郭津廷，高玉亮，張 雁，李葵花

(1.延邊大學 農(nóng)學院，吉林 延吉 133002；2.延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學院，吉林 龍井 133400； 3.吉林省吉林市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，吉林 吉林 132000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)塊莖的形成經(jīng)過匍匐莖發(fā)生、匍匐莖伸長、匍匐莖縱向生長停止、匍匐莖頂端輻射生長、塊莖發(fā)生和膨大過程[1-2]。一般情況下，適當生理年齡的植株在短日照和低溫條件下容易誘導塊莖。在此過程中植株葉片、匍匐莖及塊莖中會出現(xiàn)激素表達量的變化，引起與光周期相關基因、激素相關基因及塊莖形成相關基因等一系列基因的表達與關閉，引起干物質(zhì)積累與蔗糖的合成運輸量的變化[3-6]。在馬鈴薯塊莖形成和發(fā)育不同階段，一些轉(zhuǎn)錄因子如POTM1[7]、POTH[8]、StBELS[9]和擬南芥CONSTANS(AtCO)蛋白的同源序列單獨或與其他因子共同調(diào)節(jié)馬鈴薯塊莖發(fā)育[10]。FT-like基因StSP6A的高表達促進馬鈴薯植株形成較多數(shù)量的塊莖[11]。最近研究表明，適當酸處理可增加馬鈴薯試管薯和無土栽培微型薯的數(shù)量[12-13]。經(jīng)酸處理的馬鈴薯植株，可增加其葉片的蔗糖含量，增強蔗糖合成酶及淀粉合成相關的腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的活性及SOD、POD、CAT活性，從而增加馬鈴薯塊莖數(shù)量[12,14]，但酸處理對塊莖形成相關基因表達量的變化研究鮮有報道。因此，本研究通過酸處理植株不同時期的匍匐莖為試材，測定了其匍匐莖中光周期、激素以及塊莖形成相關基因表達量的變化，解析了酸處理促進塊莖形成的機理，為脅迫條件下塊莖形成的研究奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與地點

供試材料為馬鈴薯東農(nóng)303的脫毒組培苗。試驗于2017年3-9月在延邊大學農(nóng)學院玻璃溫室內(nèi)采用珍珠巖基質(zhì)無土栽培的方式進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 組培脫毒苗移栽及營養(yǎng)液 馬鈴薯組培苗單葉節(jié)莖段繼代于MS(含20 g/L蔗糖)液體培養(yǎng)基中，在25 ℃，30 μmol/s2光照下培養(yǎng)20 d，用清水洗凈組培苗的根，之后按照行距8 cm和株距6 cm的距離栽植于澆透水的珍珠巖基質(zhì)，栽植時只露出組培苗頂芽。首先供應1～2 d清水，并馴化植株，之后采用韓國“高試園”馬鈴薯營養(yǎng)液[15]，進行無土基質(zhì)營養(yǎng)液栽培。

1.2.2 無土基質(zhì)營養(yǎng)液栽培及處理方法 馬鈴薯植株栽培分為誘導匍匐莖(出苗至生長第45 天)和誘導塊莖(生長第46～80天)的2個時期，每天6:00，12:00，18:00澆灌相應韓國“高試園”馬鈴薯營養(yǎng)液(酸處理期間除外)。

酸處理及結薯數(shù)量調(diào)查：植株出苗至生長第40，45，50，55，60 天，利用 pH值4的磷酸水溶液分別處理植物根3 d，之后誘導塊莖。植株培養(yǎng)80 d，調(diào)查每株平均結薯數(shù)量，每處理5個植株，重復3次。

試驗材料收集：植株出苗生長的第45天，輕輕拔出植株，并標記不同發(fā)育階段的匍匐莖的莖尖彎鉤形成之前(Ⅰ)、彎勾時期(Ⅱ)、膨大初期(Ⅲ)、初具塊莖形態(tài)時期(Ⅳ，直徑大小為0.2～0.3 cm)，之后重新栽植于蛭石中。利用 pH值4的磷酸水溶液處理植物根3 d，以不進行酸處理植株為對照，每處理10株，3次重復。處理3 d后，收集標記的不同生長時期的匍匐莖作為基因表達量差異分析的試驗材料。

1.2.3 基因表達量的測定 采用OMEGA公司的試劑盒提取RNA，利用Premier 6.0 設計引物(表1)，按照 TransScript Tip Green qPCR Su-perMix 試劑盒說明書進行各基因的相對表達量測定，以Actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析。

表1 馬鈴薯塊莖形成相關基因的特異性引物Tab.1 The specific primers of gene related to potato tuber formation

