程璐 韓樹堂

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南京 210029

【提要】 胰腺腺泡細(xì)胞具有豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，適應(yīng)其合成消化酶的生理功能。各種損傷因素引起蛋白質(zhì)折疊需求與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力失衡，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的過度激活可能是觸發(fā)和加重急性胰腺炎胰腺損傷的重要應(yīng)激機(jī)制，涉及未折疊蛋白反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)的加重、腺泡細(xì)胞的凋亡、胰腺酶原顆粒自噬等多個(gè)方面。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)功能活躍的重要細(xì)胞器，其生理功能主要是合成膜蛋白和分泌蛋白，啟動(dòng)翻譯后修飾，保證蛋白質(zhì)折疊成正確的空間構(gòu)像，同時(shí)也參與脂質(zhì)和類固醇代謝。當(dāng)各種病因(如缺氧、Ca2+超載、氧化應(yīng)激等)打破內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊和修飾功能受損，大量未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蓄積，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS是一種涉及體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂之間的失衡狀態(tài)。新近的研究表明急性胰腺炎(AP)的發(fā)生、發(fā)展在細(xì)胞生物學(xué)水平與ERS密切相關(guān)，ERS的過度激活可能是觸發(fā)和加重胰腺損傷的重要應(yīng)激機(jī)制[1-3]。本文根據(jù)近期相關(guān)研究進(jìn)展，探討ERS在AP進(jìn)程中的作用。

一、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與未折疊蛋白反應(yīng)

胰腺腺泡細(xì)胞具有豐富內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以適應(yīng)其合成消化酶的生理功能。各種新合成的消化酶被運(yùn)送至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與伴侶分子免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP)，也稱葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(78-kD glucose-regulated protein，GRP78)結(jié)合。BiP/GRP78是一種主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子結(jié)合分子伴侶，借助其水解ATP的耗能過程促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊、進(jìn)行翻譯后修飾。各種損傷因素作用均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、運(yùn)輸障礙或攝取、釋放Ca2+障礙，從而引起蛋白質(zhì)折疊需求與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力失衡，導(dǎo)致蛋白質(zhì)不能正確折疊、糖基化形成障礙或蛋白質(zhì)不能形成正常的二硫鍵，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白堆積，引起ERS。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白增多時(shí)，應(yīng)激信號通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜傳遞到細(xì)胞核，繼而引起一系列特定的靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯水平下調(diào)，使細(xì)胞繼續(xù)存活，這種反應(yīng)稱為未折疊蛋白反應(yīng)[4](unfolded protein response，UPR)。

胰腺細(xì)胞發(fā)生ERS初期，UPR被激活，用以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)細(xì)胞生存[5]。UPR通過以下3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)：(1)蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase r-like ER kinase，PERK)；(2)肌醇需要酶1α(Inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α)；(3)活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)。UPR的關(guān)鍵因素是熱休克蛋白家族成員BiP/GRP78。在非ERS情況下， BiP/GRP78與3種跨膜蛋白結(jié)合，維持信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在未激活狀態(tài)[6]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)大量未折疊蛋白蓄積時(shí)，BiP/GRP78即與3種跨膜蛋白解離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白結(jié)合，使解離后的3種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白處于活化狀態(tài)，進(jìn)而啟動(dòng)UPR信號通路。

1．PERK途徑：PERK在胰腺中廣泛高表達(dá)，與GRP78/BIP解離后，PERK可通過胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域的自身二聚化和磷酸化而激活，促使下游的真核生物轉(zhuǎn)錄起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，進(jìn)而使翻譯起始mRNA迅速減少，減緩或暫停蛋白質(zhì)的合成，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對新合成蛋白折疊需求的壓力[7]。實(shí)驗(yàn)研究表明[8]，PERK缺失的小鼠可在4周大小時(shí)出現(xiàn)β細(xì)胞為主的胰腺功能不全，6～8周時(shí)以腺泡細(xì)胞為主。反之，eIF2α磷酸化的缺失增加了β細(xì)胞合成大量蛋白質(zhì)并促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊的需求，這同樣增加了胰島素原的折疊和錯(cuò)誤折疊，錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，加重了氧化應(yīng)激[9]。這些現(xiàn)象提示ERS反應(yīng)中PERK介導(dǎo)的eIF2α磷酸化阻止mRNA翻譯、減少折疊蛋白的負(fù)荷而防止錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集，從而使細(xì)胞得以存活。

