楊艷佩，朱才華，柳 俊，周 俊

（1.華中農業(yè)大學生命科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.園藝植物生物學教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；3.農業(yè)與農村部馬鈴薯生物學與生物技術重點實驗室，湖北 武漢 430070；4.華中農業(yè)大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）廣泛種植于全世界150多個國家和地區(qū)，近十年來的世界種植面積維持在1 800萬hm2以上[1]，總產量僅次于玉米、水稻和小麥，是世界第四大糧食作物。中國馬鈴薯種植面積自20 世紀90 年代以來一直居于世界第一位，目前的種植面積已經超過570 萬hm2，總產接近1 億t[1]，成為農業(yè)產業(yè)結構調整和重點貧困地區(qū)精準扶貧的主要支柱產業(yè)之一。然而，因病毒引起的種薯退化而導致減產是馬鈴薯生產面臨的主要問題之一，也是中國馬鈴薯生產的主要制約因素之一[2,3]。生產脫毒種薯是解決這一問題的主要途徑，馬鈴薯試管薯（Microtubers）在這樣的形勢下應運而生，并以其特有的優(yōu)勢（易貯易運、生產不受季節(jié)限制）成為種薯生產的核心環(huán)節(jié)[4]。此外，試管薯在組織結構、生長發(fā)育、遺傳穩(wěn)定性等方面與常規(guī)塊莖并沒有本質上的差異[5]，因此已成為馬鈴薯遺傳轉化[6,7]和功能基因研究[8-10]的模式體系。然而，馬鈴薯不同基因型的試管薯形成能力差異較大，影響了試管薯的應用。

圍繞試管薯形成的研究，早期主要集中在環(huán)境（光照、溫度）、營養(yǎng)、激素等外因對其的影響上。大量研究結果表明，短日照、低溫和高蔗糖濃度是誘導試管薯形成的關鍵因素[11-13]，其中高蔗糖濃度是試管薯形成的必須條件，短日照和低溫促進試管薯形成，長日照和高溫則抑制試管薯的形成。與此同時，不同的基因型對環(huán)境等誘導條件的反應差異很大，表明遺傳基礎這一內因也對試管薯的形成至關重要。早在20世紀80年代末90年代初就有研究報道，馬鈴薯早熟品種在全黑暗條件、8 h光周期誘導條件以及16 h 光周期非誘導條件下均能形成試管薯，而中晚熟品種只能在全黑暗和短日照的誘導條件下形成試管薯、特晚熟品種僅在全黑暗條件下形成試管薯。即使是處于相同的誘導條件下，早熟品種的試管薯形成能力也強于晚熟品種，或表現(xiàn)在早熟品種結薯更早[14]，或表現(xiàn)為早熟品種形成的試管薯更大[15,16]。上述結果說明基因型在試管薯誘導中起著重要的作用，不同基因型的馬鈴薯在試管塊莖形成能力、形成時間以及塊莖的數(shù)量和重量等方面都有很大差異。

上述研究多是在少數(shù)基因型（品種）中探討遺傳基礎對試管薯形成的影響，然而，除了明確基因型差異在很大程度上能影響試管薯形成之外，這種影響是否普遍存在、是否有規(guī)律可循等都并不清楚。本研究比較了4個雜交組合后代共222個基因型材料在相同誘導條件下的試管薯形成情況，并基于SSR分子標記分析了與結薯時間、結薯率及單薯重等相關的遺傳位點，旨在探索基因型影響馬鈴薯塊莖形成的遺傳規(guī)律及特點，為馬鈴薯新品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用222個馬鈴薯基因型材料來源于4個雜交組合391002.14 × 391679.12（D）、393075.54 ×391679.12（E）、393046.7×391679.12（F）和393046.7×391679.7（K），所有組合均于2001 年從國際馬鈴薯中心（CIP）引進，其系譜號清單見表1。

