇萌萌，孫芝蘭，劉 芳，吳海虹，張新笑，諸永志，王道營(yíng)，徐為民,3,羅 章

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095)

由微生物引起的食品腐敗變質(zhì)一直嚴(yán)重威脅著食品安全[1]。雞肉作為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來(lái)源[2]，由于其具有適宜微生物生長(zhǎng)的pH、水分活度、營(yíng)養(yǎng)成分等條件，所以在生產(chǎn)運(yùn)輸和銷售等過(guò)程中很容易受到腐敗菌的污染。雞肉中的腐敗菌種類眾多，主要包括沙門氏菌、假單胞菌、腐生葡萄球菌、變形桿菌等[3-5]，嚴(yán)重影響著雞肉的品質(zhì)，所以控制微生物污染是保證肉品品質(zhì)的重點(diǎn)[6]。

綠原酸作為植物體有氧呼吸的天然產(chǎn)物[7]，具有生物活性[8-9]。在不對(duì)食物造成任何有害作用的情況下，對(duì)多種腐敗菌均有一定的抑菌效果[10-12]，這使得綠原酸作為生物防腐劑越來(lái)越受人們關(guān)注，然而綠原酸的抑菌機(jī)理尚不完全明了，亦無(wú)較系統(tǒng)的關(guān)于綠原酸抑菌機(jī)理的報(bào)道。據(jù)此，本研究就從杜仲中提取出來(lái)的綠原酸對(duì)雞肉中主要的腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機(jī)理進(jìn)行深入探討，為綠原酸的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)分離自市場(chǎng)上的冰鮮雞肉。

培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB) 由北京奧博星生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA) 由北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

試劑：綠原酸由陜西慧科植物開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn),ATP分析試劑盒、Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、cFDA染料、PI染料由碧云天公司生產(chǎn),diSC3(5)、valinomycin、nigericin 由Sigma公司生產(chǎn),戊二醛由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra View VOX激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自珀金埃爾默公司，掃描電鏡 EVOMA10/LS10 購(gòu)自德國(guó)Zeiss Oberkochen公司，水浴鍋購(gòu)自國(guó)華電器有限公司，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Herolab公司，Anke TGL-16B離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠，LDZX-50KBS型滅菌鍋購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，JY5002型電子天平購(gòu)自上海良平儀器儀表有限公司，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，SW-CJ-1FD型無(wú)菌操作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng) 將指示菌接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后重新轉(zhuǎn)接到新的NB培養(yǎng)基中，重復(fù)此操作2到3次后，將菌種與滅過(guò)菌的體積濃度30%甘油以 1∶1的比例均勻混合，保存于-40 ℃的冰箱中。使用前，將凍存菌種解凍后，體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)12 h備用。

1.3.2 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)的測(cè)定 配制菌懸液：將體積濃度2%指示菌接種于NB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后收集菌株，重懸到生理鹽水中,按10倍稀釋后將菌懸液稀釋到106CFU/ml。吸收0.5 ml加入到4.5 ml NB培養(yǎng)基中，用槍頭吹勻待用。

MIC、MBC的測(cè)定：從配好的含10 mg/ml綠原酸的NB培養(yǎng)液中吸200 μl至96孔板中，采用二倍稀釋法將綠原酸稀釋到系列質(zhì)量濃度 (0.1562 5～10.000 0 mg/ml)。在96孔板上每孔加100 μl不同質(zhì)量濃度的綠原酸溶液和100 μl配制好的菌懸液，最終菌液為 5×105CFU/ml[13]。以NB培養(yǎng)液加菌懸液作為對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)OD600，以抑制菌株生長(zhǎng)的最低綠原酸質(zhì)量濃度為MIC。在MIC的基礎(chǔ)上，處理2 h時(shí)，從每孔中取10 μl混合菌液加到NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。以殺滅99.9%細(xì)菌(未見(jiàn)菌落生長(zhǎng))的最低綠原酸質(zhì)量濃度為MBC[14]。

1.3.3 掃描電鏡 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，將1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸加入菌液中作為處理組，同體積PBS緩沖液加菌液為對(duì)照組。37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)3 h后6 000 r/min離心10 min，用PBS緩沖液洗滌2次。將菌液固定于體積濃度2.5%的戊二醛緩沖液中，4 ℃ 24 h，2 500 r/min 4 ℃離心10 min，去上清液，加蒸餾水放置10 min再次離心，重復(fù)操作3次，以50%、70%、80%、90%的乙醇按順序依次洗滌，每次洗滌后放置10 min，離心，加入100%的乙醇后放置30 min，將菌泥固定于鏡片上，在通風(fēng)櫥中風(fēng)干，噴金后在掃描電鏡下觀察、拍照[15-16]。

