何婭玲

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433

埃可病毒又稱人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒(enteric cytopathogenic human orphan virus，ECHO)，屬于小 RNA病毒科腸道病毒屬B組，最早由無菌性腦膜炎患兒糞便中分離獲得[1]。臨床研究顯示埃可病毒感染可導(dǎo)致無菌性腦膜炎、嬰兒腹瀉等多種疾病,在世界各地人群中散發(fā)或流行[2]。對上海水質(zhì)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)EC30是一種常見的病原[3]。2014年，浙江寧波市郊區(qū)出現(xiàn)了由EC30引起的家族式腦膜炎爆發(fā)，造成了巨大的社會影響[4]。盡管該類病毒危害較大，但是尚無特效藥物用以治療，也未有預(yù)防性疫苗[5]。

腸道病毒屬的病毒成員龐雜，病毒顆粒均呈裸露無包膜的球形，直徑約24～30 nm，由衣殼和單正股RNA組成[6]。感染人類的可分為A～D 4類[7]，其中也包括手足口病的主要致病原，腸道病毒A類的人腸道病毒 71 型（human Enterovirus 71，EV71）等。 該研究借鑒EV71病毒培養(yǎng)純化經(jīng)驗(yàn)，使用RD細(xì)胞作為EC30生產(chǎn)細(xì)胞。在RD細(xì)胞中接種EC30并擴(kuò)大培養(yǎng)，利用蔗糖密度梯度離心的方法分離、純化病毒。SDS變性蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物純度較高，隨后用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物為20～30 nm大小的球狀顆粒。這些均提示純化產(chǎn)物純度較高、具有完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)。此外，該病毒顆粒蛋白可在優(yōu)化條件下成功生長成蛋白晶體，為后續(xù)的病毒結(jié)構(gòu)功能研究和疫苗研發(fā)建立了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

RD細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫；哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括DMEM High Glucose培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗溶液購自HyClone公司；蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自BIO-RAD公司；病毒顆粒純化與濃縮、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑與材料購自AMERSCO、Millipore、國藥集團(tuán)等公司；負(fù)染色電鏡樣品制備相關(guān)材料購自中鏡科儀；晶體培養(yǎng)條件篩選使用Hampton crystallization kits。

1.2 方法

以下實(shí)驗(yàn)均在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.2.1 病毒的擴(kuò)增與純化 使用DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基[包括 89%（v/v）DMEM High Glucose 培養(yǎng)液，10%（v/v）胎牛血清，1%（v/v）青鏈霉素雙抗]在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶及滾瓶中傳代培養(yǎng)RD細(xì)胞。細(xì)胞密度達(dá)到80%，EC30病毒以0.1（Pfu number/cell）的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞。顯微鏡下觀察90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞脫落等病變效應(yīng)時(shí)，收取病毒液，保存于-80℃冰箱中。

取-80℃凍存的EC30病毒液400 mL，反復(fù)凍融3次后。4℃4 000 rpm離心30 min，收集上清。依次加入50%PEG8000溶液至終濃度為10%、4 M NaCl至終濃度為200 mM、10%TritonX-100溶液至終濃度為1%。4℃攪拌過夜后，12 000 rpm 4℃離心1 h，用pH 7.4，10 mM Tris溶液重懸沉淀。同時(shí)配置10%～50%（W/V）的蔗糖（10mMtris溶液，pH 7.4）密度梯度，將重懸液體置于梯度上，Beckman SW28轉(zhuǎn)子27 000 rpm 4℃離心3 h，無剎車停止后，從上而下分層收集樣品，并進(jìn)行還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測。選取含有病毒顆粒的蔗糖溶液組分，使用蛋白質(zhì)超濾管進(jìn)行濃縮，期間添加10 mM Tris（pH 7.4）緩沖液置換溶液。

1.2.2 病毒顆粒的濃度定量及形態(tài)學(xué)檢測 取上述病毒顆粒濃縮樣品，使用DC Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析，濃度測定后，取少量樣品配制為濃度為0.5 mg/mL的溶液，將5 μL該溶液滴于銅網(wǎng)（74 μm鍍碳支持膜）上，1分鐘后使用濾紙吸去支持膜上殘余液體，使用5 μL醋酸雙氧鈾染色液對支持膜進(jìn)行染色，染色時(shí)間為1 min，吸干殘余染液，紅外烘烤燈烘干銅網(wǎng)后，使用Tecnai F20場發(fā)射低溫冷凍透射電鏡對樣品進(jìn)行電鏡觀察以確定病毒顆粒的純度，并拍攝照片。

1.2.3 晶體條件篩選 取濃縮后并測定濃度為2.5 mg/mL的病毒顆粒溶液,使用hampton晶體試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件篩選，獲得EC30病毒的晶體。

2 結(jié)果

2.1 病毒顆粒的純化

RD細(xì)胞接種EC30病毒后擴(kuò)增培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過濾去除雜質(zhì)后使用蔗糖梯度離心法分離各組分，按不同密度梯度收集各組分樣品，處理后經(jīng)SDSPAGE膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖所示 （圖1）：BSA血清在較低濃度的蔗糖梯度中分布（1～14），空病毒殼由 VP0（36 kDa），VP1(32 kDa)和 VP3(26 kDa)組成（15～21），而成熟的病毒顆粒包括 VP1(32 kDa)，VP2(28 kDa)，VP3(26 kDa)和 VP4(8 kDa)（22～27）。 VP4 由于分子量?。? kDa），在蛋白膠分離范圍外，因此成熟病毒顆粒僅見VP1、VP2、VP3這3個(gè)蛋白條帶。