2．ATF6途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)未折疊蛋白增多，使ATF6與BiP分離，ATF6轉(zhuǎn)移到高爾基體，被高爾基體S1P(site-1 protease)和S2P(site-2 protease)蛋白酶水解，釋放出N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生活化型ATF6入核，結(jié)合于啟動(dòng)子ERS反應(yīng)元件(ER stress response element，ERSE)，誘導(dǎo)X盒結(jié)合蛋白1(X-box-binding protein1，XBP1)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的正確折疊[10-11]。

3．IRE1途徑： ERS時(shí)，活化的IRE1α切割其底物XBP1前體mRNA，剪接后的mRNA發(fā)生翻譯框移，編碼產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子sXBP1。sXBP1誘導(dǎo)的目標(biāo)基因可以增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊能力，加速錯(cuò)誤折疊蛋白的降解[12-13]。

UPR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)高度復(fù)雜，ERS可以激活PERK/eIF2α、IRE1/XBP1和ATF6介導(dǎo)的通路阻斷翻譯的進(jìn)程，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白合成負(fù)擔(dān)，增加伴侶分子以及蛋白折疊相關(guān)分子的數(shù)量。此外，ERS能激活其相關(guān)的分子，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ER-assisted protein degradation，ERAD)基因，可以識別，通過泛素-蛋白酶體通路從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔清除錯(cuò)誤折疊的蛋白，并與非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)細(xì)胞通路相互作用，最后導(dǎo)致ERS的解除[14]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紊亂超過細(xì)胞的調(diào)節(jié)能力時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法得到恢復(fù)，ERS逐漸加重，將引起細(xì)胞損傷或凋亡。

二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與急性胰腺炎

1．ERS參與AP的早期階段：AP的發(fā)病機(jī)制尚未完全被闡明，病理性腺泡內(nèi)胰蛋白酶原活化被認(rèn)為是胰腺炎發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。胰腺腺泡細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量豐富，胰蛋白酶原合成于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在蛙皮素誘導(dǎo)的AP模型中，早期的ERS與胰蛋白酶原的活化有關(guān)[15]。

在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂情況下，胰腺細(xì)胞更容易受外界刺激影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)在胰腺炎時(shí)發(fā)生顯著改變。Bhatia等[16]報(bào)道，逆行注射?；悄懰徕c到胰管幾分鐘內(nèi)，腺泡細(xì)胞損傷以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡粒子的形成為特征，這一現(xiàn)象與ERS相關(guān)受體PERK、IRE1、ATF6及其下游通路的激活有關(guān)。隨后，多種類型的胰腺炎動(dòng)物模型研究中，包括注射?；悄懰徕c、L-精氨酸、高脂飲食、胰膽管結(jié)扎等造模方式，早期均觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)學(xué)的改變，主要表現(xiàn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部或廣泛擴(kuò)張、空泡形成以及核糖體的減少，表明在AP的早期階段即存在ERS[17-20]。