1.3.4 胞外ATP的檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，離心、用PBS緩沖液洗滌3次后，重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心，取上清液待用。以未加入綠原酸處理的懸浮液作為對(duì)照。采用熒光標(biāo)記法，具體操作步驟參照碧云天ATP試劑盒說(shuō)明書(shū)。試驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.3.5 胞外蛋白質(zhì)的檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，離心、重懸到PBS緩沖液中。加入1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸培養(yǎng)0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后離心，取上清液待用。采用Bradford法，利用考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合的特點(diǎn)使溶液被染為藍(lán)色[17]，測(cè)定595 nm處的吸光值，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的體積計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。以指示菌加PBS緩沖液作為對(duì)照組，試驗(yàn)重復(fù)3次。具體操作步驟參照碧云天Bradford蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.6 膜電位的檢測(cè) 采用熒光探針diSC3(5)測(cè)定指示菌細(xì)胞膜電位[18]。將已活化的指示菌按體積濃度2%接種培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，離心、重懸到PBS緩沖液中。將0.5 mmoL/L的diSC3(5)加入到菌懸液中，放置15 min，向菌懸液中加入100 mmoL/L KCl用以平衡胞內(nèi)外K+濃度。用移液槍各吸取1 ml上述菌懸液，加入1 μmoL/L valinomycin、nigericin和1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸，取1 ml菌懸液作為空白對(duì)照。酶標(biāo)儀測(cè)其熒光強(qiáng)度(ex=622 nm，em=670 nm)，每2 min測(cè)定1次，測(cè)定10 min。試驗(yàn)重復(fù)操作3次。

1.3.7 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè) 將已活化的指示菌按體積濃度2%接種于NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后加入 1×MIC質(zhì)量濃度的綠原酸，37 ℃ 200 r/min搖床培養(yǎng)1 h，以同體積PBS緩沖液加菌液為對(duì)照組。8 000 r/min離心3 min，去上清液后加入PBS緩沖液洗滌1次，離心。將菌體重懸在1 ml PBS緩沖液中，加入50 μl熒光探針cFDA，37 ℃孵育15 min，加入15 μl熒光染液PI，37 ℃ 孵育15 min，8 000 r/min離心3 min后將菌泥重懸在1 ml PBS緩沖液，重復(fù)操作3次，用移液槍吸取2 μl混合菌液于載玻片上，蓋上蓋玻片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

試驗(yàn)結(jié)果如表1，綠原酸對(duì)于熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌具有抑菌、殺菌作用。MIC和MBC均為5 mg/ml。

表1綠原酸對(duì)熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的MIC、MBC

Table1Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)andminimalbactericidalconcentration(MBC)ofPseudomonasfluorescensandStaphylococcussaprophyticustreatedbychlorogenicacid

菌種MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)熒光假單胞菌5.05.0腐生葡萄球菌5.05.0

2.2 綠原酸對(duì)菌種形態(tài)的影響

利用掃描電鏡對(duì)微生物進(jìn)行觀察可以更直觀地掌握微生物的形態(tài)[16]。如圖1所示，未加入綠原酸的對(duì)照組中，熒光假單胞菌在電鏡下呈飽滿、圓潤(rùn)桿狀，菌體完整，表面細(xì)滑有光澤，充滿活力。經(jīng)過(guò)綠原酸處理3 h后，熒光假單胞菌表面粗糙，大多數(shù)菌體扁平，色澤也變得暗淡，菌體變形嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯孔洞；未加入綠原酸的對(duì)照組中，腐生葡萄球菌在電鏡下呈飽滿的球狀，菌體完整，色澤明亮，體態(tài)圓潤(rùn)。經(jīng)過(guò)綠原酸處理3 h后，部分菌體色澤變暗，菌體表面有絮絨狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，大多數(shù)菌體有凹陷和孔洞出現(xiàn)。說(shuō)明綠原酸能夠破壞熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的表面結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞受損嚴(yán)重。并且綠原酸對(duì)熒光假單胞菌的作用效果更強(qiáng)。

A：熒光假單胞菌；B：腐生葡萄球菌。圖1 綠原酸處理后的熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌掃描電鏡結(jié)果Fig.1 SEM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3 綠原酸對(duì)菌種細(xì)胞膜的影響

2.3.1 綠原酸處理對(duì)ATP流失的影響 胞外ATP來(lái)源于細(xì)胞的釋放，其含量的測(cè)定直接可以說(shuō)明細(xì)胞膜的受損情況[19]。ATP含量如圖2所示，在未加入綠原酸的對(duì)照組中，熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外ATP含量隨著時(shí)間的增加均保持在50 nmol/ml以內(nèi)，而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中，熒光假單胞菌的胞外ATP含量在處理1 h后明顯呈上升趨勢(shì)，在2.5 h內(nèi)增加到263 nmol/ml；腐生葡萄球菌的胞外ATP含量在處理1 h后呈明顯上升趨勢(shì)，在2.5 h內(nèi)增加到230 nmol/ml。結(jié)果說(shuō)明綠原酸導(dǎo)致了熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞膜的受損，從而使胞內(nèi)ATP流失。隨著綠原酸處理的時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞膜的受損情況越嚴(yán)重；相對(duì)于熒光假單胞菌，腐生葡萄球菌的耐抗性可能更強(qiáng)。