圖1 SDS-PAGE電泳檢測蔗糖梯度分離EC30病毒。目的產(chǎn)物成熟病毒顆粒集中在22-27號管中

2.2 病毒顆粒形態(tài)觀察

選取收集含有成熟病毒顆粒的組分，使用蛋白質(zhì)超濾管進(jìn)行濃縮，期間添加10 mM Tris（pH 7.4）緩沖液置換溶液。最終獲得病毒顆粒蛋白濃度2.5 mg/mL。SDS-PAGE膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖所示 （圖2A），可見高純度病毒顆粒（virion）條帶，分子量與預(yù)期結(jié)果一致。目的產(chǎn)物用透射電鏡觀察（圖2B），發(fā)現(xiàn)大部分產(chǎn)物以30 nm左右直徑的球形顆粒的形式存在；未正確包裝的病毒顆粒所占比例極少，暗示該方法獲得病毒顆粒質(zhì)量高且顆粒大小均一。

圖2 EC30成熟病毒顆粒純化的負(fù)染色電鏡結(jié)果

2.3 EC30結(jié)晶條件篩選

獲得高純度的?？?0型病毒后，使用Hampton試劑盒篩選優(yōu)化晶體生長條件。經(jīng)對比研究后發(fā)現(xiàn)病毒蛋白在濃度為 2.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結(jié)晶條件下，得到如圖3所示高質(zhì)量晶體。

圖3 EC30成熟病毒顆粒的晶體

3 討論

近年來，由埃可病毒感染引起的幼兒無菌性腦膜炎流行呈現(xiàn)散發(fā)趨勢。針對?？刹《?，9等致病性較強(qiáng)亞型的減活疫苗目前已進(jìn)入研制中，但是針對?？刹《?0亞型尚缺乏相應(yīng)的對癥治療方案。日前對EC30流行性病學(xué)研究較多，但是結(jié)構(gòu)方面報(bào)道甚少，制約其疫苗和藥物的開發(fā)。因此，建立快速高效的EC30病毒顆粒蛋白生產(chǎn)純化系統(tǒng)對于疫苗學(xué)研究及病毒結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究均具有重大的意義。

該研究主要借鑒同屬腸道病毒科的人腸道病毒71型（EV71）病毒培養(yǎng)純化經(jīng)驗(yàn)，使用RD細(xì)胞作為EC30病毒的生產(chǎn)細(xì)胞，并結(jié)合使用蔗糖密度梯度離心法收集純化病毒顆粒并獲得成功。RD細(xì)胞是最為廣泛使用的病毒生產(chǎn)細(xì)胞之一，遺傳背景及生物學(xué)性質(zhì)明確，應(yīng)用于人疫苗生產(chǎn)安全性較高。同時(shí)使用蔗糖密度梯度離心法回收病毒顆粒，相比與氯化銫法，成本低廉且操作簡便，尤其適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。同時(shí)，相較于傳統(tǒng)的分布鹽析法或其它蛋白沉淀法，使用蔗糖密度梯度法可以更好的保存病毒顆粒的完整型。通過透射電鏡成像檢測可見，絕大部分病毒顆粒結(jié)構(gòu)完整均一，且非病毒顆粒結(jié)構(gòu)雜質(zhì)含量較少，顯示該方法不僅操作簡便，回收率高，而且可以更好的保持病毒顆粒潛在的生物學(xué)功能，在生產(chǎn)工藝上具有明顯優(yōu)勢。

該研究還基于純化病毒顆粒，使用Hampton晶體生長篩選系統(tǒng)，比較了不同蛋白濃度，不同緩沖液成分，鹽粒子濃度及溫度等環(huán)境因素對于EC30病毒顆粒蛋白形成蛋白晶體的影響，并最終確認(rèn)EC30病毒顆?？稍诓《镜鞍诐舛葹?.5 mg/mL，0.2 M Sodium chloride，0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6，30%v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結(jié)晶條件下形成蛋白晶體。已有文獻(xiàn)報(bào)道?？?、11、12型病毒及病毒受體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)[8]，通過對EC30病毒蛋白晶體的分析研究，并綜合其它已有的?？刹《揪w結(jié)構(gòu),可以明確地了解病毒顆粒裝配過程并發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)機(jī)制，有助于進(jìn)一步認(rèn)識埃可病毒的感染機(jī)制及致病過程。

綜上所述，使用蔗糖密度梯度離心法能高效的分離純化EC30病毒，其蛋白晶體的獲得，再一次驗(yàn)證了該方法獲得的病毒蛋白的純度及質(zhì)量。該研究為后續(xù)EC30病毒結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究建立了良好的基礎(chǔ)，綜合分析已有的其他腸道病毒晶體結(jié)構(gòu)，為抗病毒性腦膜炎的藥物設(shè)計(jì)以及腸道病毒的疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。