欒慶東，孫 舉，劉均華，張本清，尹燕博，王建琳

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島博隆基因工程有限公司，山東 青島 266021； 3.青島市農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法支隊(duì)，山東 青島 266071；4.青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島 266400)

禽腺病毒，屬于腺病毒科[1]，是一種外形呈立體對稱的二十面體、無囊膜、直徑為70～90 nm的雙股DNA病毒。根據(jù)抗原性不同，禽腺病毒可分為禽腺病毒-Ⅰ群(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)、Ⅱ群和Ⅲ群[2]；根據(jù)分子特征和限制性內(nèi)切酶分析，F(xiàn)AdV可分為A-E 5個(gè)種；根據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)結(jié)果可分為12個(gè)血清型(即1-8a和8b-11)[3-4]。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室對近十年來臨床FAdV分離株的Hexon基因測序分析結(jié)果顯示，我國主要流行的FAdV為FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11，其中FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11主要引起雞包涵體肝炎，F(xiàn)AdV-4主要引起肝炎-心包積液綜合征[5]。雞包涵體肝炎的發(fā)病率高達(dá)60%～70%，被感染雞出現(xiàn)突然死亡，死亡率為10%～30%；雞肝炎-心包積液綜合征主要由FAdV-4感染引起，主要感染3～6周齡肉雞，致死率為20%～80%[6]。尤其是肝炎-心包積液綜合征，從2014年開始在我國廣泛流行，其對肉雞的高感染率和高死亡率給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

FAdV的衣殼由3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白組成，分別為六鄰體(Hexon)、五鄰體(Penton)和纖維蛋白(Fiber)。其中FAdV-1、FAdV-4和FAdV-10具有不同的Fiber蛋白，即Fiber-1和Fiber-2，其余每種血清型毒株僅有一種Fiber蛋白。Fiber蛋白作為病毒與組織細(xì)胞接觸最早的結(jié)構(gòu)，可與病毒受體相結(jié)合，介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞[8]；Hexon和Fiber都作為FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，可作為亞單位疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但研究發(fā)現(xiàn)Fiber-2作為免疫原免疫雞群，對FAdV-4感染的保護(hù)率明顯高于Hexon和Fiber-1，故認(rèn)為Fiber-2具有病毒中和抗原表位，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[9]；Fiber蛋白帶有主要的型特異性抗原決定簇，可作為FAdV診斷的靶向蛋白，以Fiber-2蛋白為包被抗原建立的間接ELISA方法可以特異性地檢測FAdV-4[10]；Fiber蛋白在決定FAdV致病性方面起著重要的作用，通過反向遺傳技術(shù)已證實(shí)Fiber-2蛋白是決定FAdV-4致病性的重要因素[11]。故Fiber蛋白成為近年來FAdV研究的重點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)室對我國主要流行的4種血清型FAdV在LMH細(xì)胞上的交叉保護(hù)反應(yīng)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)FAdV-4全病毒血清能夠中和自身和FAdV-11的感染，但不能中和FAdV-8a和FAdV-8b的感染，F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b之間無交叉中和作用，F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11能互相中和保護(hù)[12]。鑒于Fiber蛋白作為FAdV具有主要的型特異性中和表位和型特異性抗原決定簇的特點(diǎn)，本研究擬對我國主要流行的4種血清型FAdV的Fiber蛋白(FAdV-4為Fiber-2)進(jìn)行原核表達(dá)，并制備相應(yīng)抗血清，通過LMH細(xì)胞研究不同血清FAdV Fiber蛋白抗血清對其他血清型FAdV感染的交叉中和作用，為后期通用疫苗的研究或血清分型診斷方法的建立提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株、質(zhì)粒 FAdV-4(RZ-140718)、FAdV-8a(KD-150107)、FAdV-8b(JL-150226)、FAdV-11(YT-160809)毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存，原核表達(dá)載體pCold TF由本實(shí)驗(yàn)室保存，LMH細(xì)胞購自ATCC生物資源中心，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4DNA連接酶，購自寶生物工程有限公司，Gel Extraction Micro Kit 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，TIANprep Mini Plasmid Kit 購自天根生化科技有限公司，Gold View核酸染料、鼠源抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗鼠的IgG、DAB顯色液等購自北京索萊寶科技有限公司；白油佐劑購自吉化江城油脂化工有限責(zé)任公司，Ni-NTA Fast Start蛋白純化試劑盒購自QIAGEN公司，異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)和氨芐霉素(Amp+)購自Invitrogen公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1Fiber基因擴(kuò)增 根據(jù)分離毒株FAdV-4(RZ-140718)、FAdV-8a(KD-1501070)、FAdV-8b(JL150226)、FAdV-11(YT-160809)序列，設(shè)計(jì)Fiber基因的上下游引物(FadV-4為Fiber-2)并分別在上下游插入酶切位點(diǎn)NdeⅠ、Hind Ⅲ(FAdV-11用NdeⅠ和EcoR Ⅰ)。分別以4個(gè)FAdV毒株DNA為模板，擴(kuò)增Fiber基因，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α，挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，陽性克隆進(jìn)行測序(華大基因)，將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 重組蛋白的表達(dá) 挑取含陽性重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+，100 mg/L)，37 ℃振蕩培養(yǎng)，過夜，次日取千分之一的菌液接種到1 L的LB搖瓶里擴(kuò)大培養(yǎng)，待OD600為0.4～0.6時(shí)，將搖瓶置于16 ℃靜置30 min，后加入終濃度1 mmol/L的IPTG，200 r/min(16 ℃)振蕩培養(yǎng)24 h，取200 μL 8 000 r/min離心15 min后，加40 μL無菌水和SDS上樣緩沖液，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察結(jié)果。

