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        我國主要流行的4種血清型禽腺病毒-Ⅰ群Fiber蛋白的交叉中和研究

        2020-11-10 02:00:24欒慶東劉均華張本清尹燕博王建琳
        華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2020年5期
        關(guān)鍵詞:血清型毒株交叉

        欒慶東,孫 舉,劉均華,張本清,尹燕博,王建琳

        ( 1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266109;2.青島博隆基因工程有限公司,山東 青島 266021; 3.青島市農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法支隊(duì),山東 青島 266071;4.青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,山東 青島 266400)

        禽腺病毒,屬于腺病毒科[1],是一種外形呈立體對稱的二十面體、無囊膜、直徑為70~90 nm的雙股DNA病毒。根據(jù)抗原性不同,禽腺病毒可分為禽腺病毒-Ⅰ群(Fowl adenovirus,F(xiàn)AdV)、Ⅱ群和Ⅲ群[2];根據(jù)分子特征和限制性內(nèi)切酶分析,F(xiàn)AdV可分為A-E 5個(gè)種;根據(jù)血清交叉中和試驗(yàn)結(jié)果可分為12個(gè)血清型(即1-8a和8b-11)[3-4]。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室對近十年來臨床FAdV分離株的Hexon基因測序分析結(jié)果顯示,我國主要流行的FAdV為FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11,其中FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11主要引起雞包涵體肝炎,F(xiàn)AdV-4主要引起肝炎-心包積液綜合征[5]。雞包涵體肝炎的發(fā)病率高達(dá)60%~70%,被感染雞出現(xiàn)突然死亡,死亡率為10%~30%;雞肝炎-心包積液綜合征主要由FAdV-4感染引起,主要感染3~6周齡肉雞,致死率為20%~80%[6]。尤其是肝炎-心包積液綜合征,從2014年開始在我國廣泛流行,其對肉雞的高感染率和高死亡率給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

        FAdV的衣殼由3種主要的結(jié)構(gòu)蛋白組成,分別為六鄰體(Hexon)、五鄰體(Penton)和纖維蛋白(Fiber)。其中FAdV-1、FAdV-4和FAdV-10具有不同的Fiber蛋白,即Fiber-1和Fiber-2,其余每種血清型毒株僅有一種Fiber蛋白。Fiber蛋白作為病毒與組織細(xì)胞接觸最早的結(jié)構(gòu),可與病毒受體相結(jié)合,介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞[8];Hexon和Fiber都作為FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白,可作為亞單位疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),但研究發(fā)現(xiàn)Fiber-2作為免疫原免疫雞群,對FAdV-4感染的保護(hù)率明顯高于Hexon和Fiber-1,故認(rèn)為Fiber-2具有病毒中和抗原表位,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[9];Fiber蛋白帶有主要的型特異性抗原決定簇,可作為FAdV診斷的靶向蛋白,以Fiber-2蛋白為包被抗原建立的間接ELISA方法可以特異性地檢測FAdV-4[10];Fiber蛋白在決定FAdV致病性方面起著重要的作用,通過反向遺傳技術(shù)已證實(shí)Fiber-2蛋白是決定FAdV-4致病性的重要因素[11]。故Fiber蛋白成為近年來FAdV研究的重點(diǎn)。

        本實(shí)驗(yàn)室對我國主要流行的4種血清型FAdV在LMH細(xì)胞上的交叉保護(hù)反應(yīng)性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)FAdV-4全病毒血清能夠中和自身和FAdV-11的感染,但不能中和FAdV-8a和FAdV-8b的感染,F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b之間無交叉中和作用,F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11能互相中和保護(hù)[12]。鑒于Fiber蛋白作為FAdV具有主要的型特異性中和表位和型特異性抗原決定簇的特點(diǎn),本研究擬對我國主要流行的4種血清型FAdV的Fiber蛋白(FAdV-4為Fiber-2)進(jìn)行原核表達(dá),并制備相應(yīng)抗血清,通過LMH細(xì)胞研究不同血清FAdV Fiber蛋白抗血清對其他血清型FAdV感染的交叉中和作用,為后期通用疫苗的研究或血清分型診斷方法的建立提供基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1 毒株、質(zhì)粒 FAdV-4(RZ-140718)、FAdV-8a(KD-150107)、FAdV-8b(JL-150226)、FAdV-11(YT-160809)毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存,原核表達(dá)載體pCold TF由本實(shí)驗(yàn)室保存,LMH細(xì)胞購自ATCC生物資源中心,大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技(北京)有限公司。

