何婭玲

復旦大學生命科學學院，上海 200433

埃可病毒又稱人腸道致細胞病變孤兒病毒(enteric cytopathogenic human orphan virus，ECHO)，屬于小 RNA病毒科腸道病毒屬B組，最早由無菌性腦膜炎患兒糞便中分離獲得[1]。臨床研究顯示?？刹《靖腥究蓪е聼o菌性腦膜炎、嬰兒腹瀉等多種疾病,在世界各地人群中散發(fā)或流行[2]。對上海水質調查中發(fā)現(xiàn)EC30是一種常見的病原[3]。2014年，浙江寧波市郊區(qū)出現(xiàn)了由EC30引起的家族式腦膜炎爆發(fā)，造成了巨大的社會影響[4]。盡管該類病毒危害較大，但是尚無特效藥物用以治療，也未有預防性疫苗[5]。

腸道病毒屬的病毒成員龐雜，病毒顆粒均呈裸露無包膜的球形，直徑約24～30 nm，由衣殼和單正股RNA組成[6]。感染人類的可分為A～D 4類[7]，其中也包括手足口病的主要致病原，腸道病毒A類的人腸道病毒 71 型（human Enterovirus 71，EV71）等。 該研究借鑒EV71病毒培養(yǎng)純化經驗，使用RD細胞作為EC30生產細胞。在RD細胞中接種EC30并擴大培養(yǎng)，利用蔗糖密度梯度離心的方法分離、純化病毒。SDS變性蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的產物純度較高，隨后用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)目的產物為20～30 nm大小的球狀顆粒。這些均提示純化產物純度較高、具有完整的病毒顆粒結構。此外，該病毒顆粒蛋白可在優(yōu)化條件下成功生長成蛋白晶體，為后續(xù)的病毒結構功能研究和疫苗研發(fā)建立了堅實的基礎，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

RD細胞購自ATCC細胞庫；哺乳動物細胞培養(yǎng)基包括DMEM High Glucose培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗溶液購自HyClone公司；蛋白質濃度測定試劑盒購自BIO-RAD公司；病毒顆粒純化與濃縮、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等實驗相關試劑與材料購自AMERSCO、Millipore、國藥集團等公司；負染色電鏡樣品制備相關材料購自中鏡科儀；晶體培養(yǎng)條件篩選使用Hampton crystallization kits。

1.2 方法

以下實驗均在生物安全二級實驗室中進行。

1.2.1 病毒的擴增與純化 使用DMEM細胞完全培養(yǎng)基[包括 89%（v/v）DMEM High Glucose 培養(yǎng)液，10%（v/v）胎牛血清，1%（v/v）青鏈霉素雙抗]在T75細胞培養(yǎng)瓶及滾瓶中傳代培養(yǎng)RD細胞。細胞密度達到80%，EC30病毒以0.1（Pfu number/cell）的感染復數(shù)感染細胞。顯微鏡下觀察90%以上的細胞出現(xiàn)細胞脫落等病變效應時，收取病毒液，保存于-80℃冰箱中。

取-80℃凍存的EC30病毒液400 mL，反復凍融3次后。4℃4 000 rpm離心30 min，收集上清。依次加入50%PEG8000溶液至終濃度為10%、4 M NaCl至終濃度為200 mM、10%TritonX-100溶液至終濃度為1%。4℃攪拌過夜后，12 000 rpm 4℃離心1 h，用pH 7.4，10 mM Tris溶液重懸沉淀。同時配置10%～50%（W/V）的蔗糖（10mMtris溶液，pH 7.4）密度梯度，將重懸液體置于梯度上，Beckman SW28轉子27 000 rpm 4℃離心3 h，無剎車停止后，從上而下分層收集樣品，并進行還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測。選取含有病毒顆粒的蔗糖溶液組分，使用蛋白質超濾管進行濃縮，期間添加10 mM Tris（pH 7.4）緩沖液置換溶液。

1.2.2 病毒顆粒的濃度定量及形態(tài)學檢測 取上述病毒顆粒濃縮樣品，使用DC Protein Assay Kit進行蛋白質定量分析，濃度測定后，取少量樣品配制為濃度為0.5 mg/mL的溶液，將5 μL該溶液滴于銅網(wǎng)（74 μm鍍碳支持膜）上，1分鐘后使用濾紙吸去支持膜上殘余液體，使用5 μL醋酸雙氧鈾染色液對支持膜進行染色，染色時間為1 min，吸干殘余染液，紅外烘烤燈烘干銅網(wǎng)后，使用Tecnai F20場發(fā)射低溫冷凍透射電鏡對樣品進行電鏡觀察以確定病毒顆粒的純度，并拍攝照片。