1.3 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)整理，利用T檢驗進行匍匐莖相同發(fā)育階段酸處理和對照間基因表達量的差異顯著性分析，采用Duncan′s 多重比較法進行植株不同生長時期酸處理對結薯數(shù)量的差異顯著性分析；圖片采用Graphpad prism 7軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯植株不同生長時期的酸處理對塊莖形成的影響

為探討馬鈴薯匍匐莖的莖端不同發(fā)育時期酸處理對塊莖形成的影響，根據(jù)匍匐莖的莖端形態(tài)特征將其發(fā)育時期分為莖尖彎鉤形成之前(Ⅰ)、彎勾時期(Ⅱ)、膨大初期(Ⅲ)、初具塊莖形態(tài)時期(Ⅳ)等4個發(fā)育時期(圖1)。馬鈴薯植株匍匐莖的莖端觀察表明，植株出苗后生長第40天時，匍匐莖莖端的形態(tài)特征以Ⅱ時期所占比例較大，其次是Ⅰ時期；植株出苗后生長第45,50天時，以Ⅱ時期所占比例最大，其次是Ⅲ時期；而生長第55，60天時以Ⅳ時期所占的比例最大。

Ⅰ.莖尖彎鉤形成之前；Ⅱ.彎勾時期； Ⅲ.膨大初期；Ⅳ.初具塊莖形態(tài)時期。 Ⅰ.The stolon tip before hooked;Ⅱ.Hooked stolon tip; Ⅲ.The swelling tips;Ⅳ.Initial tuber formation.

利用pH值4酸溶液處理不同生長天數(shù)的馬鈴薯植株根，之后誘導塊莖35 d后調(diào)查結薯數(shù)量。結果表明(圖2)，植株出苗后生長45，50 d植株的單株結薯數(shù)量均顯著高于55， 60 d，其中，生長45 d酸處理植株的結薯量最高，比55， 60 d的分別多53.2%，74.5%。

2.2 酸處理對光周期相關基因表達量的影響

圖3表示匍匐莖不同發(fā)育時期的酸處理對StHd3a、StAGL8、StCOL1和StFD等與光周期相關基因表達量的變化。酸處理植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期，StHd3a表達量顯著高于對照(P<0.05)，分別比對照高94.7%，94.2%，94.9%，98.4%(圖3-A)；StFD表達量顯著高于對照(P<0.05)，分別比對照增加30.4%，45.9%，48.1%，96.2%(圖3-B)；StCOL1表達量與對照無顯著性差異(P>0.05)，說明酸處理對StCOL1表達影響不顯著(圖3-C)；另外，匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期，酸處理植株StAGL8表達量顯著高于對照(P<0.05)，比對照分別增加了119.7%，140.1%，而匍匐莖Ⅲ、Ⅳ時期的StAGL8表達量在酸處理與對照間無顯著性差異(P>0.05)(圖3-D)。

不同字母表示在0.05水平上差異顯著。 Different letters indicate significant difference at the 0.05 level.

2.3 酸處理對糖代謝相關基因表達量的影響

圖4表示匍匐莖不同發(fā)育時期的酸處理對StSUSY4、StAGPase、StHXK、StSSS等與糖代謝相關基因表達量變化。從圖4-A中可以看出，酸處理植株的匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期均增強了StSUSY4表達量，比對照分別增加了29.6%，54.9%，31.7%，8.4%；酸處理植株Ⅳ時期的基因表達量分別是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ時期的2.6，1.9，3.7倍。從圖4-B中可以看出，酸處理植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ時期StAGPase表達量顯著降低(P<0.05)，比對照分別下降了60.1%，41.7%；匍匐莖的Ⅲ時期，酸處理與對照StAGPase基因表達量無顯著性差異(P>0.05)，而在匍匐莖的Ⅳ時期，酸處理StAGPase表達量比對照顯著高25.8%。從圖4-C中可以看出，酸處理植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期的StHXK表達量顯著高于對照(P<0.05)，分別比對照增加了114.5%，133.5%，133.9%，369.4%，酸處理植株Ⅳ時期的表達量比Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ時期增強了72.9%，80.2%，75.6%；對照植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期的基因表達量相對平穩(wěn)。從圖4-D中可以看出，酸處理植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ時期的StSSS的表達量均顯著低于對照(P<0.05)，其下降幅度分別為23.2%，21.6%；Ⅲ時期與對照無顯著性差異(P>0.05)；而Ⅳ時期其基因表達量顯著高于對照(P<0.05)，比對照高21.6%。

不同字母僅表示匍匐莖相同生長時期的酸處理和對照間差異顯著(P<0.05)。圖4-6同。 Different letters indicate significant differences in the same stolon development stage between acid treatment and control (P<0.05). The same as Fig.4-6.