        1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4DNA連接酶,購自寶生物工程有限公司,Gel Extraction Micro Kit 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司,TIANprep Mini Plasmid Kit 購自天根生化科技有限公司,Gold View核酸染料、鼠源抗His標(biāo)簽單克隆抗體、HRP標(biāo)記的兔抗鼠的IgG、DAB顯色液等購自北京索萊寶科技有限公司;白油佐劑購自吉化江城油脂化工有限責(zé)任公司,Ni-NTA Fast Start蛋白純化試劑盒購自QIAGEN公司,異丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)和氨芐霉素(Amp+)購自Invitrogen公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1Fiber基因擴(kuò)增 根據(jù)分離毒株FAdV-4(RZ-140718)、FAdV-8a(KD-1501070)、FAdV-8b(JL150226)、FAdV-11(YT-160809)序列,設(shè)計(jì)Fiber基因的上下游引物(FadV-4為Fiber-2)并分別在上下游插入酶切位點(diǎn)NdeⅠ、Hind Ⅲ(FAdV-11用NdeⅠ和EcoR Ⅰ)。分別以4個(gè)FAdV毒株DNA為模板,擴(kuò)增Fiber基因,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收。

        1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將回收后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切,用T4DNA連接酶16 ℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α,挑取單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證,陽性克隆進(jìn)行測序(華大基因),將測序正確的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

        1.2.3 重組蛋白的表達(dá) 挑取含陽性重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒的單菌落,接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+,100 mg/L),37 ℃振蕩培養(yǎng),過夜,次日取千分之一的菌液接種到1 L的LB搖瓶里擴(kuò)大培養(yǎng),待OD600為0.4~0.6時(shí),將搖瓶置于16 ℃靜置30 min,后加入終濃度1 mmol/L的IPTG,200 r/min(16 ℃)振蕩培養(yǎng)24 h,取200 μL 8 000 r/min離心15 min后,加40 μL無菌水和SDS上樣緩沖液,煮沸10 min,進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,考馬斯亮藍(lán)染色,觀察結(jié)果。

        收集剩余菌體沉淀用50 mL PBS重懸,然后進(jìn)行超聲裂解,取上清和沉淀,分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,檢測蛋白是否是可溶性表達(dá)。

        1.2.4 重組蛋白的Western Blot鑒定 將上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳,后將蛋白膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜)上,5%的脫脂奶粉封閉NC膜2 h,PBST洗滌3次,加鼠源抗His的一抗4 ℃孵育4 h,洗滌3次后加入HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG二抗室溫孵育2 h,洗滌后加入DAB顯色液顯色5 min,進(jìn)行結(jié)果觀察。

        1.2.5 重組蛋白的純化 將破碎后收集的細(xì)菌上清經(jīng)過0.22 μm的濾膜抽濾,然后平衡后緩慢經(jīng)過鎳柱,按照Ni-NTA Fast Start蛋白純化試劑盒說明純化目的蛋白。

        1.2.6 抗血清制備 純化后的重組蛋白與白油佐劑1∶3充分混勻,采用頸部皮下的免疫方式,免疫SPF雞,免疫劑量為75 μg/只,每組免疫10只,免疫21 d后,開始翅靜脈采集血液分離血清,以病毒為抗原,通過瓊脂糖凝膠擴(kuò)散試驗(yàn)測定抗體效價(jià),待抗體效價(jià)達(dá)24后,大量采集血液,分離保存血清。