圖2 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外ATP濃度Fig.2 Extracellular ATP concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.2 綠原酸對(duì)胞外蛋白的影響 如圖3所示，在未加入綠原酸的對(duì)照組中，2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度分別為12.35 μg/ml和13.87 μg/ml。而在加入5 mg/ml綠原酸的處理組中，2.5 h熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度上升為321.25 μg/ml和330.79 μg/ml。由此可見(jiàn)，加入5 mg/ml綠原酸的處理組胞外蛋白質(zhì)量濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未加入綠原酸處理的對(duì)照組，說(shuō)明綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的細(xì)胞膜有明顯影響，通過(guò)改變細(xì)胞膜通透性導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)滲透到胞外，綠原酸處理的時(shí)間越長(zhǎng)蛋白質(zhì)滲透越明顯。

圖3 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌的胞外蛋白質(zhì)量濃度Fig.3 Extracellular protein concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.3 綠原酸對(duì)膜電位(△φ)的影響 利用熒光探針diSC3(5)測(cè)定指示菌的膜電位，當(dāng)指示菌細(xì)胞膜破損時(shí)，diSC3(5)會(huì)滲透到胞外使測(cè)定的熒光量增強(qiáng)，膜電位發(fā)生變化。利用尼日利亞菌素(nigericin)能夠保持細(xì)胞最大電位，纈氨霉素(valinomycin)能夠完全破壞細(xì)胞電位的原理，將二者設(shè)置為陰性和陽(yáng)性對(duì)照[20]。如圖4、圖5所示，A為熒光假單胞菌未加入綠原酸的對(duì)照組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到2 784，而加入綠原酸的處理組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到12 335；B為腐生葡萄球菌未加入綠原酸的對(duì)照組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到2 720，而加入綠原酸的處理組在測(cè)定的10 min內(nèi)熒光值增加到14 208。2種指示菌在加入綠原酸處理2 min后，熒光值迅速增加，這說(shuō)明綠原酸造成熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌細(xì)胞膜損傷，膜電位被嚴(yán)重破壞。

圖4 綠原酸處理后熒光假單胞菌的膜電位Fig.4 The membrane potential of P. fluorescens treated by chlorogenic acid

圖5 綠原酸處理后腐生葡萄球菌的膜電位Fig.5 The membrane potential of S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察 通過(guò)cFDA染料、PI染料對(duì)細(xì)胞熒光染色，二者滲入細(xì)胞的能力不同，在激光掃描共聚焦顯微鏡下,cFDA能夠較容易穿過(guò)細(xì)胞膜，將健康細(xì)胞染色呈現(xiàn)綠色熒光；PI不能穿過(guò)完整的細(xì)胞膜，但能使致死細(xì)胞染色呈現(xiàn)紅色熒光，而亞致死細(xì)胞在顯微鏡下將紅色、綠色熒光疊加呈現(xiàn)黃色熒光[21]。如圖6所示，A為熒光假單胞菌，B為腐生葡萄球菌。未加入綠原酸的對(duì)照組在顯微鏡下可以明顯看到絕大多數(shù)的菌體呈綠色熒光，幾乎沒(méi)有菌體表面呈紅色，這說(shuō)明未加入綠原酸的對(duì)照組菌體健康，生長(zhǎng)狀況良好；加入綠原酸的處理組在顯微鏡下，可以看到熒光假單胞菌大多數(shù)菌體都被染成紅色熒光，部分菌體呈現(xiàn)綠色和黃色熒光，腐生葡萄球菌也呈現(xiàn)出大量紅色熒光。這說(shuō)明經(jīng)綠原酸處理后的2種指示菌細(xì)胞膜均有不同程度的受損，而綠原酸對(duì)熒光假單胞菌細(xì)胞膜的作用比腐生葡萄球菌更強(qiáng)一些。

A：熒光假單胞菌；B：腐生葡萄球菌。圖6 綠原酸處理后熒光假單胞菌、腐生葡萄球菌在共聚焦顯微鏡下的狀態(tài)Fig.6 CLSM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)測(cè)定綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度、最小殺菌質(zhì)量濃度，利用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，對(duì)胞外ATP、蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測(cè)定觀察胞內(nèi)大分子物質(zhì)的泄漏情況，以及根據(jù)激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察的結(jié)果和膜電位的測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證膜損傷情況，深入探究綠原酸對(duì)雞肉腐敗菌(熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌機(jī)理。得到以下結(jié)論：1)綠原酸對(duì)熒光假單胞菌和腐生葡萄球菌這2種指示菌具有抑菌、殺菌效果。2)綠原酸對(duì)2種指示菌的最小抑菌質(zhì)量濃度、最小殺菌質(zhì)量濃度為5 mg/ml。3)綠原酸是通過(guò)作用于2種指示菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生損傷從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP等大分子物質(zhì)泄漏，膜電位被破壞，最終達(dá)到抑菌、殺菌效果。