圖4 酸處理對糖代謝相關基因表達量的變化Fig.4 Change of acid treatment on the expression levels of genes related to carbohydrate metabolism

2.4 酸處理對激素相關基因表達量的影響

圖5表示匍匐莖不同發(fā)育時期的酸處理對StPIN1、StGA、StABA等與激素相關基因表達量變化。從圖5-A中可以看出，酸處理后植株生長素運輸基因StPIN1在匍匐莖中的表達量均顯著高于對照(P<0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期的該基因表達量分別比對照增加了17.1%，16.9%，44.8%，52.8%，說明塊莖發(fā)育初期的酸處理誘導了大量的生長素轉(zhuǎn)運基因并輸送到塊莖形成部位，從而促進了塊莖的形成及膨大。從圖5-B中可以看出，酸處理植株StGA表達量在匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期均顯著高于對照(P<0.05)，分別比對照高49.4%，25.1%，而在Ⅲ時期與對照無顯著性差異(P>0.05)；在Ⅳ時期顯著低于對照(P<0.05)。從圖5-C中可以看出，酸處理顯著增加匍匐莖StABA表達量，匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期酸處理植株StABA表達量比對照分別增加15.4%，53.3%，38.8%，42.3%，而對照植株StABA表達量變化較小，說明酸處理促進了植株體內(nèi)ABA含量的積累，間接促進了馬鈴薯塊莖的發(fā)育。

圖5 酸處理對激素相關基因表達量的變化Fig.5 Change of acid treatment on the expression levels of genes related to plant hormone

2.5 酸處理對StSP6A表達量的影響

圖6表示匍匐莖不同發(fā)育時期的酸處理對StSP6A表達量的變化。從圖6 中可以看出，匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期，酸處理植株StSP6A表達量顯著高于對照(P<0.05)，比對照分別增加了51.3%，41.9%，47.5%，55.6%，而對照植株中該基因表達較穩(wěn)定。

圖6 酸處理對StSP6A基因表達量的變化Fig.6 Change of acid treatment on StSP6A expression levels

3 結論與討論

馬鈴薯匍匐莖發(fā)生是塊莖形成的必要條件，但并不是所有的匍匐莖均能形成塊莖[16]。一般情況下匍匐莖轉(zhuǎn)變成塊莖的比率為50%～70%，且隨著匍匐莖形成數(shù)量的增多所形成的塊莖數(shù)量也增多[17]。本研究對無土基質(zhì)栽培下生長45 d的東農(nóng)303植株根進行酸處理，并獲得了大量的塊莖；也有研究表明，對氣霧培下移栽40 d的Norland品種[17]及移栽35 d的Van der Plank[13]進行酸處理時，其植株的結薯量較高，說明酸處理能夠增加馬鈴薯品種的結薯數(shù)量，且進行酸處理時應考慮品種、植株生長勢及栽培條件等多種因素。另外，本研究結合前人的研究結果和匍匐莖莖端形態(tài)特征及結薯數(shù)量相結合考慮，推測匍匐莖Ⅰ和Ⅱ時期的酸處理均可促進塊莖的形成，尤其對匍匐莖Ⅱ時期的酸處理誘導塊莖更加有效，因此，在實際生產(chǎn)上應用酸處理的方法誘導塊莖，應掌握好植株生長時期。

研究表明，CONSTANS(CO)、FLOWERING LOCUS T (FT)、光敏色素轉(zhuǎn)錄因子、成花轉(zhuǎn)換基因FD[18-19]、Constant-Like(COL)[20-21]、Hd3a[22]等對馬鈴薯塊莖形成具有重要的作用；StAGL8、FRUITFULL等基因在分裂組織的分化及隨后的心皮發(fā)育中起調(diào)控作用[23]。本研究中，StHd3a表達量在酸處理植株匍匐莖不同生長階段始終保持著較高水平，從而保證塊莖的膨大，該現(xiàn)象與短日照促進馬鈴薯塊莖膨大的現(xiàn)象相似，且與水稻在短日照條件下增加Hd3a表達量的結果相符[22]；同時StFD表達量在酸處理植株的Ⅳ時期增強幅度最大，該結果與Navarro等[11]FD基因高表達促進塊莖形成的研究結果相一致；StAGL8表達量在酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期顯著高于對照，而在匍匐莖的Ⅲ、Ⅳ時期與對照無顯著差異，該基因的表達趨勢與40，45，50 d(Ⅰ、Ⅱ時期匍匐莖占多數(shù))酸處理植株形成的微型薯數(shù)量顯著高于55，60 d(Ⅲ、Ⅳ時期匍匐莖占多數(shù))酸處理植株的試驗結果相符，說明微型薯形成與StAGL8表達密切相關，該結果與StAGL8過量表達促進塊莖形成的研究結果相一致[8]；另外，酸處理增強了StHd3a、StFD表達量的同時促進了馬鈴薯塊莖的形成及膨大，該現(xiàn)象與StHd3a、StFD過表達轉(zhuǎn)基因馬鈴薯形成較多數(shù)量塊莖的研究結果相一致[11]；酸處理對StCOL1表達量無顯著性影響，可能是因為StCOL1與其相似蛋白基因StCO一樣通過調(diào)控光周期途徑相關基因來影響塊莖形成的原因[24]。