2．ERS與胰腺腺泡損傷：ERS與過度UPR參與胰腺腺泡細(xì)胞的損傷及炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AP發(fā)展。 Kubisch等[21]觀察到L -精氨酸誘導(dǎo)的AP大鼠在造模早期就出現(xiàn)了明顯的ERS，其標(biāo)志為PERK的磷酸化及其下游靶點(diǎn)eIF2α、ATF6移位進(jìn)入細(xì)胞核，以及BiP的上調(diào)。其隨后研究[17]也發(fā)現(xiàn)，UPR在AP發(fā)病中亦起到重要作用，包括分子伴侶BiP表達(dá)、PERK磷酸化、XBP1拼接以及CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)表達(dá)，且不同的促分泌素激活胰腺腺泡細(xì)胞中的ERS也不同，只有超生理水平的CCK8與抑制淀粉酶的分泌、胰蛋白酶活化刺激PERK磷酸化以及CHOP表達(dá)相關(guān)。此外，還觀察到AP病程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白及UPR關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子表達(dá)水平的改變，包括BiP、CHOP、PERK、eIF2、ATF6、Xbp1等，以期提高ERS細(xì)胞處理未折疊蛋白或抵御其他細(xì)胞應(yīng)激的能力。在蛙皮素和?；悄懰徕c誘導(dǎo)的胰腺炎模型中[22]，早期即出現(xiàn)了UPR關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子的表達(dá)上調(diào)，胰腺細(xì)胞中IRE1和BiP的激活發(fā)生在牛磺膽酸鈉給藥后3 h[23]。在精氨酸誘導(dǎo)的重癥急性胰腺炎(SAP)模型中，發(fā)現(xiàn)PERK、ATF6和IRE1及其下游信號均被激活[24]，亦提示ERS與胰腺炎腺泡細(xì)胞損傷密切相關(guān)。

3．ERS與AP炎癥反應(yīng)加重：ERS在多種疾病中通過核因子-kappaB(NF-κB)通路引起炎癥反應(yīng)，UPR通過PERK、IRE1和ATF6 3條信號通路激發(fā)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活NF-κB信號通路[25-26]。AP時(shí)，ERS通過NF-κB被激活，其中鈣離子和蛋白激酶C的病理學(xué)改變是涉及NF-κB激活的主要因素[27]。ERS引起NF-κB活化和胰腺腺泡細(xì)胞的壞死，炎癥反應(yīng)和腺泡細(xì)胞壞死的持續(xù)積累導(dǎo)致胰腺炎持續(xù)進(jìn)展加重[28-29]。使用NF-κB小分子抑制劑可以阻斷ERS，抑制胰腺炎的進(jìn)展[30]。此外，NF-κB 下游的炎性因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)亦會(huì)導(dǎo)致UPR的活化，表現(xiàn)為XBP1和GRP78的表達(dá)增加以及eIF2α的磷酸化[31]。同理，TNF-α、IL-1β和IL-6可引起細(xì)胞的ERS，導(dǎo)致cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白H的活化[32]。這種機(jī)制可能與炎癥遞質(zhì)干擾蛋白的正常折疊和線粒體的代謝平衡，進(jìn)而使鈣離子釋放的增加和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激聚集有關(guān)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)。

4．ERS與胰腺腺泡細(xì)胞凋亡：當(dāng)ERS過于強(qiáng)烈或持續(xù)存在時(shí)，UPR不足以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，引起細(xì)胞功能失調(diào)并觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，以清除有功能缺陷的應(yīng)激反應(yīng)細(xì)胞，維持整個(gè)生物體的穩(wěn)定。ERS通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡加重胰腺腺泡細(xì)胞的炎性損傷，從而加速了胰腺炎的病理過程[33]。

ERS啟動(dòng)胰腺細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括以下幾種：(1)C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)途徑；(2)凋亡信號調(diào)節(jié)激酶(apoptosis signal-regulating kinase, ASK)1/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase, JNK)途徑；(3)半胱天冬酶-12(caspase-12)途徑；(4)Ca2+通路途徑。其中CHOP途徑是ERS特異性轉(zhuǎn)錄因子[34-35]。UPR的3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均可引發(fā)CHOP的表達(dá)， PERK-eIF2α-ATF4是激活CHOP的主要途徑。高表達(dá)的CHOP能抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，引起B(yǎng)ax蛋白從細(xì)胞質(zhì)向線粒體移位，破壞Bax/Bcl-2比例，觸發(fā)線粒體凋亡途徑[36]。相反，CHOP基因缺陷小鼠Bcl/Bax比值增高，細(xì)胞凋亡明顯減輕[37]；激活的CHOP可以使磷酸化的eIF2α去磷酸化，引起蛋白質(zhì)合成增加，加重ERS。此外，CHOP還可以通過激活GADD34、激活氧化應(yīng)激和胞質(zhì)內(nèi)鈣超載誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38]。