收集剩余菌體沉淀用50 mL PBS重懸，然后進(jìn)行超聲裂解，取上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測蛋白是否是可溶性表達(dá)。

1.2.4 重組蛋白的Western Blot鑒定 將上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，后將蛋白膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上，5%的脫脂奶粉封閉NC膜2 h，PBST洗滌3次，加鼠源抗His的一抗4 ℃孵育4 h，洗滌3次后加入HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h，洗滌后加入DAB顯色液顯色5 min，進(jìn)行結(jié)果觀察。

1.2.5 重組蛋白的純化 將破碎后收集的細(xì)菌上清經(jīng)過0.22 μm的濾膜抽濾，然后平衡后緩慢經(jīng)過鎳柱，按照Ni-NTA Fast Start蛋白純化試劑盒說明純化目的蛋白。

1.2.6 抗血清制備 純化后的重組蛋白與白油佐劑1∶3充分混勻，采用頸部皮下的免疫方式，免疫SPF雞，免疫劑量為75 μg/只，每組免疫10只，免疫21 d后，開始翅靜脈采集血液分離血清，以病毒為抗原，通過瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)測定抗體效價(jià)，待抗體效價(jià)達(dá)24后，大量采集血液，分離保存血清。

1.2.7 交叉中和試驗(yàn) FAdV-4稀釋到病毒TCID50，將4個(gè)FAdV的抗血清置于56 ℃的水浴鍋滅活30 min，血清經(jīng)過0.22 μm的濾器過濾除菌后按照2倍比稀釋。將稀釋好的病毒和血清充分混勻后加入到鋪好的96孔板中，每個(gè)孔100 μL，每個(gè)梯度8個(gè)孔，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)1 h后，將病毒和血清混合液倒出，用PBS清洗3遍，然后加入細(xì)胞維持液100 μL(1%的FBS)，設(shè)立陰陽性對照(陰性對照只加血清，陽性對照加100 TCID50的病毒懸液)，每天觀察，記錄細(xì)胞病變情況。其余3個(gè)血清型的FAdVs均按照相同的操作進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算血清中和效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增

根據(jù)4個(gè)血清型分離株的Fiber基因序列設(shè)計(jì)引物(表1)，進(jìn)行相應(yīng)基因擴(kuò)增，擴(kuò)增的基因片段經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1)，可見4個(gè)血清型FAdVFiber基因的目的條帶，其中，F(xiàn)AdV-4為1 440 bp，F(xiàn)AdV-8a為1 575 bp，F(xiàn)AdV-8b為1 566 bp，F(xiàn)AdV-11為1 719 bp。

表1 4個(gè)血清型FAdV Fiber基因擴(kuò)增引物Tab.1 Primers of Fiber gene of fowl adenovirus with different serotypes

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

各血清型FAdVFiber基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pCold TF載體雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，測序正確后提取質(zhì)粒。FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b用NdeⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒；FAdV-11用NdeⅠ和EcoR Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)4個(gè)血清型FAdVFiber基因雙酶切結(jié)果與預(yù)期相符，表明pCold-FAdV-4-Fiber、pCold-FAdV-8a-Fiber、pCold-FAdV-8b-Fiber和pCold-FAdV-11-Fiber重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