1.2 試管薯形成表型鑒定

試管苗的擴繁與試管薯的誘導培養(yǎng)方法參考周俊[17]的描述。試管苗擴繁所用培養(yǎng)基為MS[18]基礎培養(yǎng)基添加4%蔗糖和8 g/L 的瓊脂（不添加任何激素），培養(yǎng)條件：溫度（20±1）℃、光照時間16 h/d、光強2 000 lx。試管薯的誘導方法與試管苗的擴繁方法類似，無菌條件下取上述培養(yǎng)4周的試管苗的第2、3、4節(jié)單莖段（去除頂芽），接種于試管薯誘導培養(yǎng)基（MS 基礎培養(yǎng)基+ 8%蔗糖+ 8 g/L 的瓊脂+0.2%活性炭），置于溫度（20±1）℃，光照時間8 h/d條件下培養(yǎng)60 d。

表1 采用的4個雜交組合后代材料系譜號清單Table 1 List of the clones from four crosses

試驗設置了3個生物學重復，每個重復有10盒共90個植株，最后統(tǒng)計結果以90株平均值為基數(shù)。誘導結薯處理約2周之后每隔3 d觀察初始匍匐莖形成時間和初始結薯時間。培養(yǎng)60 d后，取出植株洗凈培養(yǎng)基晾干，記錄單株結薯率（每盒結薯株數(shù)占存活株數(shù)比例，反應試管薯形成能力）、單株結薯數(shù)（每盒結薯個數(shù)與存活株數(shù)比值，反應結薯多少的差異）、單薯重（每盒總薯重與結薯數(shù)比值，反應試管薯膨大能力）以及有柄薯比例（每盒所結試管薯中有柄薯所占比例，反應試管薯形成方式的差異）。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析軟件。

1.3 SSR分子標記擴增及檢測

所有材料的DNA抽提都是基于CTAB抽提法[19]，提取培養(yǎng)4 周的試管苗葉片的基因組DNA。研究共計對131 對SSR（Single sequence repeats）引物進行了多態(tài)性篩選，引物信息來自于馬鈴薯基因組數(shù) 據(jù) 庫 （http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/pgsc_download.shtml）以及前人的報道[20-23]。引物序列由上海生工生物技術服務有限公司合成。

所有引物的PCR 反應體系及程序設置參考周俊[17]的描述。所用PCR儀器包括DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler（MJ Research， Inc.）和TGRADIENT（Biometra），PCR產物的檢測采用6%變性（7 mol/L 尿素）PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳，Polyacrylamide gel electrophoresis，19∶1）分離，在DYCZ-20C型DNA序列分析電泳儀（北京市六一儀器廠）上1 000 V恒壓電泳2～3 h，電泳后銀染檢測[24]。

引物擴增片段的大小以DNA分子量標準ΦX174 HaeⅢdigest（NEB）和DNA ladder 100為標準，利用Quantity One?Version 4.6.2（Universal Hood Ⅱ，BIO-RAD）中的point-to-point semi-log 回歸模型進行估計。針對每個等位位點進行標記的讀取與記錄，將群體中擴增出等位基因條帶的個體記為“1”，沒有擴增出條帶的個體記為“0”，數(shù)據(jù)缺失記為“9”。標記的命名包含引物名稱（STI、STM 或者STG）和位點個數(shù)，如STI049-2表示SSR引物STI049擴增得到的第二條等位條帶?；赟PSS 25.0統(tǒng)計分析軟件中的方差分析（ANOVA）和非參數(shù)檢驗2種方法，比較不同標記基因型數(shù)量性狀均值的差異，進行標記與表型之間的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同組合試管薯形成能力比較

