李冬潔

摘 要：隨著PCR技術(shù)的研究進(jìn)展，其在許多領(lǐng)域都有了廣泛的應(yīng)用。介紹了PCR技術(shù)的基本原理和分類(lèi)，并分別從植物病原物檢測(cè)、內(nèi)參基因篩選、轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)和抗病基因檢測(cè)等方面，綜述了PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用概況和發(fā)展前景。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù)；植物生物學(xué)；應(yīng)用

1 PCR技術(shù)的原理和分類(lèi)

1.1 PCR技術(shù)的原理

PCR是聚合酶鏈反應(yīng)的縮寫(xiě)，是一種在生物體細(xì)胞外將待檢DNA序列在酶促作用下進(jìn)行擴(kuò)增的方法。PCR的技術(shù)過(guò)程主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸3個(gè)反復(fù)循環(huán)的步驟構(gòu)成，并在特異耐熱酶——Taq DNA聚合酶的催化下完成。其基本原理是用寡聚核苷酸引物結(jié)合在模板DNA分子上進(jìn)行特異核苷酸序列擴(kuò)增[1]。

1.2 PCR技術(shù)的分類(lèi)

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

1995年，美國(guó)PE 公司研制成功了實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-PCR）技術(shù)，應(yīng)用到分子生物學(xué)、植物生物學(xué)及其他研究領(lǐng)域。該技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，將核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)等技術(shù)融合在一起的，具有實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，是PCR技術(shù)研究史上從定性到定量的飛躍[2，3]。

1.2.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是指在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，與PCR體系內(nèi)的多個(gè)模板反應(yīng)，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)DNA分子的技術(shù)。因具有高效快捷、試驗(yàn)成本低、進(jìn)程快等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但在植物生物學(xué)研究方面的應(yīng)用還相對(duì)較少[4]。

1.2.3 單分子PCR技術(shù)

單分子PCR技術(shù)是以少量或單個(gè)DNA分子為模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)。該技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，其基本循環(huán)過(guò)程相同，但在反應(yīng)條件、模板數(shù)量、DNA聚合酶選擇、引物設(shè)計(jì)方面具有不同點(diǎn)。

2 PCR技術(shù)在植物生物學(xué)中的應(yīng)用

2.1 PCR技術(shù)在植物病原物檢測(cè)中的應(yīng)用

病原物在分離鑒定上是非常困難的，特別是專(zhuān)性寄生菌難以人工離體培養(yǎng)，而且病原物毒性類(lèi)型鑒定費(fèi)時(shí)且毒性表達(dá)受環(huán)境條件的影響很大。與傳統(tǒng)方法相比，PCR快速檢測(cè)病原微生物的優(yōu)點(diǎn)在于PCR技術(shù)檢測(cè)、鑒定病原的機(jī)理是選擇某一特定的引物擴(kuò)增到相應(yīng)DNA片段上。大多數(shù)病毒的基因組是單鏈環(huán)狀DNA，需先將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以此為模板進(jìn)行擴(kuò)增。該技術(shù)是目前檢測(cè)植物RNA 病毒的重要手段之一。

2.2 PCR技術(shù)在植物內(nèi)參基因篩選中的應(yīng)用

內(nèi)參基因指在各組織和細(xì)胞中表達(dá)相對(duì)恒定、在檢測(cè)基因的表達(dá)水平變化時(shí)常用作參照物的已知基因。其作用是校正試驗(yàn)過(guò)程中存在的試驗(yàn)誤差，保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。內(nèi)參基因通常是各種看家基因，在細(xì)胞內(nèi)組成穩(wěn)定性表達(dá)，有助于保持細(xì)胞的功能。然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)：常用的內(nèi)參基因在不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織、不同試驗(yàn)條件情況下，它們的表達(dá)量通常變異較大。所以，利用RT-PCR技術(shù)可以根據(jù)不同試驗(yàn)需要，尋找適合各自試驗(yàn)體系的特異性穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，以盡量去除試驗(yàn)中的不穩(wěn)定因素。

2.3 PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著轉(zhuǎn)基因作物面積的持續(xù)增加，在解決人類(lèi)溫飽問(wèn)題的同時(shí)也帶來(lái)了新的問(wèn)題，如轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人類(lèi)的健康問(wèn)題。當(dāng)前人們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品越來(lái)越重視，這就需要加強(qiáng)定量以及定性進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)技術(shù)。根據(jù)PCR 技術(shù)的定量原理，可以實(shí)現(xiàn)不需要進(jìn)行電泳就能快速、高效地得到樣品中轉(zhuǎn)基因成分的準(zhǔn)確含量。目前，RT-PCR技術(shù)不僅在致病菌中得以使用，在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物如轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因大豆的定量研究中也正發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

2.4 PCR技術(shù)在植物抗病基因檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來(lái)，人們對(duì)植物抗性基因的檢測(cè)已經(jīng)成為熱點(diǎn)問(wèn)題，傳統(tǒng)的Northern blot（諾瑟雜交）和常規(guī)PCR方法很難準(zhǔn)確和快速分析出該基因的表達(dá)量差異，而RT-PCR技術(shù)能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地分析出植物在不同處理?xiàng)l件下該基因的表達(dá)量差異。此外，利用多重PCR技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)2種以上抗病基因。2008年，研究者通過(guò)利用多重PCR技術(shù)在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)選擇Pi9（t）基因和Xa21基因的方法，得到了與分別的單一PCR檢測(cè)完全一致的結(jié)果，提高了PCR的選擇效率。

3 PCR技術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用前景

利用新的PCR技術(shù)研究植物，是植物生物學(xué)研究的重要發(fā)展階段。這些新技術(shù)的獨(dú)特特點(diǎn)，為深入研究提

供了方便。目前，RT-PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物育種、植物病理檢疫、環(huán)境對(duì)植物基因表達(dá)的影響等方面。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合其他技術(shù)，PCR技術(shù)將會(huì)在許多領(lǐng)域有所發(fā)展，這將有力地推動(dòng)植物抗病性的利用以及新型化學(xué)農(nóng)藥開(kāi)發(fā)等研究工作的進(jìn)一步發(fā)展，為提高農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)效益打下良好基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] 金宇良.PCR技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（10）：47-48.

[ 2 ] 崔穎，王秀娟，高山，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在植物中的

應(yīng)用[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（13）：3 073-3 077.

[ 3 ] 馬穎穎.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在糧油轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的應(yīng)

用[J].信息記錄材料，2018，19（03）：62-63.

[ 4 ] 任素賢，艾鵬飛，宋層孝，等.多重PCR技

術(shù)在植物生物學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J].

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（06）：93-95，106.

（收稿日期：2018-07-17）