        1.2.7 交叉中和試驗(yàn) FAdV-4稀釋到病毒TCID50,將4個(gè)FAdV的抗血清置于56 ℃的水浴鍋滅活30 min,血清經(jīng)過0.22 μm的濾器過濾除菌后按照2倍比稀釋。將稀釋好的病毒和血清充分混勻后加入到鋪好的96孔板中,每個(gè)孔100 μL,每個(gè)梯度8個(gè)孔,于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)1 h后,將病毒和血清混合液倒出,用PBS清洗3遍,然后加入細(xì)胞維持液100 μL(1%的FBS),設(shè)立陰陽性對照(陰性對照只加血清,陽性對照加100 TCID50的病毒懸液),每天觀察,記錄細(xì)胞病變情況。其余3個(gè)血清型的FAdVs均按照相同的操作進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)。根據(jù)Reed-Meunch法計(jì)算血清中和效價(jià)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 目的基因擴(kuò)增

        根據(jù)4個(gè)血清型分離株的Fiber基因序列設(shè)計(jì)引物(表1),進(jìn)行相應(yīng)基因擴(kuò)增,擴(kuò)增的基因片段經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1),可見4個(gè)血清型FAdVFiber基因的目的條帶,其中,F(xiàn)AdV-4為1 440 bp,F(xiàn)AdV-8a為1 575 bp,F(xiàn)AdV-8b為1 566 bp,F(xiàn)AdV-11為1 719 bp。

        表1 4個(gè)血清型FAdV Fiber基因擴(kuò)增引物Tab.1 Primers of Fiber gene of fowl adenovirus with different serotypes

        2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

        各血清型FAdVFiber基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pCold TF載體雙酶切后連接,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,測序正確后提取質(zhì)粒。FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b用NdeⅠ和Hind Ⅲ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒;FAdV-11用NdeⅠ和EcoR Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)4個(gè)血清型FAdVFiber基因雙酶切結(jié)果與預(yù)期相符,表明pCold-FAdV-4-Fiber、pCold-FAdV-8a-Fiber、pCold-FAdV-8b-Fiber和pCold-FAdV-11-Fiber重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

        M.Marker 2000;1.FAdV-4 Fiber-2; 2.FAdV-8a Fiber;3.FAdV-8b Fiber;4.FAdV-11 Fiber。

        M.Marker 5000;1.pCold-FAdV-4-Fiber;2.pCold-FAdV-8a-Fiber; 3.pCold-FAdV-8b-Fiber;4.pCold-FAdV-11-Fiber。

        2.3 重組蛋白表達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間確定

        挑取陽性pCold-FAdV-Fiber重組質(zhì)粒(以FAdV-4為例)接種于LB液體培養(yǎng)基(Amp+,100 mg/L),16 ℃振蕩培養(yǎng)過夜,分別誘導(dǎo)4,8,12,16,24 h,誘導(dǎo)后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測,其檢測結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,重組蛋白在1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)24 h的情況下表達(dá)效果最佳。

        2.4 Western Blot鑒定結(jié)果

        純化的FAdV-4 Fiber-2、FAdV-8a Fiber、 FAdV-8b Fiber、FAdV-11 Fiber蛋白和誘導(dǎo)后pCold TF空載體與鼠源抗His的一抗進(jìn)行孵育,鼠源抗His抗體與上述4個(gè)表達(dá)蛋白大約分別在102,107,107,112 ku處發(fā)生反應(yīng),而空載體與鼠源抗His抗體大約在60 ku處發(fā)生反應(yīng),結(jié)果表明,這4種重組蛋白全部正確表達(dá)(圖4)。