5．ERS與胰腺酶原顆粒自噬：含有酶原顆粒的自噬空泡(自噬體或自噬溶酶體)在腺泡細(xì)胞內(nèi)大量堆積是AP發(fā)病早期的標(biāo)志性特征，與AP發(fā)生和發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)。生理性自噬是指胰腺腺泡細(xì)胞的酶原顆粒選擇性自噬，是胰腺的一種內(nèi)源性保護(hù)性機(jī)制，通過VMP1-USP9x-P62通路介導(dǎo)的泛素自噬途徑實(shí)現(xiàn)[39]。但AP時(shí)自噬空泡的數(shù)量和體積均顯著增大，彼此間互相融合，表明此時(shí)的自噬為一種功能障礙的缺陷性自噬，是AP反應(yīng)過度、異常激活自噬或自噬紊亂的結(jié)果。缺陷性自噬無法滿足腺泡細(xì)胞對損傷細(xì)胞器清除的要求，從而進(jìn)一步加重胰腺的病理損傷。

ERS是細(xì)胞自噬的誘發(fā)因素，其介導(dǎo)的細(xì)胞自噬主要依賴于UPR和Ca2+信號，連接ERS與自噬的UPR信號通路包括PERK-eIF2α、IRE1-TRAF2-JNK，可通過促進(jìn)自噬體分隔膜的延伸、自噬囊泡的聚集，上調(diào)自噬過程，平衡ERS誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹。Ca2+的持續(xù)升高主要通過鈣調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶-β(calmodulin-dependent kinase kinase-β, CaMKK-β)介導(dǎo)的AMPK活化，并最終通過激活TSC1/2復(fù)合物來抑制mTORC1的活性，從而促進(jìn)自噬[40-41]。

胰腺炎的發(fā)病機(jī)制與自噬小體的積累有關(guān)，乙醇誘導(dǎo)的胰腺炎通過激活ERS，作用于UPR的PERK/eIF2α分支，細(xì)胞自噬與ERS相互反應(yīng)，并與蛋白質(zhì)降解或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞相關(guān)[42-43]。IRE1-XBP1通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)對ERS起負(fù)反饋調(diào)節(jié)，以達(dá)到維持蛋白折疊和清除錯(cuò)誤折疊蛋白的作用。IRE1α與TRAF2相互反應(yīng)，激活JNK表達(dá)，引起ERS誘導(dǎo)的自噬，且XBP1已被證實(shí)是通過Beclin-1轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)自噬，PERK則通過ATF4觸發(fā)自噬[44]，可見ERS通過多種機(jī)制與自噬密切相關(guān)。

AP的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程中，胰腺腺泡細(xì)胞損傷是一個(gè)由多種因素介導(dǎo)的復(fù)雜的生物學(xué)過程，由于對其機(jī)制的認(rèn)識尚不完全充分和深入，針對該疾病預(yù)防和治療的有效策略仍然不足。ERS早期階段，一定程度上UPR可以激活細(xì)胞的保護(hù)性適應(yīng)，但持續(xù)嚴(yán)重存在的ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)無法恢復(fù)，則造成細(xì)胞功能惡化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡。深入研究參與胰腺腺泡細(xì)胞損傷進(jìn)展的啟動(dòng)和惡化因素，尤其是胰腺炎中ERS和UPR的根本的完整的機(jī)制是迫切需要的。嘗試從致病機(jī)制途徑尋找保護(hù)胰腺的有效方法，可能為AP的臨床治療開辟新的治療方法，具有重要的臨床指導(dǎo)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突