2.1.1 4個組合的結薯方式存在差異

從匍匐莖發(fā)生率和結薯率來看（圖1A），4 個組合之間差異不明顯，組合D 和K 的匍匐莖發(fā)生率和結薯率均達到了100%；組合F 匍匐莖發(fā)生率為100%，結薯率為98.7%（75 個基因型中僅1 個沒有形成試管薯）；組合E 匍匐莖發(fā)生率為98.9%（95 個基因型中僅1 個沒有形成匍匐莖），結薯率為95.8% （95 個基因型中有4 個沒有形成試管薯）。但是在試管薯形成的過程中，觀察到2 種不同的結薯方式（圖1B）。一種是遵循常規(guī)方式，先經過匍匐莖的發(fā)生、伸長，然后匍匐莖頂端膨大形成的試管薯，稱為有柄薯，如圖1B 中實心箭頭所示。另一種是不經過匍匐莖的伸長而直接在植株腋芽部位膨大成薯，稱為無柄薯，如圖1B 中空心箭頭所示。通過對4 個組合有柄薯比例的比較，不難看出4 個組合均存在有柄薯和無柄薯2種結薯方式，但是不同組合中2 種結薯方式所占的比例差異很大。其中組合E 的有柄薯比例最高（87.6%），組合F 和K 次之（分別是74.1%和74.8%），組合D 最低（68.3%），說明結薯方式的差異可能是受到遺傳背景的影響。

2.1.2 4個組合試管薯形成相關性狀的比較

對4個組合在誘導結薯過程中的匍匐莖發(fā)生和試管薯形成的變化趨勢進行比較，結果表明4個組合的匍匐莖發(fā)生變化趨勢比較相似（圖2A），形成時間均集中在培養(yǎng)2～5周，其中組合F和D的匍匐莖形成比其他2個組合更早更快，但總體差異不明顯。4個組合的平均初始匍匐莖形成時間分別為24.6 d（D）、27.4 d（E）、23.6 d（F）和26.4 d（K），除了F與E之間的差異達到顯著水平，其他組合之間的差異均不顯著（表2）。

與匍匐莖發(fā)生的變化趨勢類似，組合F和D的試管薯形成仍然早于其他2個組合且形成時間相對集中（圖2B）。培養(yǎng)3周時開始有試管薯形成，第4周時組合F 和D 中結薯基因型比例分別為45%和33%，第6周時分別達到88%和92%。組合E的試管薯形成明顯晚于其他組合，培養(yǎng)5周時其結薯基因型比例僅16%，第6 周才達到53%，甚至到第9 周還有個別基因型形成試管薯。組合K在各個時間點的結薯基因型比例均居中。4個組合的平均初始結薯時間分別為32.0 d（D）、41.8 d（E）、31.0 d（F）和37.4 d（K），F(xiàn) 和D 顯著早于K，K 顯著早于E，F(xiàn)、D與E之間的差異達到顯著水平（表2）。

表2還展示了塊莖形成相關的其他幾個重要性狀，結果顯示不同組合的單株結薯率、單株結薯數(shù)以及單薯重性狀均存在明顯差異。從單株結薯率來看，組合D（75.5%）顯著高于組合E（51.3%）、顯著高于組合K（39.5%），組合F（63.0%）介于D和E之間并與二者無顯著差異。單株結薯數(shù)的比較結果與單株結薯率一致，組合D（0.8）顯著高于組合E（0.6）、顯著高于組合K（0.4），組合F（0.7）介于D和E之間并與二者無顯著差異。在單薯重這一性狀上，組合D（86.5 mg）和E（78.3 mg）顯著高于組合F（52.0 mg）和K（58.3 mg）。