M.Marker 2000；1.FAdV-4 Fiber-2； 2.FAdV-8a Fiber；3.FAdV-8b Fiber；4.FAdV-11 Fiber。

M.Marker 5000；1.pCold-FAdV-4-Fiber；2.pCold-FAdV-8a-Fiber； 3.pCold-FAdV-8b-Fiber；4.pCold-FAdV-11-Fiber。

2.3 重組蛋白表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間確定

挑取陽性pCold-FAdV-Fiber重組質(zhì)粒(以FAdV-4為例)接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+，100 mg/L)，16 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，分別誘導(dǎo)4，8，12，16，24 h，誘導(dǎo)后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，其檢測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，重組蛋白在1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)24 h的情況下表達(dá)效果最佳。

2.4 Western Blot鑒定結(jié)果

純化的FAdV-4 Fiber-2、FAdV-8a Fiber、 FAdV-8b Fiber、FAdV-11 Fiber蛋白和誘導(dǎo)后pCold TF空載體與鼠源抗His的一抗進(jìn)行孵育，鼠源抗His抗體與上述4個(gè)表達(dá)蛋白大約分別在102，107，107，112 ku處發(fā)生反應(yīng)，而空載體與鼠源抗His抗體大約在60 ku處發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果表明，這4種重組蛋白全部正確表達(dá)(圖4)。

2.5 交叉中和試驗(yàn)結(jié)果

FAdV-4 Fiber-2、FAdV-8a Fiber、FAdV-8b Fiber和FAdV-11 Fiber的抗血清與不同血清型FAdV在LMH細(xì)胞進(jìn)行交叉中和反應(yīng)研究，結(jié)果顯示，F(xiàn)AdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白的抗血清與本血清型病毒孵育LMH細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)到第4天無明顯病變，且中和效價(jià)分別為1∶100，1∶177和1∶79，而與其他血清型病毒孵育后細(xì)胞均于第3天出現(xiàn)特征性病變；FAdV-8a Fiber蛋白的抗血清與各血清型病毒孵育LMH細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)到第3天出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變；此外，不同血清型FAdV單獨(dú)孵育LMH細(xì)胞在3～4 d均出現(xiàn)特征性病變，而陰性對照組細(xì)胞均未出現(xiàn)病變(表2)。結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4 Fiber-2、FAdV-8b Fiber和FAdV-11 Fiber的抗血清僅可阻止本血清型病毒的感染，而FAdV-8a Fiber的抗血清對本血清型病毒的感染也無保護(hù)作用。

1-5.分別為16 ℃ pCold-FAdV-4-Fiber誘導(dǎo)4，8，12，16，24 h；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；6.誘導(dǎo)前。

1.FAdV-4 Fiber-2；2.FAdV-8a Fiber；3.FAdV-8b Fiber； 4.FAdV-11 Fiber；5.空載體；6.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。 1.FAdV-4 Fiber-2；2.FAdV-8a Fiber；3.FAdV-8b Fiber； 4.FAdV-11 Fiber；5.Empty plasmid；6.Standard protein molecular.

3 討論

雞包涵體肝炎于1986年首次在我國報(bào)道，隨后一直零星有臨床病例的報(bào)道，但從2009年以來呈現(xiàn)明顯增加的趨勢；雞肝炎-心包積液綜合征于2014年6月開始在我國流行，到2015年在全國肉雞養(yǎng)殖省份開始大規(guī)模爆發(fā)，且蔓延迅速，范圍逐步擴(kuò)散至全國，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失[13]。本實(shí)驗(yàn)室對我國近十多年來FAdV流行情況調(diào)查結(jié)果表明， 2014年前我國FAdV感染呈地方性流行，并以包涵體肝炎為主要臨床癥狀，其中FAdV-11為優(yōu)勢血清型，F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b零星出現(xiàn)；2014-2017年主要流行FAdV-4，臨床以肝炎-心包積液為主要病理特征；2017-2018年，F(xiàn)AdV-8b的流行有所增加，且致病性較之前有所改變[14]。鑒于我國流行多種FAdV血清型、不同血清型FAdV對雞的致病性不同，且對養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，故建立特異性強(qiáng)、敏感性高的血清分型診斷方法和研制高效、安全的疫苗是有效防控FAdV感染的重要方法。