1.2.3 晶體條件篩選 取濃縮后并測定濃度為2.5 mg/mL的病毒顆粒溶液,使用hampton晶體試劑盒進行結晶條件篩選，獲得EC30病毒的晶體。

2 結果

2.1 病毒顆粒的純化

RD細胞接種EC30病毒后擴增培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)液經過濾去除雜質后使用蔗糖梯度離心法分離各組分，按不同密度梯度收集各組分樣品，處理后經SDSPAGE膠電泳考馬斯亮藍染色結果如圖所示 （圖1）：BSA血清在較低濃度的蔗糖梯度中分布（1～14），空病毒殼由 VP0（36 kDa），VP1(32 kDa)和 VP3(26 kDa)組成（15～21），而成熟的病毒顆粒包括 VP1(32 kDa)，VP2(28 kDa)，VP3(26 kDa)和 VP4(8 kDa)（22～27）。 VP4 由于分子量小（8 kDa），在蛋白膠分離范圍外，因此成熟病毒顆粒僅見VP1、VP2、VP3這3個蛋白條帶。

圖1 SDS-PAGE電泳檢測蔗糖梯度分離EC30病毒。目的產物成熟病毒顆粒集中在22-27號管中

2.2 病毒顆粒形態(tài)觀察

選取收集含有成熟病毒顆粒的組分，使用蛋白質超濾管進行濃縮，期間添加10 mM Tris（pH 7.4）緩沖液置換溶液。最終獲得病毒顆粒蛋白濃度2.5 mg/mL。SDS-PAGE膠電泳考馬斯亮藍染色結果如圖所示 （圖2A），可見高純度病毒顆粒（virion）條帶，分子量與預期結果一致。目的產物用透射電鏡觀察（圖2B），發(fā)現(xiàn)大部分產物以30 nm左右直徑的球形顆粒的形式存在；未正確包裝的病毒顆粒所占比例極少，暗示該方法獲得病毒顆粒質量高且顆粒大小均一。

圖2 EC30成熟病毒顆粒純化的負染色電鏡結果

2.3 EC30結晶條件篩選

獲得高純度的埃可30型病毒后，使用Hampton試劑盒篩選優(yōu)化晶體生長條件。經對比研究后發(fā)現(xiàn)病毒蛋白在濃度為 2.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結晶條件下，得到如圖3所示高質量晶體。

圖3 EC30成熟病毒顆粒的晶體

3 討論

近年來，由?？刹《靖腥疽鸬挠變簾o菌性腦膜炎流行呈現(xiàn)散發(fā)趨勢。針對?？刹《?，9等致病性較強亞型的減活疫苗目前已進入研制中，但是針對?？刹《?0亞型尚缺乏相應的對癥治療方案。日前對EC30流行性病學研究較多，但是結構方面報道甚少，制約其疫苗和藥物的開發(fā)。因此，建立快速高效的EC30病毒顆粒蛋白生產純化系統(tǒng)對于疫苗學研究及病毒結構功能學研究均具有重大的意義。

該研究主要借鑒同屬腸道病毒科的人腸道病毒71型（EV71）病毒培養(yǎng)純化經驗，使用RD細胞作為EC30病毒的生產細胞，并結合使用蔗糖密度梯度離心法收集純化病毒顆粒并獲得成功。RD細胞是最為廣泛使用的病毒生產細胞之一，遺傳背景及生物學性質明確，應用于人疫苗生產安全性較高。同時使用蔗糖密度梯度離心法回收病毒顆粒，相比與氯化銫法，成本低廉且操作簡便，尤其適用于工業(yè)化大生產。同時，相較于傳統(tǒng)的分布鹽析法或其它蛋白沉淀法，使用蔗糖密度梯度法可以更好的保存病毒顆粒的完整型。通過透射電鏡成像檢測可見，絕大部分病毒顆粒結構完整均一，且非病毒顆粒結構雜質含量較少，顯示該方法不僅操作簡便，回收率高，而且可以更好的保持病毒顆粒潛在的生物學功能，在生產工藝上具有明顯優(yōu)勢。

該研究還基于純化病毒顆粒，使用Hampton晶體生長篩選系統(tǒng)，比較了不同蛋白濃度，不同緩沖液成分，鹽粒子濃度及溫度等環(huán)境因素對于EC30病毒顆粒蛋白形成蛋白晶體的影響，并最終確認EC30病毒顆粒可在病毒蛋白濃度為2.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結晶條件下形成蛋白晶體。已有文獻報道埃可7、11、12型病毒及病毒受體復合物的晶體結構[8]，通過對EC30病毒蛋白晶體的分析研究，并綜合其它已有的?？刹《揪w結構,可以明確地了解病毒顆粒裝配過程并發(fā)現(xiàn)潛在的干預機制，有助于進一步認識埃可病毒的感染機制及致病過程。

綜上所述，使用蔗糖密度梯度離心法能高效的分離純化EC30病毒，其蛋白晶體的獲得，再一次驗證了該方法獲得的病毒蛋白的純度及質量。該研究為后續(xù)EC30病毒結構功能學研究建立了良好的基礎，綜合分析已有的其他腸道病毒晶體結構，為抗病毒性腦膜炎的藥物設計以及腸道病毒的疫苗研制提供科學依據(jù)。