姜子義，李 碧，蔡 瑤，顏久淇，龔雙燕，樊 毅，黃劍波，朱 玲,2，徐志文,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

豬偽狂犬病毒( Pseudorabiesvirus, PRV )屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，可感染多種動物，其中豬是最敏感、唯一的自然宿主，常呈流行性感染[1-3]。2012年以來，豬偽狂犬病毒變異株在華東、華中、東北、西南和華北地區(qū)呈爆發(fā)態(tài)勢[4]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟損失。PRV gE抗體陽性率從2012年的11.5%上升到了2014年的64.3%[5]，2015-2017年依然保持非常高的陽性率，通過分離毒株測序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)爆發(fā)地區(qū)都是新變異的野毒株感染。

免疫豬群再次發(fā)病，陰性豬場重新轉(zhuǎn)陽性是近年來豬偽狂犬病大流行的最主要特征[6]，豬偽狂犬病防控面臨著巨大的挑戰(zhàn)。上世紀末中國開始使用gE缺失的Bartha-K61(gE-)疫苗[7]，近年中國自主研發(fā)的基因缺失株SA215(gE-gI-TK-)使用相當廣泛，對經(jīng)典毒株有非常好的防控力[8]。很多研究者報道現(xiàn)有疫苗對近年來變異毒株侵染缺乏保護力，血清陰性重新轉(zhuǎn)陽性[8-9]，在綿羊攻毒保護模型中對新流行變異毒株侵染的保護不到50%[10]。在未有針對新變異毒株疫苗的情況下，快速區(qū)分野毒株和疫苗株成為目前防控豬偽狂犬病疫情的當務之急。

本研究旨在建立一種快速、穩(wěn)定和有效的多重PCR檢測方法，快速鑒別發(fā)病豬感染的變異野毒株和之前接種的疫苗種類，從而采取不同的緊急措施防控豬偽狂犬病疫情。

1 材料與方法

1.1 疫苗和病毒

PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)、豬圓環(huán)Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、T3256質(zhì)粒(TK基因缺失陽性對照質(zhì)粒)、PP63質(zhì)粒(gE基因缺失陽性對照質(zhì)粒)均由四川農(nóng)業(yè)大學動物生物技術(shù)中心保存提供。

1.2 細胞與試劑

Vero細胞購自武漢典型物保藏中心。HSTaqDNA聚合酶、dNTPs、2×GC Buffer Ⅱ、DL1000TMMaker均購置于大連寶成生物工程有限公司。

1.3 gE、gB和TK基因核苷酸序列分析

參照文獻[11]和[12]中的引物進行g(shù)E、gB及TK全基因擴增和測序。利用NCBI進行BLAST對比分析，發(fā)現(xiàn)PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分離株gE基因擴增核苷酸序列與國內(nèi)野毒株核苷酸序列的同源性在91.6%至98.8%之間，氨基酸序列同源性在92.1%至98.6%之間，與國內(nèi)2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性都超過了97.8%，與經(jīng)典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性在87.9%至96.8%之間。新分離株gB基因擴增核苷酸序列與國內(nèi)野毒株核苷酸序列的同源性在97.4%至100.0%之間，氨基酸序列同源性在96.6%至100.0%之間，與國內(nèi)2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性都超過了98.8%，與經(jīng)典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也達到98.2%以上。新分離株TK基因擴增核苷酸序列與國內(nèi)野毒株核苷酸序列同源性在98.2%至100.0%之間，氨基酸序列同源性在97.6%至100%之間，與國內(nèi)2012年后分離毒株之間核苷酸序列同源性高達99%，與經(jīng)典毒株Fa、Ea、MinA株核苷酸序列同源性也超過了98.4%。

PRV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS和PRV-YA新分離株的gE、gB和TK基因都高度保守。大量核苷酸序列對比結(jié)果顯示，2012以來新流行的PRV變異株之間具有共同的分子特征，即gE基因編碼的氨基酸序列第48位和第492位各插入了1個天冬氨酸，此變異處可作為判斷PRV是否為變異毒株的重要指標之一[13-14]。

1.4 引物設計

參照GenBank中已發(fā)布的序列及SA215、Bartha-K61疫苗株的PRVgE基因、gB基因以及TK基因的序列，分析對比，找出高度保守區(qū)段，應用Primier5和Oligo7.0軟件,優(yōu)化設計引物gE-F/gE-R、gB-F/gB-R、TK-F/TK-R(表1)，交上海生工生物工程有限公司合成。