表2 4個(gè)血清型FAdV Fiber蛋白抗血清對不同血清型FAdV感染的中和作用Tab.2 Neutralization results of antisera against four kind Fiber protein to the infection of fowl adenovirus with different fowl adenovirus

FAdVs的血清型較多，不同血清型間病毒存在一定程度的交叉保護(hù)。研究認(rèn)為FAdV-8b和FAdV-11二價(jià)弱毒苗和滅活苗免疫雞后可明顯產(chǎn)生免疫保護(hù)作用，且對加拿大流行毒株(FAdV-2、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)都具有很好的保護(hù)作用[15-16]；Kim 等[17]報(bào)道雞免疫FAdV-4滅活油乳劑疫苗后可產(chǎn)生對FAdV-5、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11感染的交叉保護(hù)；Steer-Cope等[18]研究表明，F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b及FAdV-8a和FAdV-11之間能交叉保護(hù)，F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11之間無交叉保護(hù)；Xia等[19]報(bào)道FAdV-4的滅活疫苗可保護(hù)FAdV-8b的感染。以上不同血清型FAdV交叉保護(hù)結(jié)果并不一致，這可能與不同國家或地域同一血清型流行毒株之間存在差異有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在LMH細(xì)胞水平進(jìn)行的FAdV交叉保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4全病毒血清可中和FAdV-11的感染，F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11之間存在交叉中和保護(hù)作用[12]。那么，這3種血清型FAdV間存在的交叉保護(hù)作用是由哪個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白決定的，該類蛋白的確定將為后續(xù)多種血清型FAdV通用亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

Fiber蛋白作為FAdV中和抗原表位和型特異性抗原決定簇的攜帶者，是目前FAdV亞單位疫苗研制和血清學(xué)診斷方法建立的重要靶向蛋白，尤其在FAdV-4的研究較多。Wang等[20]用大腸桿菌表達(dá)FAdV-4的衣殼蛋白，然后比較了不同接種劑量對雞的免疫保護(hù)效果，通過比較死亡數(shù)和組織器官損傷程度，發(fā)現(xiàn)Fiber-2的保護(hù)效果明顯優(yōu)于Hexon和Fiber-1，是FAdV-4的亞單位疫苗最佳選擇。Schachner等[9]利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)了FAdV-4的Fiber-1、Fiber-2和Hexon loop-1蛋白，對各種表達(dá)蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fiber-2蛋白能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。通過不同的表達(dá)系統(tǒng)，都表明Fiber-2對FAdV-4的感染具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)性?；贔iber-2制備的單克隆抗體建立ELISA診斷方法，可用于FAdV-4的特異性診斷；而用Fiber-2整個(gè)基因表達(dá)和純化后的蛋白作為包被抗原，所建立的ELISA檢測方法可特異性檢測FAdV-4 的抗體[10，21]。故本研究通過原核表達(dá)不同血清型FAdV Fiber蛋白，并制備相應(yīng)Fiber蛋白的抗血清，對其在LMH細(xì)胞上進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，以確定不同血清型FAdV Fiber蛋白在細(xì)胞上是否存在交叉中和作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4的Fiber-2抗血清并不能中和FAdV-11的感染，且FAdV-8b和FAdV-11的Fiber蛋白抗血清也不能相互中和另一血清型病毒的感染，表明這3個(gè)血清型FAdV全病毒間存在的交叉中和位點(diǎn)并不存在于Fiber蛋白上。

本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行的FAdV全病毒交叉中和試驗(yàn)研究結(jié)果證明，F(xiàn)AdV-8a與其他血清型毒株之間無交叉保護(hù)反應(yīng)，但FAdV-8a全病毒抗血清可中和本血清型病毒的感染[12]；而本研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-8a Fiber蛋白抗血清在細(xì)胞水平上不僅不能中和其他血清型FAdV的感染，而且也不能中和本血清型FAdV的感染。這一現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。

本研究成功表達(dá)了4種我國主要流行血清型FAdV的可溶性Fiber蛋白，LMH細(xì)胞水平進(jìn)行的交叉中和結(jié)果表明，F(xiàn)AdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白抗血清對其他血清型病毒的感染無交叉中和作用，證明在細(xì)胞水平上這3種血清型FAdV全病毒間的交叉中和反應(yīng)與Fiber蛋白無關(guān)，這一研究結(jié)果為后續(xù)血清學(xué)分型診斷方法的建立提供了理論依據(jù)和重要素材。