馬鈴薯植株葉片最終光合產(chǎn)物蔗糖可通過韌皮部輸送到植株地下部塊莖形成部位，之后SUSY分解蔗糖，并為淀粉合成提供底物[25]。AGPase作為淀粉合成過程中的限速酶，直接調(diào)控淀粉的合成，而己糖激酶(HXK)作為植物呼吸過程的關鍵酶對維持植物體內(nèi)碳平衡及植物呼吸作用起著重要的作用[26]。Rolland等[27]研究發(fā)現(xiàn)，HXK在葡萄糖信號轉(zhuǎn)導過程中，對植物的發(fā)育過程起到了一定的作用。本研究，酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期均增強了StSUSY4的表達，說明酸處理增強了蔗糖的降解能力，從而為合成淀粉提供大量的底物，也可推測蔗糖從葉片大量輸送到塊莖發(fā)育部位，提高了其滲透壓來抵御酸脅迫，該結果與Kramer和Boyer[28]、Crespi等[29]、Déjardin等[30]在其他非生物脅迫如干旱脅迫、低溫脅迫以及脫水脅迫下植物體內(nèi)的蔗糖含量會大量增加的結果相一致；酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期均顯著降低了StAGPase的表達量，而在匍匐莖的Ⅲ時期，酸處理與對照StAGPase的表達量無顯著差異，推測酸處理初期植株原有的糖代謝平衡被打破，細胞生物體膜的選擇透性遭到破壞，導致基質(zhì)中的無機磷進入細胞內(nèi)[31]；在酸處理植株匍匐莖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期的StHXK表達量均顯著高于對照，這可能是由于在酸處理下植株自身對酸脅迫的適應性調(diào)節(jié)所導致的，這與韋克蘇等[32]在高溫脅迫下己糖激酶類的關鍵基因上調(diào)結果相一致；酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期StSSS的表達量降低，而在Ⅳ時期高于對照，說明匍匐莖Ⅳ時期的酸處理有利于馬鈴薯塊莖的膨大，推測酸處理促進StSSS大量表達，進而提高了SSS酶的活性[33-34]，SSS酶活性的增強是加快馬鈴薯塊莖膨大所需淀粉合成的原因。

生長素對馬鈴薯塊莖的生長發(fā)育具有重要調(diào)控作用，生長素抑制馬鈴薯匍匐莖的伸長生長，但對塊莖的形成和發(fā)育有促進作用[35]；脫落酸對馬鈴薯塊莖的形成具有重要調(diào)節(jié)作用，即內(nèi)源 ABA 含量隨塊莖形成而增加[36]。本研究中，在酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ時期StPIN1表達量顯著高于對照，該研究結果與匍匐莖頂端膨大期和塊莖形成初期，生長素含量較高的結果[37]以及生長素轉(zhuǎn)運相關基因StPIN1在塊莖發(fā)育初期均上調(diào)表達，使得塊莖發(fā)育過程中生長素含量升高，有利于塊莖形成[38]的研究結果相一致；酸處理植株匍匐莖的Ⅰ、Ⅱ時期StGA表達量顯著高于對照，而Ⅳ顯著低于對照，該結果符合塊莖形成時內(nèi)源GA3活性下降的觀點[39]；酸處理顯著增加StABA表達，說明酸處理可促進植株體內(nèi)ABA含量的積累，間接促進了馬鈴薯塊莖的發(fā)育，該研究結果與ABA促進馬鈴薯塊莖形成的研究結果相一致[40-41]。

StSP6A與植物開花重要信號分子 FT 同源，并在馬鈴薯塊莖形成過程中起重要作用[11,42]，StSP6A可通過長距離運輸獨立控制開花過程。Navarro等[11]研究表明，過量表達StSP6A植株促進塊莖的形成，而且在短日照條件下StSP6A基因在葉片和匍匐莖中大量表達，該研究與本研究的酸處理促進塊莖形成并高表達StSP6A的結果相一致。

綜上所述，適當?shù)姆巧锩{迫會促進植株某器官的生長和發(fā)育。本研究對生長一定程度的馬鈴薯植株進行了短暫的酸處理，有效提高了塊莖的形成。另外，酸處理的植株StHd3a、StFD、StSUSY4、StHXK，StPIN1、StABA、StSP6A、StAGPase、StSSS、StGA、StAGL8等基因的表達水平或表達模式與對照組存在差異，說明酸處理通過調(diào)控多種代謝途徑基因的表達而影響塊莖形成。