        2.5 交叉中和試驗(yàn)結(jié)果

        FAdV-4 Fiber-2、FAdV-8a Fiber、FAdV-8b Fiber和FAdV-11 Fiber的抗血清與不同血清型FAdV在LMH細(xì)胞進(jìn)行交叉中和反應(yīng)研究,結(jié)果顯示,F(xiàn)AdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白的抗血清與本血清型病毒孵育LMH細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)到第4天無明顯病變,且中和效價(jià)分別為1∶100,1∶177和1∶79,而與其他血清型病毒孵育后細(xì)胞均于第3天出現(xiàn)特征性病變;FAdV-8a Fiber蛋白的抗血清與各血清型病毒孵育LMH細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)到第3天出現(xiàn)特征性細(xì)胞病變;此外,不同血清型FAdV單獨(dú)孵育LMH細(xì)胞在3~4 d均出現(xiàn)特征性病變,而陰性對照組細(xì)胞均未出現(xiàn)病變(表2)。結(jié)果表明,F(xiàn)AdV-4 Fiber-2、FAdV-8b Fiber和FAdV-11 Fiber的抗血清僅可阻止本血清型病毒的感染,而FAdV-8a Fiber的抗血清對本血清型病毒的感染也無保護(hù)作用。

        1-5.分別為16 ℃ pCold-FAdV-4-Fiber誘導(dǎo)4,8,12,16,24 h;M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);6.誘導(dǎo)前。

        1.FAdV-4 Fiber-2;2.FAdV-8a Fiber;3.FAdV-8b Fiber; 4.FAdV-11 Fiber;5.空載體;6.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。 1.FAdV-4 Fiber-2;2.FAdV-8a Fiber;3.FAdV-8b Fiber; 4.FAdV-11 Fiber;5.Empty plasmid;6.Standard protein molecular.

        3 討論

        雞包涵體肝炎于1986年首次在我國報(bào)道,隨后一直零星有臨床病例的報(bào)道,但從2009年以來呈現(xiàn)明顯增加的趨勢;雞肝炎-心包積液綜合征于2014年6月開始在我國流行,到2015年在全國肉雞養(yǎng)殖省份開始大規(guī)模爆發(fā),且蔓延迅速,范圍逐步擴(kuò)散至全國,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失[13]。本實(shí)驗(yàn)室對我國近十多年來FAdV流行情況調(diào)查結(jié)果表明, 2014年前我國FAdV感染呈地方性流行,并以包涵體肝炎為主要臨床癥狀,其中FAdV-11為優(yōu)勢血清型,F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b零星出現(xiàn);2014-2017年主要流行FAdV-4,臨床以肝炎-心包積液為主要病理特征;2017-2018年,F(xiàn)AdV-8b的流行有所增加,且致病性較之前有所改變[14]。鑒于我國流行多種FAdV血清型、不同血清型FAdV對雞的致病性不同,且對養(yǎng)雞業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,故建立特異性強(qiáng)、敏感性高的血清分型診斷方法和研制高效、安全的疫苗是有效防控FAdV感染的重要方法。

        表2 4個(gè)血清型FAdV Fiber蛋白抗血清對不同血清型FAdV感染的中和作用Tab.2 Neutralization results of antisera against four kind Fiber protein to the infection of fowl adenovirus with different fowl adenovirus

        FAdVs的血清型較多,不同血清型間病毒存在一定程度的交叉保護(hù)。研究認(rèn)為FAdV-8b和FAdV-11二價(jià)弱毒苗和滅活苗免疫雞后可明顯產(chǎn)生免疫保護(hù)作用,且對加拿大流行毒株(FAdV-2、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11)都具有很好的保護(hù)作用[15-16];Kim 等[17]報(bào)道雞免疫FAdV-4滅活油乳劑疫苗后可產(chǎn)生對FAdV-5、FAdV-8a、FAdV-8b和FAdV-11感染的交叉保護(hù);Steer-Cope等[18]研究表明,F(xiàn)AdV-8a和FAdV-8b及FAdV-8a和FAdV-11之間能交叉保護(hù),F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11之間無交叉保護(hù);Xia等[19]報(bào)道FAdV-4的滅活疫苗可保護(hù)FAdV-8b的感染。以上不同血清型FAdV交叉保護(hù)結(jié)果并不一致,這可能與不同國家或地域同一血清型流行毒株之間存在差異有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在LMH細(xì)胞水平進(jìn)行的FAdV交叉保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果表明,F(xiàn)AdV-4全病毒血清可中和FAdV-11的感染,F(xiàn)AdV-8b和FAdV-11之間存在交叉中和保護(hù)作用[12]。那么,這3種血清型FAdV間存在的交叉保護(hù)作用是由哪個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白決定的,該類蛋白的確定將為后續(xù)多種血清型FAdV通用亞單位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

