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        一種高效分離??刹《?0型病毒顆粒及其晶體培養(yǎng)方法的建立

        2018-11-13 02:21:26何婭玲
        中外醫(yī)療 2018年27期
        關(guān)鍵詞:密度梯度腸道病毒蔗糖

        何婭玲

        復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200433

        埃可病毒又稱人腸道致細(xì)胞病變孤兒病毒(enteric cytopathogenic human orphan virus,ECHO),屬于小 RNA病毒科腸道病毒屬B組,最早由無菌性腦膜炎患兒糞便中分離獲得[1]。臨床研究顯示埃可病毒感染可導(dǎo)致無菌性腦膜炎、嬰兒腹瀉等多種疾病,在世界各地人群中散發(fā)或流行[2]。對上海水質(zhì)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)EC30是一種常見的病原[3]。2014年,浙江寧波市郊區(qū)出現(xiàn)了由EC30引起的家族式腦膜炎爆發(fā),造成了巨大的社會影響[4]。盡管該類病毒危害較大,但是尚無特效藥物用以治療,也未有預(yù)防性疫苗[5]。

        腸道病毒屬的病毒成員龐雜,病毒顆粒均呈裸露無包膜的球形,直徑約24~30 nm,由衣殼和單正股RNA組成[6]。感染人類的可分為A~D 4類[7],其中也包括手足口病的主要致病原,腸道病毒A類的人腸道病毒 71 型(human Enterovirus 71,EV71)等。 該研究借鑒EV71病毒培養(yǎng)純化經(jīng)驗(yàn),使用RD細(xì)胞作為EC30生產(chǎn)細(xì)胞。在RD細(xì)胞中接種EC30并擴(kuò)大培養(yǎng),利用蔗糖密度梯度離心的方法分離、純化病毒。SDS變性蛋白電泳檢測發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物純度較高,隨后用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)物為20~30 nm大小的球狀顆粒。這些均提示純化產(chǎn)物純度較高、具有完整的病毒顆粒結(jié)構(gòu)。此外,該病毒顆粒蛋白可在優(yōu)化條件下成功生長成蛋白晶體,為后續(xù)的病毒結(jié)構(gòu)功能研究和疫苗研發(fā)建立了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),現(xiàn)報(bào)道如下。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        RD細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫;哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基包括DMEM High Glucose培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗溶液購自HyClone公司;蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自BIO-RAD公司;病毒顆粒純化與濃縮、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑與材料購自AMERSCO、Millipore、國藥集團(tuán)等公司;負(fù)染色電鏡樣品制備相關(guān)材料購自中鏡科儀;晶體培養(yǎng)條件篩選使用Hampton crystallization kits。

        1.2 方法

        以下實(shí)驗(yàn)均在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

        1.2.1 病毒的擴(kuò)增與純化 使用DMEM細(xì)胞完全培養(yǎng)基[包括 89%(v/v)DMEM High Glucose 培養(yǎng)液,10%(v/v)胎牛血清,1%(v/v)青鏈霉素雙抗]在T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶及滾瓶中傳代培養(yǎng)RD細(xì)胞。細(xì)胞密度達(dá)到80%,EC30病毒以0.1(Pfu number/cell)的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞。顯微鏡下觀察90%以上的細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞脫落等病變效應(yīng)時(shí),收取病毒液,保存于-80℃冰箱中。

        取-80℃凍存的EC30病毒液400 mL,反復(fù)凍融3次后。4℃4 000 rpm離心30 min,收集上清。依次加入50%PEG8000溶液至終濃度為10%、4 M NaCl至終濃度為200 mM、10%TritonX-100溶液至終濃度為1%。4℃攪拌過夜后,12 000 rpm 4℃離心1 h,用pH 7.4,10 mM Tris溶液重懸沉淀。同時(shí)配置10%~50%(W/V)的蔗糖(10mMtris溶液,pH 7.4)密度梯度,將重懸液體置于梯度上,Beckman SW28轉(zhuǎn)子27 000 rpm 4℃離心3 h,無剎車停止后,從上而下分層收集樣品,并進(jìn)行還原性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測。選取含有病毒顆粒的蔗糖溶液組分,使用蛋白質(zhì)超濾管進(jìn)行濃縮,期間添加10 mM Tris(pH 7.4)緩沖液置換溶液。

        1.2.2 病毒顆粒的濃度定量及形態(tài)學(xué)檢測 取上述病毒顆粒濃縮樣品,使用DC Protein Assay Kit進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析,濃度測定后,取少量樣品配制為濃度為0.5 mg/mL的溶液,將5 μL該溶液滴于銅網(wǎng)(74 μm鍍碳支持膜)上,1分鐘后使用濾紙吸去支持膜上殘余液體,使用5 μL醋酸雙氧鈾染色液對支持膜進(jìn)行染色,染色時(shí)間為1 min,吸干殘余染液,紅外烘烤燈烘干銅網(wǎng)后,使用Tecnai F20場發(fā)射低溫冷凍透射電鏡對樣品進(jìn)行電鏡觀察以確定病毒顆粒的純度,并拍攝照片。

        1.2.3 晶體條件篩選 取濃縮后并測定濃度為2.5 mg/mL的病毒顆粒溶液,使用hampton晶體試劑盒進(jìn)行結(jié)晶條件篩選,獲得EC30病毒的晶體。