表1引物序列

Table1Sequenceofprimers

基因引物名稱 堿基序列 (5'→3') 產(chǎn)物長度 (bp)gEgE-FCATGGTGCTGGGGC-CCACGATCGTC0(Bartha-K61株)、0(SA215株)、531(野毒株)gE-RCGTTGAGGTCGCCGTCGAGGT-CATgBgB-FCCGTCCTCCTTGAGCGYCTTC264(Bartha-K61株)、264(SA215株)、264(野毒株)gB-RCGGCATCGCCAACTTCTTCCTKTK-FCGCACACGCACTGCCGGAT710(Bartha-K61株)、432(SA215株)、710(野毒株)TK-RGCCTTCGCGACGCCGTACCTG

1.5 鑒別gE、gB、TK基因的多重PCR方法的建立

1.5.1 多重PCR反應的退火溫度(Tm)優(yōu)化 在單一基因PCR的基礎上，確定30 μl三重PCR優(yōu)化體系進行試驗，在退火溫度 60～75 ℃進行梯度試驗找出最適退火溫度。

1.5.2 多重PCR反應中多個引物濃度優(yōu)化 二重PCR反應中，固定一對引物濃度改變另一對引物加入量確定其使用量，然后以優(yōu)化的一對引物加入量不變，改變另一對引物加入量，一同確定2對引物的最適條件。三重PCR反應過程建立在二重PCR的基礎上，保持二重PCR引物用量不變確定第三對引物量，最終確定三重PCR最適引物濃度。

1.6 敏感性試驗

采用優(yōu)化后的PCR條件，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)分別選擇不同模板的量，1 μl 1.8×1011拷貝、1.8×1010拷貝、1.8×109拷貝、1.8×108拷貝、1.8×107拷貝、1.8×106拷貝、1.8×105拷貝進行PCR擴增。

1.7 特異性試驗

采用優(yōu)化后的反應條件和體系分別擴增PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)、PRV變異株(2014年分離的XJ株)、豬圓環(huán)Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)。同時用建立的多重PCR檢測方法對其他變異株P(guān)RV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經(jīng)典毒株P(guān)RV-Fa進行檢測。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后用溴化乙錠(EB)染色后在凝膠成像系統(tǒng)下成像、觀察。

1.8 重復性試驗

采用優(yōu)化后的反應條件和體系，將PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株(2014年分離的XJ株)連續(xù)擴增3次。擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后用溴化乙錠(EB)染色后在凝膠成像系統(tǒng)下成像、觀察。

1.9 臨床樣品檢測試驗

采用優(yōu)化后的反應條件和體系，對收集的76份豬偽狂犬病臨床樣品進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 多重PCR反應條件優(yōu)化

通過對多重PCR各種反應條件的試驗探索，確定gE、gB、TK基因多重PCR反應體系為：2×GC Buffer Ⅱ 15.00 μl、2.5 mmol/L dNTPs 0.75 μl、20 μmol/LgB上下游引物各0.60 μl、20 μmol/LTK上下游引物各0.75 μl、20 μmol/LgE上下游引物各0.75 μl，模板3.10 μl、HSTaq酶0.75 μl，去離子水補足到30.00 μl。退火溫度(Tm)優(yōu)化為66 ℃，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 40 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。

PRV野毒(2014年分離的XJ株)條帶為264 bp(gB基因)、531 bp(gE基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61條帶為264 bp(gB基因)、710 bp(TK基因)，PRV基因缺失疫苗株SA215條帶為264(gB基因)、432 bp(TK基因)(圖1)。

M：Marker DL1000；1：PRV基因缺失疫苗株SA215；2：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；3：PRV變異株(2014年分離的XJ株)。圖1 偽狂犬病毒野毒株和疫苗株的多重PCR鑒別Fig.1 Multiplex PCR identification of pseudorabies virus(PRV) vaccine strains and wild viruses

2.2 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的敏感性

采用優(yōu)化后的PCR反應條件和體系，用不同濃度模板量1 μl 1.8×1011拷貝、1.8×1010拷貝、1.8×109拷貝、1.8×108拷貝、1.8×107拷貝、1.8×106拷貝、1.8×105拷貝進行PCR擴增反應。結(jié)果表明模板量小于1 μl 1.8×106拷貝時沒有發(fā)現(xiàn)目標條帶。