        Fiber蛋白作為FAdV中和抗原表位和型特異性抗原決定簇的攜帶者,是目前FAdV亞單位疫苗研制和血清學(xué)診斷方法建立的重要靶向蛋白,尤其在FAdV-4的研究較多。Wang等[20]用大腸桿菌表達(dá)FAdV-4的衣殼蛋白,然后比較了不同接種劑量對雞的免疫保護(hù)效果,通過比較死亡數(shù)和組織器官損傷程度,發(fā)現(xiàn)Fiber-2的保護(hù)效果明顯優(yōu)于Hexon和Fiber-1,是FAdV-4的亞單位疫苗最佳選擇。Schachner等[9]利用桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)了FAdV-4的Fiber-1、Fiber-2和Hexon loop-1蛋白,對各種表達(dá)蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行評價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)Fiber-2蛋白能產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。通過不同的表達(dá)系統(tǒng),都表明Fiber-2對FAdV-4的感染具有較強(qiáng)的免疫保護(hù)性?;贔iber-2制備的單克隆抗體建立ELISA診斷方法,可用于FAdV-4的特異性診斷;而用Fiber-2整個(gè)基因表達(dá)和純化后的蛋白作為包被抗原,所建立的ELISA檢測方法可特異性檢測FAdV-4 的抗體[10,21]。故本研究通過原核表達(dá)不同血清型FAdV Fiber蛋白,并制備相應(yīng)Fiber蛋白的抗血清,對其在LMH細(xì)胞上進(jìn)行交叉中和試驗(yàn),以確定不同血清型FAdV Fiber蛋白在細(xì)胞上是否存在交叉中和作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AdV-4的Fiber-2抗血清并不能中和FAdV-11的感染,且FAdV-8b和FAdV-11的Fiber蛋白抗血清也不能相互中和另一血清型病毒的感染,表明這3個(gè)血清型FAdV全病毒間存在的交叉中和位點(diǎn)并不存在于Fiber蛋白上。

        本實(shí)驗(yàn)室前期進(jìn)行的FAdV全病毒交叉中和試驗(yàn)研究結(jié)果證明,F(xiàn)AdV-8a與其他血清型毒株之間無交叉保護(hù)反應(yīng),但FAdV-8a全病毒抗血清可中和本血清型病毒的感染[12];而本研究中發(fā)現(xiàn),F(xiàn)AdV-8a Fiber蛋白抗血清在細(xì)胞水平上不僅不能中和其他血清型FAdV的感染,而且也不能中和本血清型FAdV的感染。這一現(xiàn)象有待于進(jìn)一步研究。

        本研究成功表達(dá)了4種我國主要流行血清型FAdV的可溶性Fiber蛋白,LMH細(xì)胞水平進(jìn)行的交叉中和結(jié)果表明,F(xiàn)AdV-4、FAdV-8b和FAdV-11 Fiber蛋白抗血清對其他血清型病毒的感染無交叉中和作用,證明在細(xì)胞水平上這3種血清型FAdV全病毒間的交叉中和反應(yīng)與Fiber蛋白無關(guān),這一研究結(jié)果為后續(xù)血清學(xué)分型診斷方法的建立提供了理論依據(jù)和重要素材。

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