表2 不同組合所有基因型各性狀的平均值及比較Table 2 Mean values of each cross for various traits

2.1.3 組合內不同基因型試管薯形成的差異

對4個組合內各個基因型的試管薯形成相關性狀進行統(tǒng)計分析和比較，結果顯示不同基因型在結薯相關性狀上均存在不同程度的差異，其差異程度因組合而異。就匍匐莖和試管薯形成而言，組合E 的95 個基因型中有1 個沒有形成匍匐莖、4個沒有結薯，組合F 的75 個基因型中有1 個沒有結薯，組合D和K全部形成匍匐莖并結薯。從結薯時間來看，組合D較為集中，最早和最晚結薯的基因型分別是24 和48 d 結薯；組合K 次之（25 和60 d）；組合E（16 和65 d）和F（17 和67 d）的結薯時間分布則差異較大。從單株結薯率來看，也是組合D較 為 集 中（20.31% ～100%）， 組 合E（2.78% ～100%）、F（1.26%～100%）、K（1.9%～94.97%）的分布類似，但是組合E（0.03～1.36 個/株）和F（0.01～1.52個/株）的單株結薯數(shù)的分布差異較組合D（0.20～1.10 個/株）和K（0.02～0.95個/株）更大。從單薯重來看，組合E（19.6～199.5 mg）的分布差異最大，其他3個組合D（26.6～139.6 mg）、F（16.5～100.1 mg）、K（23.8～111.7 mg）的分布類似。

表3 四個組合的SSR引物多態(tài)性檢測結果Table 3 Polymorphism detection of SSR makers in four crosses

2.2 SSR標記與結薯性狀的相關分析

選用文獻報道的131對SSR引物（分布于馬鈴薯12條染色體）對4個組合群體進行擴增，結果顯示組合D篩選出24對能擴增出多態(tài)性目標片段的SSR引物，共產生80個多態(tài)性標記；組合E也篩選出24對引物，共產生114個多態(tài)性標記；組合F篩選出20對引物，共產生64個多態(tài)性標記；組合K篩選出17對引物，共產生55個多態(tài)性標記（表3）。最終利用這313個多態(tài)性標記對4個組合進行結薯性狀與標記的相關分析，結果列于表4。

總體上看，組合D中與結薯時間相關的標記共計36個，分布于9條染色體上（1、2、3、4、6、7、8、11和12）；與單株結薯率相關的標記3個，位于第1、3和7號染色體上；與單株結薯數(shù)相關的標記2個，位于第1和7號染色體上；與單薯重相關的標記共計28 個，分布于9 條染色體上（1、2、3、4、6、7、8、11和12）。組合E中與結薯時間相關的標記共計13個，分布于7條染色體上（2、4、6、7、8、11和12）；與單株結薯率相關的標記4 個，位于第7、10 和11 號染色體上；與單株結薯數(shù)相關的標記2個，位于第7和11號染色體上；與單薯重相關的標記共計7個，位于第2、3、7和11號染色體上。組合F中5個標記與結薯時間相關，位于第2、3、8和11號染色體上；4個標記與單株結薯率相關，位于第5、8和11號染色體上；1個標記與單株結薯數(shù)相關，位于第11 號染色體上；5 個標記與單薯重相關，位于第5和8號染色體上。組合K中僅1個標記與結薯時間相關，位于第9號染色體上；2個標記同時與單株結薯率、單株結薯數(shù)相關，位于第1和2號染色體上；3個標記與單薯重相關，位于第8和11號染色體上。

對各個組合內不同表型間的相關性標記進行比較，可以看出組合D中與初始結薯時間和單薯重這兩個表型相關的標記不僅數(shù)目多、相關系數(shù)高，而且二者之間存在很多共有標記。表4顯示組合D中與初始結薯時間相關的標記共計36個，其中21個呈負相關即與結薯時間早相關、15個呈正相關即與結薯時間晚相關；與單薯重相關的標記共計28個，其中14 個呈正相關、14 個呈負相關。二者之間共有標記多達25 個，其中13 個標記同時與早結薯以及單薯重更大相關、12 個標記同時與晚結薯以及單薯重更小相關。此外，與單株結薯率相關的3個標記同時也與結薯時間及單薯重相關。然而，其他3個組合中的結薯時間和單薯重的相關標記之間并不存在交集。