2.3 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的特異性

用建立的豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法檢測豬常見疫病病原豬圓環(huán)Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)，以及豬偽狂犬病毒其他變異株P(guān)RV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經(jīng)典毒株P(guān)RV-Fa。結(jié)果(圖2)顯示，豬圓環(huán)Ⅱ型病毒(PCV-2)、細小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)均未出現(xiàn)特異性條帶，PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株P(guān)RV-XJ、PRV-JJ、PRV-MS、PRV-YA和經(jīng)典毒株P(guān)RV-Fa均有特異性目的條帶。

M：Marker DL1000；1：豬圓環(huán)Ⅱ型病毒(PCV-2)；2：細小病毒(PPV)；3：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)；4：豬瘟病毒(CSFV)；5：PRV基因缺失疫苗株SA215；6：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；7：PRV變異株(2014年分離的XJ株)；8：PRV經(jīng)典株(Fa株)；9：PRV變異株(YA株)；10：PRV變異株(MS株)；11：PRV變異株(JJ株)；12：PRV變異株(2014年分離的XJ株)；13：PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61；14：PRV基因缺失疫苗株SA215。圖2 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的特異性Fig.2 Specificity of the method for identification of swine pseudorabies virus by multiplex PCR

2.4 豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法的重復性

將PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)和PRV變異株(2014年分離的XJ株)連續(xù)檢測3次，結(jié)果完全一致，說明本方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2.5 臨床樣品檢測試驗結(jié)果

用建立的豬偽狂犬病毒多重PCR檢測方法，對收集的76份豬偽狂犬病臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示PRV野毒株、PRV基因缺失疫苗株(SA215、Bartha-K61)均可檢出，其中39份為PRV野毒株，16份為PRV基因缺失疫苗株SA215，21份為PRV基因缺失疫苗株Bartha-K61。檢測結(jié)果與樣品來源注射疫苗記錄、單一PCR檢測及測序結(jié)果一致。

3 討 論

2012年以來，全國超過20個省份先后報道發(fā)現(xiàn)PRV變異株[15]。疫情表現(xiàn)為大流行，不同地區(qū)PRV變異毒株的毒力水平和感染強度都有較大差異，變異株之間的親緣關(guān)系較近，變異株與國內(nèi)傳統(tǒng)毒株(Fa、Ea及Min-A等)親緣關(guān)系較遠[8,15-18]。但變異毒株的起源與傳統(tǒng)毒株相同，其中華東地區(qū)的感染率最高，分離的變異株毒力最強[19]。對新發(fā)現(xiàn)PRV變異毒株的研究結(jié)果表明，當前各地區(qū)流行的不同變異毒株在毒力增強的同時抗原也發(fā)生了一定程度的變異[17-18]。這也解釋了當前廣泛使用的基因缺失疫苗株SA215、Bartha-K61無法對變異豬偽狂犬病毒侵染提供完全免疫保護的原因[20-24]。

本試驗所建立的區(qū)分豬偽狂犬病毒野毒株與疫苗株的多重PCR檢測方法能夠可靠、快速、有效地鑒別野毒株和疫苗株，區(qū)分度大。研究中針對PRV的3個重要高度保守基因gE、gB和TK基因設計了3對特異性引物，通過PCR擴增條件的優(yōu)化，確定3對引物的最佳退火溫度為66 ℃。在單引物敏感性試驗的基礎上，通過優(yōu)化引物濃度，最后建立了多重PCR檢測方法。試驗結(jié)果表明，gE、gB、和TK基因的高度保守確保了擴增片段的正確性，避免了假陽性結(jié)果的發(fā)生，3個基因的目的條帶264 bp(gB)、432 bp(TK)、531 bp(gE)和710 bp(TK)區(qū)分度較高，通過電泳能夠直觀區(qū)分野毒株和疫苗株。敏感性試驗結(jié)果顯示，本研究的多重PCR檢測方法能夠檢測的最低濃度為1 μl 1.8×106拷貝，具有較高的靈敏度。用多重PCR方法對收集的76份臨床樣品進行檢測，檢測結(jié)果完全正確，與普通檢測方法一致，證明本方法切實有效。本研究所建立的多重PCR檢測方法可用于目前PRV疫情檢測，為控制豬偽狂犬病毒大流行、大爆發(fā)提供了一種可靠、快速、有效的檢測方法，對切實防控豬偽狂犬病具有十分重要的意義。