        2 結(jié)果

        2.1 病毒顆粒的純化

        RD細(xì)胞接種EC30病毒后擴(kuò)增培養(yǎng),收集細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)過濾去除雜質(zhì)后使用蔗糖梯度離心法分離各組分,按不同密度梯度收集各組分樣品,處理后經(jīng)SDSPAGE膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖所示 (圖1):BSA血清在較低濃度的蔗糖梯度中分布(1~14),空病毒殼由 VP0(36 kDa),VP1(32 kDa)和 VP3(26 kDa)組成(15~21),而成熟的病毒顆粒包括 VP1(32 kDa),VP2(28 kDa),VP3(26 kDa)和 VP4(8 kDa)(22~27)。 VP4 由于分子量?。? kDa),在蛋白膠分離范圍外,因此成熟病毒顆粒僅見VP1、VP2、VP3這3個(gè)蛋白條帶。

        圖1 SDS-PAGE電泳檢測蔗糖梯度分離EC30病毒。目的產(chǎn)物成熟病毒顆粒集中在22-27號管中

        2.2 病毒顆粒形態(tài)觀察

        選取收集含有成熟病毒顆粒的組分,使用蛋白質(zhì)超濾管進(jìn)行濃縮,期間添加10 mM Tris(pH 7.4)緩沖液置換溶液。最終獲得病毒顆粒蛋白濃度2.5 mg/mL。SDS-PAGE膠電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果如圖所示 (圖2A),可見高純度病毒顆粒(virion)條帶,分子量與預(yù)期結(jié)果一致。目的產(chǎn)物用透射電鏡觀察(圖2B),發(fā)現(xiàn)大部分產(chǎn)物以30 nm左右直徑的球形顆粒的形式存在;未正確包裝的病毒顆粒所占比例極少,暗示該方法獲得病毒顆粒質(zhì)量高且顆粒大小均一。

        圖2 EC30成熟病毒顆粒純化的負(fù)染色電鏡結(jié)果

        2.3 EC30結(jié)晶條件篩選

        獲得高純度的???0型病毒后,使用Hampton試劑盒篩選優(yōu)化晶體生長條件。經(jīng)對比研究后發(fā)現(xiàn)病毒蛋白在濃度為 2.5 mg/mL,0.2 M Sodium chloride,0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6,30%v/v (+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結(jié)晶條件下,得到如圖3所示高質(zhì)量晶體。

        圖3 EC30成熟病毒顆粒的晶體

        3 討論

        近年來,由埃可病毒感染引起的幼兒無菌性腦膜炎流行呈現(xiàn)散發(fā)趨勢。針對??刹《?,9等致病性較強(qiáng)亞型的減活疫苗目前已進(jìn)入研制中,但是針對??刹《?0亞型尚缺乏相應(yīng)的對癥治療方案。日前對EC30流行性病學(xué)研究較多,但是結(jié)構(gòu)方面報(bào)道甚少,制約其疫苗和藥物的開發(fā)。因此,建立快速高效的EC30病毒顆粒蛋白生產(chǎn)純化系統(tǒng)對于疫苗學(xué)研究及病毒結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究均具有重大的意義。

        該研究主要借鑒同屬腸道病毒科的人腸道病毒71型(EV71)病毒培養(yǎng)純化經(jīng)驗(yàn),使用RD細(xì)胞作為EC30病毒的生產(chǎn)細(xì)胞,并結(jié)合使用蔗糖密度梯度離心法收集純化病毒顆粒并獲得成功。RD細(xì)胞是最為廣泛使用的病毒生產(chǎn)細(xì)胞之一,遺傳背景及生物學(xué)性質(zhì)明確,應(yīng)用于人疫苗生產(chǎn)安全性較高。同時(shí)使用蔗糖密度梯度離心法回收病毒顆粒,相比與氯化銫法,成本低廉且操作簡便,尤其適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。同時(shí),相較于傳統(tǒng)的分布鹽析法或其它蛋白沉淀法,使用蔗糖密度梯度法可以更好的保存病毒顆粒的完整型。通過透射電鏡成像檢測可見,絕大部分病毒顆粒結(jié)構(gòu)完整均一,且非病毒顆粒結(jié)構(gòu)雜質(zhì)含量較少,顯示該方法不僅操作簡便,回收率高,而且可以更好的保持病毒顆粒潛在的生物學(xué)功能,在生產(chǎn)工藝上具有明顯優(yōu)勢。

        該研究還基于純化病毒顆粒,使用Hampton晶體生長篩選系統(tǒng),比較了不同蛋白濃度,不同緩沖液成分,鹽粒子濃度及溫度等環(huán)境因素對于EC30病毒顆粒蛋白形成蛋白晶體的影響,并最終確認(rèn)EC30病毒顆??稍诓《镜鞍诐舛葹?.5 mg/mL,0.2 M Sodium chloride,0.1 M Sodium acetate trihydrate pH 4.6,30%v/v(+/-)-2-Methyl-2,4-pentanediol的結(jié)晶條件下形成蛋白晶體。已有文獻(xiàn)報(bào)道???、11、12型病毒及病毒受體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)[8],通過對EC30病毒蛋白晶體的分析研究,并綜合其它已有的??刹《揪w結(jié)構(gòu),可以明確地了解病毒顆粒裝配過程并發(fā)現(xiàn)潛在的干預(yù)機(jī)制,有助于進(jìn)一步認(rèn)識埃可病毒的感染機(jī)制及致病過程。

        綜上所述,使用蔗糖密度梯度離心法能高效的分離純化EC30病毒,其蛋白晶體的獲得,再一次驗(yàn)證了該方法獲得的病毒蛋白的純度及質(zhì)量。該研究為后續(xù)EC30病毒結(jié)構(gòu)功能學(xué)研究建立了良好的基礎(chǔ),綜合分析已有的其他腸道病毒晶體結(jié)構(gòu),為抗病毒性腦膜炎的藥物設(shè)計(jì)以及腸道病毒的疫苗研制提供科學(xué)依據(jù)。

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