對相同表型在不同組合中的相關標記進行比較，結果顯示同一表型在不同組合中的相關標記差異很大，僅有3個標記同時與兩個組合的某個表型呈顯著相關。其中，標記StI018-1與組合D和F的初始結薯時間均呈極顯著相關，標記StI044-2則與二者的單薯重均呈顯著相關；標記StI024-1與組合D 和E 的初始結薯時間均呈顯著相關，標記STI018-1則與二者的單薯重均呈顯著相關。而同一表型在組合E與F，以及組合K與其他組合之間均不存在共有標記。

表4 與結薯性狀顯著相關（P＜0.05）的SSR標記Table 4 Significant markers (P＜0.05) associated with in vitro tuberization traits

表4 與結薯性狀顯著相關（P＜0.05）的SSR標記Table 4 Significant markers (P＜0.05) associated with in vitro tuberization traits

3 討 論

3.1 遺傳基礎是影響試管薯形成相關性狀的主要因素

試驗比較了4個雜交組合后代的試管薯形成相關性狀，結果表明不同組合的試管薯形成受親本遺傳基礎影響十分明顯。4個組合的初始匍匐莖形成時間差異不大；組合F 和D 的初始結薯時間最早，K次之，E最晚；組合D與F、F與E之間的單株結薯率和結薯數(shù)無明顯差異，但D顯著高于E且D、F、E均顯著高于組合K；組合D和E的單薯重顯著高于F 和K。結合4 個組合的遺傳背景（表1），即D、E 和F 具有相同的父本，F(xiàn) 和K 具有相同的母本，推測組合E 結薯較晚可能是受到其母本的遺傳，F(xiàn)、D 和E 3 個組合結薯能力較強（單株結薯率和結薯數(shù)均較高）可能是受到其共有的父本的遺傳，而F和K的試管薯膨大能力較弱，可能是受到其共有的母本的影響。試驗結果表明，盡管塊莖形成易受環(huán)境條件的影響，但從根本上來講，主要決定因素是其遺傳基礎[25]。此外，組合內不同基因型之間試管薯形成相關性狀的比較結果顯示，同一組合的不同基因型間的試管薯形成能力差異極大。組合F 的最早和最晚結薯時間相差達50 d；組合E 中單株結薯率最低為0，而最高達到100%；組合E 的最大單薯重（199.5 mg）是最小單薯重（19.6 mg）的10.2倍。組合內不同基因型之間的差異甚至大大超過了組合間的差異，但是其差異程度還是受其遺傳基礎影響。

3.2 結薯時間和單薯重的關系受到其遺傳背景的影響

試驗結果顯示，組合D 中檢測到25 個標記同時與初始結薯時間及單薯重顯著相關，其中13 個標記同時與早結薯以及單薯重更大相關、12 個標記同時與晚結薯以及單薯重更小相關，從遺傳學上證明這兩個表型在該群體中具有高度相關性。這一結果與前人的研究結果一致，即相較于結薯晚的晚熟品種，結薯更早的早熟品種形成的試管薯更大[15,16]，也有研究利用QTL 定位方法證明了平均單薯重與植株熟性之間確實存在相同的遺傳調控位點[26]。然而，在研究其他3 個組合中并沒有出現(xiàn)同樣的結果，組合E、F 和K 均沒有檢測到同時與結薯時間及單薯重相關的標記。組合F的結薯時間是4個組合中最早的，而其單薯重卻顯著低于組合D、E；組合E的結薯時間是最晚的，而其單薯重卻顯著高于結薯比他早的組合F、K，從而表明結薯時間與單薯重也可能分別受到完全不同的遺傳位點的調控。這一結果也在近期的報道中得到印證，即不管從表型的相關性（皮爾森相關系數(shù)r = 0.1～0.3），還是QTL 定位結果（分別位于不同的染色體上）來看，平均單薯重和植株熟性這兩個性狀都是相互獨立的[27]。基于此不難發(fā)現(xiàn)結薯時間與單薯重是否相關很大程度上取決于其遺傳基礎，這一結論解釋了“結薯早不一定產量高，而結薯晚也不一定產量低”的現(xiàn)象，為培育馬鈴薯新品種奠定了理論基礎。